可結(jié)合并中和b型流感病毒的人類結(jié)合分子及其用途【專利摘要】本發(fā)明涉及結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素且具有抗此類流感病毒的寬泛中和活性的結(jié)合分子，例如人類單克隆抗體。這些結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒的血球凝集素。本發(fā)明進一步提供編碼這些結(jié)合分子的核酸分子及包含這些結(jié)合分子的組合物。這些結(jié)合分子可用于診斷、預防和/或治療B型流感病毒?！緦＠f明】可結(jié)合并中和B型流感病毒的人類結(jié)合分子及其用途【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥。本發(fā)明特別涉及能夠結(jié)合并中和B型流感病毒的人類結(jié)合分子，例如單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，特別是結(jié)合并中和來自B/Yamagata譜系和/或B/Victoria譜系二者的B型流感病毒的中和性結(jié)合分子。另外，本發(fā)明涉及由B型流感病毒引起的感染、特別是由來自B/Yamagata譜系及B/Victoria譜系二者的B型流感病毒引起的感染的診斷、預防和/或治療。_2]發(fā)明背景[0003]流感感染(還稱作“influenza”或“flu”)是人類已知造成全世界每年3百萬與5百萬之間個嚴重患病病例及250，000與500，000之間個死亡的最常見疾病之一。流感在季節(jié)性流行中快速擴散，影響5%-15%群體，且衛(wèi)生保健費用負擔及生產(chǎn)力喪失較為廣泛(世界衛(wèi)生組織(WHO))。造成人類及動物傳染性病狀的流感病毒有3種類型(A型、B型及C型)。當前，A型及B型病毒是造成在人類中觀察到的流感流行及大范圍流行的因素。[0004]應(yīng)對每年流感流行的現(xiàn)行方式包括每年接種疫苗，優(yōu)選產(chǎn)生異型交叉保護。然而，人類中的流傳流感病毒經(jīng)受永久性抗原變化，此需要每年調(diào)適流感疫苗配制物以確保流感疫苗株與流傳流感株之間的最近可能匹配?？商娲?，諸如奧司他韋(oseltamivir，克流感?(Tamiflu?))等抗病毒藥可有效預防及治療流感感染。然而，顯示抗諸如奧司他韋等抗病毒藥抗性的流感病毒株數(shù)日益增加。[0005]替代方式是研發(fā)基于抗體的預防或治療手段來中和各種季節(jié)性流感病毒。[0006]最近已披露識別系統(tǒng)發(fā)生組I的A型流感病毒(例如包含Hl或H5亞型的HA的流感病毒)的HA保守主干區(qū)中的表位的寬泛交叉中和性抗體(例如CR6261，參見WO2008/028946)，以及識別系統(tǒng)發(fā)生組2的A型流感病毒(例如包含H3和/或H7亞型的HA的流感病毒)的HA主干區(qū)中的高度保守表位的交叉中和性抗體(例如CR8020、CR8043;參見TO2010/130636)。最近，發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合及中和系統(tǒng)發(fā)生組I及系統(tǒng)發(fā)生組2二者的A型流感病毒以及B型流感病毒的抗體(例如CR9114，闡述于申請案第EPl1173953.8號中)。[0007]迄今為止，人們較少關(guān)注B型流感病毒。此可歸因于以下事實，主要局限于人類作為宿主，B型流感病毒缺乏對于出現(xiàn)大范圍流行性A型流感株至關(guān)重要的大型動物儲體(reservoir)。然而，每年在大范圍流行的間期期間流行的累積影響超過大范圍流行且盡管可歸因于B型流感的發(fā)病率及死亡率低于(例如)H3N2病毒，但其高于HlNl病毒(Thompson(2003),Thompson(2004)。[0008]B型流感病毒的演化特征在于抗原及遺傳不同譜系共流傳持續(xù)延長時段。由原型病毒B/Victoria/2/87(Victoria譜系)及B/Yamagata/16/88(Yamagata譜系)代表的兩種譜系在當前較為著名(Kanegae(1990)，Rota(1990))。直至出現(xiàn)B/Victoria譜系病毒的1980年代，B/Yamagata是主要流傳譜系。自當時開始，兩種B型流感譜系的漂變變體已在全球共流傳，其中兩種譜系于最近流感季節(jié)同時流傳。[0009]考慮到B型流感病毒是每2-4年季節(jié)性流感流行的主要原因的事實且鑒于由某些B型流感病毒引起的呼吸道疾病的嚴重程度，以及季節(jié)性流行的高度經(jīng)濟影響，本領(lǐng)域不斷需要用于預防及治療B型流感亞型的替代且有效的手段。因此需要能夠交叉中和B型流感病毒的結(jié)合分子，優(yōu)選為寬泛中和性人類結(jié)合分子。[0010]發(fā)明概沭[0011]本發(fā)明提供能夠特異性結(jié)合及中和來自B/Yamagata譜系及B/Victoria譜系二者的B型流感病毒株的結(jié)合分子，特別是人類結(jié)合分子。這些結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型。[0012]本發(fā)明還涉及包含結(jié)合分子的免疫偶聯(lián)物和/或藥物組合物，以及至少編碼人類結(jié)合分子的結(jié)合區(qū)的核酸分子。[0013]本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫偶聯(lián)物和/或核酸分子適于用作B型流感病毒的通用預防劑、診斷劑和/或治療劑，而不考慮成因性B型流感病毒的亞型。【專利附圖】【附圖說明】[0014]凰！是基于競爭實驗的示意性表位定位圖。本發(fā)明中鑒別的抗B型流感抗體基于與B型流感HA的結(jié)合/競爭分成4組。[0015]Si顯示免疫熒光進入分析的結(jié)果，該分析經(jīng)設(shè)計用于分析結(jié)合分子阻斷流感病毒結(jié)合受體及內(nèi)在化的能力。A.通過免疫熒光讀數(shù)測定對病毒進入的抑制；B.B/Florida/04/2006對MDCK細胞的感染。[0016]Ml顯示本發(fā)明結(jié)合分子對病毒釋出的抑制。[0017]圖4顯示B型流感感染細胞的掃描EM結(jié)果。[0018]M5顯示CR8033對小鼠的免受致命性B型流感感染(B/Florida/04/2006及B/Malaysia/2506/2004)影響的體內(nèi)保護。[0019]發(fā)明說明[0020]下文給出本發(fā)明中所用術(shù)語的定義。[0021]本文所用術(shù)語“包括(included或including)”視為后面為詞語“不限于”。[0022]本文所用術(shù)語“結(jié)合分子”是指完整免疫球蛋白，包括單克隆抗體，例如嵌合、人源化或人類單克隆抗體；或是指與完整免疫球蛋白競爭特異性結(jié)合免疫球蛋白的結(jié)合配偶體(例如HA)的包含抗原結(jié)合域和/或可變域的免疫球蛋白片段。不論結(jié)構(gòu)如何，抗原結(jié)合片段皆與由完整免疫球蛋白識別的相同抗原結(jié)合?？乖Y(jié)合片段可包含肽或多肽，該肽或多肽包含結(jié)合分子氨基酸序列的至少2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個或250個鄰接氨基酸殘基的氨基酸序列。[0023]本文所用術(shù)語“結(jié)合分子”包括本領(lǐng)域中已知所有免疫球蛋白類別及亞類。取決于重鏈恒定域的氨基酸序列，可將結(jié)合分子劃分成五個主要類別的完整抗體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將其中若干進一步劃分成亞類(同種型)，例如，IgAUIgA2、IgGUIgG2、IgG3及IgG4。[0024]抗原結(jié)合片段尤其包括Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、至少含有足以賦予(多)肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白片段的(多)肽等。上述片段可以按合成方式或通過酶促或化學裂解完整免疫球蛋白來產(chǎn)生或可通過重組DNA技術(shù)進行遺傳改造。產(chǎn)生方法為本領(lǐng)域中所熟知且闡述于(例如)Antibodies:ALaboratoryManual,編輯:E.Harlow及D,Lane(1988),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork中，其以引用方式并入本文中。結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可具有一個或多個結(jié)合位點。若存在一個以上結(jié)合位點，則結(jié)合位點可彼此相同或可不同。[0025]結(jié)合分子可為裸或未偶聯(lián)結(jié)合分子且還可為免疫偶聯(lián)物的一部分。裸或未偶聯(lián)結(jié)合分子意指不與效應(yīng)部分或標簽(尤其例如毒性物質(zhì)、放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體、酶)偶聯(lián)、可操作地連接或以其他方式物理或功能締合的結(jié)合分子。應(yīng)理解，裸或未偶聯(lián)結(jié)合分子并不排除除通過附著效應(yīng)部分或標簽以外經(jīng)穩(wěn)定、多聚體化、人源化或以任何其他方式操縱的結(jié)合分子。因此，一同包括所有經(jīng)翻譯后修飾的裸及未偶聯(lián)結(jié)合分子，包括由產(chǎn)生重組結(jié)合分子的細胞在產(chǎn)生天然結(jié)合分子的細胞環(huán)境中進行且在制備初始結(jié)合分子后由人工引入修飾的情形。當然，術(shù)語裸或未偶聯(lián)結(jié)合分子并不排除結(jié)合分子在給予機體后與效應(yīng)細胞和/或分子形成功能締合的能力，因為需要此類相互作用中的一些以施加生物學效應(yīng)。因此，缺乏相關(guān)效應(yīng)基團或標簽在定義上應(yīng)用于體外(非體內(nèi))裸或未偶聯(lián)結(jié)合分子。[0026]本發(fā)明所用術(shù)語“生物試樣”涵蓋多種試樣類型，包括生物來源的血液及其他液體試樣、固體組織試樣(例如生檢樣品)或組織培養(yǎng)物或源自其的細胞及其子代。該術(shù)語還包括已在獲得后以任何方式操縱的試樣，該方式是例如通過用試劑處理、溶解或富集某些組分(例如蛋白質(zhì)或多核苷酸)。該術(shù)語涵蓋自任何物種獲得的各種臨床試樣，且還包括培養(yǎng)中的細胞、細胞上清液及細胞溶解物。[0027]本文所用術(shù)語“互補決定區(qū)”(CDR)意指結(jié)合分子(例如免疫球蛋白)的可變區(qū)內(nèi)的序列，這些序列通常較大程度地促成在形狀及電荷分布上與抗原上識別的表位互補的抗原結(jié)合位點。CDR區(qū)可對蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的線性表位、不連續(xù)表位或構(gòu)象表位具有特異性，這些表位以其天然構(gòu)象存在于蛋白質(zhì)上，或在一些情形下以通過(例如)在SDS中溶解而變性的形式存在于蛋白質(zhì)上。表位還可由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾形式組成。[0028]本文所用術(shù)語“缺失”表示與參考(通常為天然)分子相比分別不存在一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的氨基酸或核苷酸序列變化。[0029]本文所用術(shù)語“調(diào)控表達的核酸序列”是指特定宿主有機體中可操作地連接的編碼序列的表達所必需和/或影響該表達的多核苷酸序列。調(diào)控表達的核酸序列，尤其例如適當?shù)霓D(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列；阻抑物序列或活化物序列；有效RNA處理信號，例如剪接及多腺苷酸化信號；穩(wěn)定細胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如，核糖體結(jié)合位點)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；及在期望時增強蛋白質(zhì)分泌的序列，可為在所選宿主有機體中顯示活性的任何核酸序列且可源自與宿主有機體同源或異源的編碼蛋白質(zhì)的基因。調(diào)控表達的序列的鑒別及使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。[0030]本文所用術(shù)語“功能變體”是指包含與參照核酸分子或結(jié)合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比改變一個或多個核苷酸和/或氨基酸的核苷酸和/或氨基酸序列的核酸分子或結(jié)合分子。本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體與參照結(jié)合分子相比能夠競爭與結(jié)合配偶體(即流感病毒)結(jié)合。換言之，參照結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列的修飾并不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或含有該氨基酸序列的結(jié)合分子的結(jié)合特性，即結(jié)合分子仍能夠識別及結(jié)合其靶標。功能變體可具有保守序列修飾，包括核苷酸及氨基酸取代、添加及缺失。這些修飾可通過本領(lǐng)域中已知標準技術(shù)(例如定點誘變及隨機PCR介導的誘變)引入，且可包含天然以及非天然核苷酸及氨基酸。[0031]保守氨基酸取代包括用具有類似結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)的氨基酸殘基替代氨基酸殘基者。本領(lǐng)域中已定義具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β具支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明了，還可采用除上文所用者之外的其他氨基酸殘基家族分類。此外，變體可具有非保守氨基酸取代，例如，用具有不同結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)的氨基酸殘基替代氨基酸。類似微小變化形式還可包括氨基酸缺失或插入或二者?？墒褂帽绢I(lǐng)域中熟知的計算機程序發(fā)現(xiàn)確定可經(jīng)取代、插入或缺失的氨基酸殘基而不消除免疫活性的指導。[0032]核苷酸序列突變可為于一個基因座(點突變)作出的單一改變，例如轉(zhuǎn)換或顛換突變，或可替代地，可于單一基因座插入、缺失或變化多個核苷酸。另外，可于核苷酸序列內(nèi)任何數(shù)目的基因座作出一個或多個改變。可通過本領(lǐng)域中已知的任何適宜方法實施突變。[0033]與A型流感病毒有關(guān)的術(shù)語“流感病毒亞型”是指特征在于血球凝集素(H)與神經(jīng)氨酸酶(N)病毒表面蛋白質(zhì)的各種組合的A型流感病毒變體。A型流感病毒亞型可通過其H編號來提及，例如“包含Hl或Η3亞型的HA的流感病毒”或“Η1流感病毒”、“Η3流感病毒”，或通過H編號與N編號的組合來提及，例如“流感病毒亞型Η3Ν2”或“Η3Ν2”。術(shù)語流感病毒“亞型”具體包括各亞型內(nèi)通常自突變引起且顯示不同致病特征的所有個別流感病毒“株”。此類株還可稱作病毒亞型的各種“分離物”。因此，本發(fā)明所用術(shù)語“株”與“分離物”可互換使用。[0034]本文所用與本發(fā)明結(jié)合分子有關(guān)的術(shù)語“中和”是指不論達成中和的機制如何抑制流感病毒在體外和/或在個體內(nèi)復制的結(jié)合分子。因此，可通過(例如)以下方式達成中和:抑制病毒附著或黏著至細胞表面，或在病毒附著至靶細胞后抑制病毒與細胞膜融合，或抑制病毒自感染細胞釋出，及諸如此類。[0035]本文所用與本發(fā)明結(jié)合分子有關(guān)的術(shù)語“交叉中和(cross-neutralizing或cross-neutralizat1n)”是指本發(fā)明結(jié)合分子中和來自B/Yamagata譜系與B/Victoria譜系二者的B型流感病毒和/或這些譜系內(nèi)不同B型流感病毒株的能力。[0036]本文所用術(shù)語“宿主”意欲指已引入諸如克隆載體或表達載體等載體的有機體或細胞。有機體或細胞可為原核或真核。優(yōu)選地，宿主是經(jīng)分離宿主細胞，例如培養(yǎng)中的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”僅表示，細胞經(jīng)修飾用于(過)表達本發(fā)明結(jié)合分子且包括最初表達這些結(jié)合分子的B細胞且這些細胞已通過永生化、擴增、增強表達等經(jīng)修飾以過表達結(jié)合分子。應(yīng)理解，術(shù)語宿主意欲不僅指特定目標有機體或細胞，且還指此一有機體或細胞的子代。由于突變或環(huán)境影響可使后續(xù)各代發(fā)生某些改變，因此，此子代實際上可能與親代有機體或細胞不同但包括于本文所用術(shù)語“宿主”的范圍內(nèi)。[0037]術(shù)語“人類”在應(yīng)用于本文所定義的結(jié)合分子時，是指直接源自人類或基于人類種是序列的分子。當結(jié)合分子源自或基于人類序列且隨后經(jīng)修飾時，其仍應(yīng)視為說明書中所用的人類。換言之，術(shù)語人類當應(yīng)用于結(jié)合分子時，意欲包括具有源自人類種是免疫球蛋白序列的可變區(qū)及恒定區(qū)或基于出現(xiàn)于人類或人類淋巴球中且以某種形式修飾的可變區(qū)或恒定區(qū)的結(jié)合分子。因此，人類結(jié)合分子可包括不由人類種是免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，包含取代和/或缺失(例如，通過例如體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。“基于”本文所用是指以下情形:核酸序列可自模板準確拷貝，或例如通過易錯PCR方法而具有微小突變，或以合成方式使其與模板準確匹配或具有微小修飾。[0038]術(shù)語“插入”(還稱為術(shù)語“添加”)表示與親代序列相比分別導致添加一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的氨基酸或核苷酸序列變化。[0039]術(shù)語“經(jīng)分離”當應(yīng)用于本文所定義的結(jié)合分子時，是指實質(zhì)上不含其他蛋白質(zhì)或多肽、尤其不含具有不同抗原特異性的其他結(jié)合分子且還實質(zhì)上不含其他細胞材料和/或化學品的結(jié)合分子。例如，當結(jié)合分子是重組產(chǎn)生時，其優(yōu)選實質(zhì)上不含培養(yǎng)基組分，且當結(jié)合分子是通過化學合成產(chǎn)生時，其優(yōu)選實質(zhì)上不含化學前體或其他化學物質(zhì)，即，其是自參與蛋白質(zhì)合成的化學前體或其他化學物質(zhì)分離。術(shù)語“經(jīng)分離”當應(yīng)用于編碼本文所定義的結(jié)合分子的核酸分子時，意欲指以下核酸分子:編碼結(jié)合分子的核苷酸序列不含其他核苷酸序列、尤其編碼結(jié)合其他結(jié)合配偶體的結(jié)合分子的核苷酸序列。此外，術(shù)語“經(jīng)分離”是指實質(zhì)上自其他細胞組分分離的核酸分子，這些其他細胞組分天然伴隨天然宿主中的原有核酸分子，例如，與其天然關(guān)聯(lián)的核糖體、聚合酶或基因組序列。此外，“經(jīng)分離”核酸分子(例如cDNA分子)當通過重組技術(shù)產(chǎn)生時可實質(zhì)上不含其他細胞材料或培養(yǎng)基，或當化學合成時實質(zhì)上不含化學前體或其他化學物質(zhì)。[0040]本文所用術(shù)語“單克隆抗體”是指單特異性抗體分子制劑。單克隆抗體對于特定表位展示單結(jié)合特異性及親和力。因此，術(shù)語“人類單克隆抗體”是指展示單結(jié)合特異性的抗體，其具有源自或基于人類種是免疫球蛋白序列或源自完全合成序列的可變區(qū)及恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法與結(jié)合特異性無關(guān)。[0041]本文所用術(shù)語“天然”在應(yīng)用于物體時，是指物體或化合物可于自然界中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，存在于有機體中可自自然界中的來源分離且未由人在實驗室中有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。[0042]本發(fā)明中所用術(shù)語“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式且包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義鏈及反義鏈二者以及上述的合成形式及混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或任一類核苷酸的修飾形式。該術(shù)語還包括單鏈及雙鏈DNA形式。另外，多核苷酸可包括通過天然和/或非天然核苷酸連接而連接在一起的天然及經(jīng)修飾核苷酸中的任一者或二者。核酸分子可經(jīng)化學或生物化學修飾或可含有非天然或衍生化核苷酸堿基，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易了解。此類修飾包括(例如)標記、甲基化、用類似物對一個或多個天然核苷酸的取代、核苷酸間修飾，例如不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側(cè)接部分(例如，多肽)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂內(nèi)酯(psoralen)等)、螯合劑、烷基化劑及經(jīng)修飾連接(例如，α變旋異構(gòu)核酸等)。上述術(shù)語還意欲包括任何拓撲構(gòu)象，包括單鏈構(gòu)象、雙鏈構(gòu)象、部分雙螺旋構(gòu)象、三螺旋構(gòu)象、發(fā)卡構(gòu)象、環(huán)形構(gòu)象及掛鎖構(gòu)象。還包括在經(jīng)由氫鍵及其他化學相互作用結(jié)合指定序列的能力方面模擬多核苷酸的合成分子。此類分子為本領(lǐng)域中已知且包括(例如)肽連接取代分子主鏈中的磷酸酯連接的分子。除非另有說明，否則提及核酸序列涵蓋其互補體。因此應(yīng)理解，提及具有特定序列的核酸分子涵蓋具有其互補序列的其互補鏈?；パa鏈還可用于(例如)反義療法、雜交探針以及PCR引物。[0043]術(shù)語“可操作地連接”是指兩個或更多個通常物理連接且彼此具有功能關(guān)是的核酸序列元件。例如,若啟動子能夠起始或調(diào)控編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，則該啟動子可操作地連接至編碼序列，在此情形下，編碼序列應(yīng)理解為“在啟動子的控制下”。[0044]“藥學上可接受的賦形劑”意指與活性分子(例如藥物、藥劑或結(jié)合分子)組合用于制備適合或便利劑型的任何惰性物質(zhì)?！八帉W上可接受的賦形劑”是在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與包含藥物、藥劑或結(jié)合分子的配制物的其他成分兼容的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑被廣泛應(yīng)用且為本領(lǐng)域中已知。[0045]本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”在提及結(jié)合分子(例如抗體)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)的相互作用時，意指該相互作用取決于結(jié)合配偶體上特定結(jié)構(gòu)(例如抗原決定簇或表位)的存在。換言之，即使在結(jié)合配偶體存在于其他分子或有機體的混合物中時，抗體仍會優(yōu)先結(jié)合或識別結(jié)合配偶體。結(jié)合可通過共價或非共價相互作用或二者的組合介導。換言之，術(shù)語“特異性結(jié)合”意指免疫特異性結(jié)合抗原決定簇或表位且不免疫特異性結(jié)合其他抗原決定簇或表位。免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子可以較低親和力結(jié)合其他肽或多肽，如通過(例如)放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、BIAC0RE或本領(lǐng)域中已知的其他分析所測定。免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段可與帶有相同表位的相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段不與其他抗原交叉反應(yīng)。[0046]本文所用“取代”表示一個或多個氨基酸或核苷酸分別由不同氨基酸或核苷酸替代。[0047]術(shù)語“治療有效量”是指本文所定義結(jié)合分子有效預防、改善和/或治療自感染B型流感病毒所引起的病況的量。本文所用改善可指降低流感感染的可見或可感知的疾病癥狀、病毒血癥或任一其他可測量表現(xiàn)。[0048]術(shù)語“治療”是指治愈或停止或至少延遲疾病進展的治療性治療以及預防性或防范性措施。那些需要治療者包括那些已患有自流感病毒感染引起的病況者以及那些欲預防流感病毒感染者。自流感病毒感染部分或完全恢復的個體還可能需要治療。預防涵蓋抑制或減少流感病毒的擴散，或抑制或減緩一種或多種與流感病毒感染相關(guān)的癥狀的發(fā)作、發(fā)展或進展。[0049]術(shù)語“載體”表示可插入第二核酸分子以供引入將于其中復制且在一些情形下表達的宿主中的核酸分子。換言之，載體能夠轉(zhuǎn)運已與其連接的核酸分子。本文所用術(shù)語“載體”涵蓋克隆以及表達載體。載體包括(但不限于)質(zhì)粒、黏粒、細菌人工染色體(BAC)及酵母人工染色體(YAC)以及源自噬菌體或植物或動物(包括人類)病毒的載體。載體包含由所提出宿主識別的復制起點及(在表達載體的情形下)啟動子及由宿主識別的其他調(diào)控區(qū)。通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或通過利用病毒進入機制將含有第二核酸分子的載體引入細胞中。某些載體(例如，具有細菌復制起始點的載體可在細胞中復制)能夠在引入其的宿主中自主復制。其他載體可在引入宿主中時整合至宿主基因組中，且藉此連同宿主基因組一起復制。[0050]在第一方面中，本發(fā)明提供能夠特異性結(jié)合B/Yamagata及B/Victoria譜系的B型流感病毒株的血球凝集素(HA)且能夠中和B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的這些B型流感病毒株的結(jié)合分子。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒的HA。結(jié)合分子能夠在體外與體內(nèi)中和B型流感病毒。[0051]優(yōu)選地，結(jié)合分子是人類結(jié)合分子。在優(yōu)選實施例中，結(jié)合分子是人類抗體或其抗原結(jié)合片段。[0052]在某些實施例中，結(jié)合分子結(jié)合不同于CR9114(如共同待決申請案EP11173953.8中所述)的表位的表位，這些結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:116的重鏈可變區(qū)及含有氨基酸序列SEQIDN0:117的輕鏈可變區(qū)。已顯示，CR9114能夠結(jié)合及在體內(nèi)中和系統(tǒng)發(fā)生組I及2二者的A型流感病毒以及B型流感病毒。[0053]在某些實施例中，結(jié)合分子結(jié)合B型流感病毒的HA蛋白質(zhì)的頭部區(qū)域、特別是B型流感病毒的HAl的頭部區(qū)域。[0054]在某些實施例中，結(jié)合分子阻斷B/Yamagata譜系和/或B/Victoria譜系的B型流感病毒的細胞受體結(jié)合。[0055]在某些實施例中，結(jié)合分子不阻斷B/Yamagata譜系和/或B/Victoria譜系的流感病毒的細胞受體結(jié)合。[0056]在某些實施例中，結(jié)合分子阻斷B型流感病毒、特別是B/Victoria譜系與B/Yamagata譜系二者的流感病毒株自受感染細胞釋出。[0057]在某些實施例中，經(jīng)分離結(jié)合分子能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株，其中結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:71中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%-,91%-,92%-,93%-,94%-,95%-,96%-,97%-,98%-,99%或更聞序列致性的氣基Ife序列。[0058]在某些實施例中，結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:73中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。[0059]在實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:71的重鏈可變區(qū)及含有氨基酸序列SEQIDNO:73的輕鏈可變區(qū)。[0060]本發(fā)明還提供能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株的結(jié)合分子，其中結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且其中結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:1中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R1、包含SEQIDNO:2中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R2及含有SEQIDNO:3中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R3。根據(jù)本發(fā)明，⑶R區(qū)是根據(jù)Kabat等人(1991),如SequencesofProteinsofImmunologicalInterest中所述。[0061]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:4中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR1、含有SEQIDNO:5中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR2及含有SEQIDN0:6中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR3。[0062]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:1的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:2的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:3的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:4的輕鏈CDRl、含有氨基酸序列SEQIDNO:5的輕鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:6的輕鏈CDR3。[0063]本發(fā)明進一步提供免疫特異性結(jié)合B型流感病毒HA蛋白質(zhì)上與結(jié)合分子相同的表位的結(jié)合分子，其包含含有氨基酸序列SEQIDNO:71的重鏈可變序列及含有氨基酸序列SEQIDN0:73的輕鏈可變區(qū)。[0064]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:14的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:15的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:16的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:17的輕鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:18的輕鏈⑶R2及含有氨基酸序列SEQIDNO:19的輕鏈⑶R3。[0065]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:26的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:27的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:28的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:29的輕鏈CDRl、含有氨基酸序列SEQIDN0:24的輕鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:30的輕鏈⑶R3。[0066]本發(fā)明還提供以下結(jié)合分子:當B型流感病毒、特別是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是脯氨酸(P)時能夠特異性結(jié)合血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria譜系的B型流感病毒株、特別是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004,且當B型流感病毒、特別是B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是谷氨酰胺(Q)時不能夠中和B/Victoria譜系的B型流感病毒株、特別是B/Malaysia/2506/2004。[0067]在某些實施例中，本發(fā)明提供以下結(jié)合分子:當B型流感病毒、特別是B型流感病毒株B/Florida/04/200的HA的38位上的氨基酸是賴氨酸(K)時能夠特異性結(jié)合血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Yamagata譜系的B型流感病毒株、特別是B型流感病毒株B/Florida/04/2006,且當B型流感病毒、特別是B/Florida/04/2006的HA的38位上的氨基酸是谷氨酸(E)時還能夠中和B/Yamagata譜系、特別是B/Florida/04/2006的B型流感病毒株。[0068]本發(fā)明進一步提供以下結(jié)合分子:能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株，且不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDN0:75中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。[0069]在某些實施例中，結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:77中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。[0070]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:75的重鏈可變區(qū)及含有氨基酸序列SEQIDNO:77的輕鏈可變區(qū)。[0071]在某些實施例中，結(jié)合分子包含由氨基酸序列SEQIDN0:78組成的重鏈可變區(qū)及由氨基酸序列SEQIDN0:79組成的輕鏈可變區(qū)。[0072]在某些實施例中，本發(fā)明提供能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株的結(jié)合分子，其中結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且其中結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:7中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R1、含有SEQIDNO:8中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R2及含有SEQIDNO:9中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R3。[0073]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:10中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR1、含有SEQIDNO:11中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR2及含有SEQIDNO:12或13中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR3。[0074]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:7的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:8的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:9的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:10的輕鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:11的輕鏈⑶R2及含有氨基酸序列SEQIDNO:12的輕鏈CDR3。[0075]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:7的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:8的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:9的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:10的輕鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:11的輕鏈⑶R2及含有氨基酸序列SEQIDNO:13的輕鏈CDR3。[0076]本發(fā)明進一步提供免疫特異性結(jié)合B型流感病毒HA蛋白質(zhì)上與結(jié)合分子相同的表位的結(jié)合分子，其包含含有氨基酸序列SEQIDNO:75的重鏈可變序列及含有氨基酸序列SEQIDN0:77的輕鏈可變區(qū)。[0077]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:20的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:21的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:22的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:23的輕鏈CDRl、含有氨基酸序列SEQIDN0:24的輕鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDN0:25的輕鏈⑶R3。[0078]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDN0:31的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:32的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:33的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:4的輕鏈CDRl、含有氨基酸序列SEQIDNO:5的輕鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDN0:34的輕鏈CDR3。[0079]在某些實施例中，本發(fā)明提供以下結(jié)合分子:當B型流感病毒、特別是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是脯氨酸(P)時能夠特異性結(jié)合血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria譜系的B型流感病毒株、特別是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004，且當B型流感病毒、特別是B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是谷氨酰胺(Q)時還能夠中和B/Victoria譜系的B型流感病毒株、特別是B/Malaysia/2506/2004。[0080]在某些實施例中，本發(fā)明提供以下結(jié)合分子:當B型流感病毒、特別是B型流感病毒株B/Florida/04/200的HA的38位上的氨基酸是賴氨酸(K)時能夠特異性結(jié)合血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Yamagata譜系的B型流感病毒株、特別是B型流感病毒株B/Florida/04/2006,且當B型流感病毒、特別是B/Florida/04/2006的HA的38位上的氨基酸是谷氨酸(E)時不能夠中和B/Yamagata譜系、特別是B/Florida/04/2006的B型流感病毒株。[0081]本發(fā)明進一步提供以下結(jié)合分子:能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株，其中結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且其中結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:113中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。[0082]在某些實施例中，結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:115中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。[0083]在實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:113的重鏈可變區(qū)及含有氨基酸序列SEQIDNO:115的輕鏈可變區(qū)。[0084]在某些實施例中，本發(fā)明提供能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的血球凝集素蛋白質(zhì)(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者的B型流感病毒株的結(jié)合分子，其中結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒亞型的HA蛋白質(zhì)，且其中結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:54中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R1、含有SEQIDN0:55中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R2及含有SEQIDNO:56中所述氨基酸殘基序列的重鏈⑶R3。[0085]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有SEQIDNO:57中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR1、含有SEQIDNO:5中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR2及含有SEQIDN0:58中所述氨基酸殘基序列的輕鏈CDR3。[0086]在某些實施例中，結(jié)合分子包含含有氨基酸序列SEQIDNO:54的重鏈⑶R1、含有氨基酸序列SEQIDNO:55的重鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDNO:56的重鏈CDR3，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:57的輕鏈CDRl、含有氨基酸序列SEQIDN0:5的輕鏈CDR2及含有氨基酸序列SEQIDN0:58的輕鏈CDR3。[0087]本發(fā)明進一步提供免疫特異性結(jié)合B型流感病毒HA蛋白質(zhì)上與結(jié)合分子相同的表位的結(jié)合分子，其包含含有氨基酸序列SEQIDNO:113的重鏈可變序列及含有氨基酸序列SEQIDNO:115的輕鏈可變區(qū)。[0088]與A型流感病毒一樣，B型流感病毒通過結(jié)合靶細胞的細胞表面上的唾液酸殘基且在轉(zhuǎn)移至核內(nèi)體后通過將其膜與核內(nèi)體膜融合并將基因組-轉(zhuǎn)錄酶復合物釋放細胞中來感染細胞。受體結(jié)合與膜融合過程二者皆是由HA糖蛋白介導。A型流感與B病毒二者的HA皆包含兩種在結(jié)構(gòu)上不同的區(qū)，即球形頭部區(qū)域，其含有負責病毒附著至靶細胞且參與HA的血球凝集活性的受體結(jié)合位點；及主干區(qū)，其含有對于病毒外膜與細胞的核內(nèi)體膜之間的膜融合所需的融合肽。HA蛋白質(zhì)是三聚物，其中各單體由兩個二硫化物連接的糖多肽組成，即HAl及HA2，其是在感染期間通過前體(HAO)的蛋白水解裂解產(chǎn)生。裂解為病毒感染性所必需，這是因為需要預處理HA用于膜融合，以允許構(gòu)象變化。經(jīng)預處理分子的活化在核內(nèi)體中發(fā)生于介于PH5與pH6之間的低pH下。且需要HA結(jié)構(gòu)的深入變化。[0089]在某些實施例中，結(jié)合分子能夠特異性結(jié)合HA蛋白質(zhì)的HAl亞單位、特別是HAl亞單位的頭部區(qū)域。結(jié)合分子可能能夠特異性結(jié)合HA蛋白質(zhì)的HAl亞單位上的線性或結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象表位。HA分子可自病毒純化或重組產(chǎn)生且任選地在使用前分離?；蛘撸琀A可在細胞表面上表達。[0090]本發(fā)明結(jié)合分子可能能夠特異性結(jié)合有活力、活的和/或有感染性或呈不活化/衰減形式的B型流感病毒。使病毒(例如流感病毒)不活化/衰減的方法為本領(lǐng)域中熟知且包括(但不限于)用福爾馬林(formalin)、β-丙內(nèi)酯(BPL)、硫柳萊(merth1late)和/或紫外光處理。[0091]本發(fā)明結(jié)合分子還可能夠特異性結(jié)合B型流感病毒的一個或多個片段，尤其例如源自B型流感病毒亞型的一種或多種蛋白質(zhì)和/或(多)肽的制劑或B型流感病毒的一種或多種重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和/或多肽。各種B型流感株的核苷酸和/或蛋白質(zhì)氨基酸序列可在GenBank-數(shù)據(jù)庫、NCBI流感病毒序列數(shù)據(jù)庫、流感序列數(shù)據(jù)庫(ISD),EMBL-數(shù)據(jù)庫和/或其他數(shù)據(jù)庫中找到。在各自的數(shù)據(jù)庫中找到此類序列為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。[0092]在另一實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子能夠特異性結(jié)合上述蛋白質(zhì)和/或多肽的片段，其中該片段至少包含由本發(fā)明結(jié)合分子識別的表位。本文所用“表位”是能夠以足夠高親和力結(jié)合本發(fā)明結(jié)合分子以形成可檢測抗原結(jié)合分子復合物的部分。[0093]本發(fā)明結(jié)合分子可為完整免疫球蛋白分子，例如單克隆抗體，或結(jié)合分子可為其抗原結(jié)合片段，包括(但不限于)重鏈及輕鏈可變區(qū)、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及至少含有足以賦予流感病毒株或其片段特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白片段的(多)肽。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子是人類單克隆抗體和/或其抗原結(jié)合片段。結(jié)合分子還可為納米抗體(nanobody)、α抗體(alphabody)、親和體(affibody)、FN3-域架構(gòu)及基于(人類)重復蛋白質(zhì)中的域的其他架構(gòu)(如阿德耐汀(Adnectin)、昂替卡林(Anticalin)、達平(Darpin)等)或包含表位結(jié)合序列的其他架構(gòu)。[0094]在某些實施例中，結(jié)合分子是包含完全重鏈及輕鏈可變區(qū)以及完全重鏈及輕鏈恒定區(qū)的完整抗體。[0095]在某些實施例中，結(jié)合分子具有補體依賴性細胞毒性活性(CDC)和/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。[0096]本發(fā)明結(jié)合分子可以未經(jīng)分離或分離形式使用。此外，本發(fā)明結(jié)合分子可單獨或以混合物形式使用，該混合物包含至少一種本發(fā)明結(jié)合分子(或其變體或片段)及一種或多種結(jié)合流感且具有流感病毒抑制效應(yīng)的其他結(jié)合分子。換言之，結(jié)合分子可組合使用，例如，作為包含兩種或更多種結(jié)合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結(jié)合分子可在單一療法中組合以達成期望預防、治療或診斷效應(yīng)，但或者，具有相同活性的結(jié)合分子還可在單一療法中組合以達成期望預防、治療或診斷效應(yīng)。任選地，混合物還可包含至少一種本發(fā)明結(jié)合分子及至少一種其他治療劑。優(yōu)選地，諸如M2抑制劑(例如，金剛烷胺、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如，扎那米韋(zanamivir)、奧司他韋)等治療劑可用于預防和/或治療流感病毒感染。[0097]通常，本發(fā)明結(jié)合分子可以按低于0.2Χ10-4Μ、1.0Χ10-5Μ、1.0Χ10-6Μ、1.0Χ10_7Μ、優(yōu)選低于1.0X10_8M、更優(yōu)選低于1.0X10_9M、更優(yōu)選低于1.0X10-1QM、甚至更優(yōu)選低于1.0Χ10_ηΜ且特別是低于1.0Χ10_12Μ的親和力常數(shù)(Kd值)結(jié)合其結(jié)合配偶體，即B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的B型流感病毒和/或其片段。親和力常數(shù)對于抗體同種型可有所不同。例如，IgM同種型的親和力結(jié)合是指至少約1.0X10_7M的結(jié)合親和力。親和力常數(shù)可(例如)使用表面等離子體共振測量，例如使用BIAC0RE系統(tǒng)(PharmaciaB1sensorAB,Uppsala,Sweden)測量。[0098]本發(fā)明結(jié)合分子展現(xiàn)中和活性?？?例如)如本文所述測量中和活性。用于測量中和活性的替代分析闡述于(例如)WH0ManualonAnimalInfluenzaDiagnosisandSurveillance,Geneva:WorldHealthOrganisat1n,2005,第2002.5版中。[0099]通常，本發(fā)明結(jié)合分子具有50μg/ml或更小、優(yōu)選20μg/ml或更小的中和活性，更優(yōu)選10μg/ml或更小、甚至更優(yōu)選5μg/ml或更小的中和活性,如在如實例6中所述體外病毒中和分析(VNA)中所測定。本發(fā)明結(jié)合分子可結(jié)合呈可溶形式的流感病毒或其片段(例如在試樣中或在懸浮液中)或可結(jié)合與載體或基板(例如，微量滴定板、膜及珠粒等)結(jié)合或附著的流感病毒或其片段。載體或基板可由玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯)、多糖、耐綸(nylon)、硝酸纖維素或特夫綸(Teflon)等制得。此類載體的表面可為實心或有孔及任何便利形狀。此外，結(jié)合分子可結(jié)合呈純化/分離或未經(jīng)純化/未經(jīng)分離形式的流感病毒。[0100]如上文所論述，本發(fā)明在某些實施例中提供能夠識別及結(jié)合B型流感病毒的流感血凝素蛋白(HA)中的表位的經(jīng)分離人類結(jié)合分子，其中這些結(jié)合分子在體外與體內(nèi)皆具有抗B/Yamagata和/或B/Victoria譜系二者的B型流感病毒的中和活性。根據(jù)本發(fā)明，已顯示，本發(fā)明結(jié)合分子交叉中和屬于兩種系統(tǒng)發(fā)生譜系的流感病毒亞型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文所披露的內(nèi)容可確定抗體是否真正地與來自不同亞型的HA蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)且還可確定其是否能夠體外和/或體內(nèi)中和不同亞型的流感病毒。[0101]本發(fā)明的另一方面包括上文所定義結(jié)合分子的功能變體。若變體結(jié)合分子能夠與“親代”或“參照”結(jié)合分子競爭免疫特異性結(jié)合流感病毒或其片段，則認為分子為本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。換言之，當功能變體仍能夠結(jié)合流感病毒或其片段的相同或重疊表位時，則認為分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。對于本申請案而言，“親代”及“參照”將用作同義詞，意指參照或親代分子或物理分子本身的信息構(gòu)成變化形式的基礎(chǔ)。功能變體包括(但不限于)一級結(jié)構(gòu)序列實質(zhì)上類似的衍生物，包括那些在Fe受體或參與效應(yīng)功能的其他區(qū)中具有修飾和/或含有(例如)未在親代結(jié)合分子發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化學和/或生物化學修飾者。此類修飾尤其包括乙?；Ⅴ；⒑塑账峄蚝塑账嵫苌锏墓矁r附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化及諸如此類?；蛘撸δ茏凅w可為如本發(fā)明中所定義的結(jié)合分子，其包含與親代結(jié)合分子的氨基酸序列相比含有一個或多個氨基酸的取代、插入、缺失或其組合的氨基酸序列。此外，功能變體可在氨基或羧基端的一端或兩端包含氨基酸序列的截短形式。本發(fā)明功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同(更高或更低)結(jié)合親和力，但仍能夠結(jié)合流感病毒或其片段。例如，本發(fā)明功能變體與親代結(jié)合分子相比對流感病毒或其片段的結(jié)合親和力有所增加或降低。在某些實施例中，可變區(qū)(包括(但不限于)框架區(qū)、超變區(qū)、特別是CDR3區(qū))的氨基酸序列經(jīng)修飾。通常，輕鏈及重鏈可變區(qū)包含三個超變區(qū)(包含三個CDR)及更為保守區(qū)(所謂的框架區(qū)(FR))。超變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基及來自超變環(huán)的氨基酸殘基。意欲屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所定義親代結(jié)合分子具有至少約80%至約99%、優(yōu)選至少約70%至約99%、更優(yōu)選至少約80%至約99%、甚至更優(yōu)選至少約90%至約99%、最優(yōu)選至少約95%至約99%、特別是至少約97%至約99%氨基酸序列一致性和/或同源性?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的計算機算法(尤其例如Gap或Bestfit)對欲比較的氨基酸序列進行比對及界定類似或相同氨基酸殘基。功能變體可通過本領(lǐng)域中已知的一般分子生物學方法改變親代結(jié)合分子或其部分獲得，一般分子生物學方法包括(但不限于)易錯PCR、寡核苷酸定向誘變、定點誘變以及重鏈和/或輕鏈改組。[0102]在某些實施例中，本發(fā)明功能變體具有抗B型流感病毒的中和活性。與親代結(jié)合分子相比，中和活性可相同或更高或更低。如本申請案中所用，當使用術(shù)語(人類)結(jié)合分子時，這還涵蓋(人類)結(jié)合分子的功能變體。驗證變體結(jié)合分子是否具有中和活性的分析為本領(lǐng)域中熟知(參見WHOManualonAnimalInfluenzaDiagnosisandSurveillance,Geneva:WorldHealthOrganisat1n,2005第2002.5版)。[0103]在某些實施例中，功能變體是包含以下的結(jié)合分子:與SEQIDNO:71相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的重鏈可變序列和/或與SEQIDNO:73相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的輕鏈可變區(qū)。[0104]在某些實施例中，功能變體是包含以下的結(jié)合分子:與SEQIDN0:75相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的重鏈可變序列和/或與SEQIDNO:77相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的輕鏈可變區(qū)。[0105]在某些實施例中，功能變體是包含以下的結(jié)合分子:與SEQIDN0:113相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的重鏈可變序列和/或與SEQIDNO:115相比包含一個或多個氨基酸突變(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸突變)的輕鏈可變區(qū)。[0106]在某些實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子是選自由包含以下的結(jié)合分子組成的組:[0107](a)包含氨基酸序列SEQIDNO:59的重鏈CDR1、包含氨基酸序列SEQIDN0:2的重鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:3的重鏈CDR3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:17的輕鏈⑶R1、包含氨基酸序列SEQIDNO:18的輕鏈⑶R2及包含氨基酸序列SEQIDNO:60的輕鏈CDR3；[0108](b)包含氨基酸序列SEQIDNO:61的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:2的重鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:3的重鏈CDR3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:62的輕鏈⑶R1、包含氨基酸序列SEQIDNO:18的輕鏈⑶R2及包含氨基酸序列SEQIDNO:63的輕鏈CDR3；[0109](c)包含氨基酸序列SEQIDNO:59的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:2的重鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:3的重鏈CDR3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:64的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:65的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:66的輕鏈⑶R3;及[0110](d)包含氨基酸序列SEQIDNO:59的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:2的重鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:3的重鏈CDR3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:67的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:68的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:69的輕鏈CDR3；[0111](e)包含氨基酸序列SEQIDNO:35的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDN0:36的重鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:37的重鏈CDR3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:4的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:38的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:39的輕鏈CDR3；[0112](f)包含氨基酸序列SEQIDNO:40的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:41的重鏈⑶R2及包含氨基酸序列SEQIDNO:42的重鏈⑶R3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:43的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:5的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:44的輕鏈CDR3；[0113](g)包含氨基酸序列SEQIDN0:45的重鏈CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO:46的重鏈⑶R2及包含氨基酸序列SEQIDNO:47的重鏈⑶R3，以及包含氨基酸序列SEQIDNO:48的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:38的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:49的輕鏈CDR3;及[0114](h)包含氨基酸序列SEQIDNO:45的重鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:50的重鏈⑶R2及包含氨基酸序列SEQIDNO:47的重鏈⑶R3，以及包含氨基酸序列SEQIDN0:51的輕鏈CDRl、包含氨基酸序列SEQIDNO:52的輕鏈CDR2及包含氨基酸序列SEQIDNO:53的輕鏈CDR3。[0115]在某些實施例中，結(jié)合分子是選自由以下組成的組:[0116]a)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:119及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:121的結(jié)合分子；[0117]b)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:123及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:125的結(jié)合分子；[0118]c)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:127及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:129的結(jié)合分子；[0119]d)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:131及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:133的結(jié)合分子；[0120]e)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:77及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:79的結(jié)合分子；[0121]f)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:101及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:103的結(jié)合分子；[0122]g)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:105及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:107的結(jié)合分子；及[0123]h)包含重鏈可變區(qū)SEQIDNO:109及輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:111的結(jié)合分子。[0124]在某些實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子用作藥劑，且優(yōu)選用于治療性和/或預防性治療由B型流感病毒引起的流感感染。引起流感感染且可使用本發(fā)明結(jié)合分子治療的流感病毒可為B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的B型流感病毒。[0125]本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明結(jié)合分子及至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。[0126]在再一實施例中，本發(fā)明涉及本發(fā)明結(jié)合分子在制備用于預防和/或治療流感病毒感染的藥劑中的用途。[0127]可使用本發(fā)明結(jié)合分子預防和/或治療的流感病毒感染可發(fā)生于小群體中，但還可在季節(jié)性流行中或更糟糕地在全球大范圍流行(其中數(shù)百萬個體具有風險)中在全世界擴散。本發(fā)明提供可中和引起此類季節(jié)性流行以及潛在大范圍流行的流感株感染的結(jié)合分子。[0128]在再一方面中，本發(fā)明提供免疫偶聯(lián)物，即包含至少一種如本文所定義的結(jié)合分子且進一步包含至少一種標簽(尤其例如可檢測部分/試劑)的分子。本發(fā)明中還涵蓋本發(fā)明免疫偶聯(lián)物的混合物或至少一種本發(fā)明免疫偶聯(lián)物與另一分子(例如治療劑或另一結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物)的混合物。在其他實施例中，本發(fā)明免疫偶聯(lián)物可包含超過一種標簽。這些標簽可彼此相同或不同且可非共價地接合/偶聯(lián)至結(jié)合分子。標簽還可經(jīng)由共價鍵結(jié)直接接合/偶聯(lián)至人類結(jié)合分子?；蛘?，標簽可藉助一種或多種連接化合物接合/偶聯(lián)至結(jié)合分子。將標簽偶聯(lián)至結(jié)合分子的技術(shù)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。[0129]本發(fā)明免疫偶聯(lián)物的標簽可為治療劑，但其還可為可檢測部分/試劑。適于療法和/或預防的標簽可為毒素或其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或免疫刺激的其他結(jié)合分子。包含可檢測試劑的免疫偶聯(lián)物可作為臨床測試程序的一部分在診斷上用于(例如)評價個體是否已感染流感病毒或監(jiān)測流感病毒感染的發(fā)展或進展，以(例如)確定給定治療方案的功效。然而，其還可用于其他檢測和/或分析和/或診斷目的?？蓹z測部分/試劑包括(但不限于)酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬及非放射性順磁性金屬離子。用于標記結(jié)合分子以供檢測和/或分析和/或診斷目的的標簽取決于所用具體檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法，尤其例如(組織)試樣的免疫組織化學染色、流式細胞術(shù)檢測、掃描雷射細胞術(shù)檢測、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如，吞噬作用分析)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)應(yīng)用等。用于本領(lǐng)域中已知檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法的適宜標記為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。[0130]此外，本發(fā)明的人類結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物還可附著至固體載體，這些載體尤其可用于體外免疫分析或純化流感病毒或其片段。此類固體載體可為有孔或無孔、平面或非平面。本發(fā)明結(jié)合分子可融合至標記物序列(例如肽)以促進純化。實例包括(但不限于)六組氨酸標簽、血球凝集素(HA)標簽、myc標簽或flag標簽?；蛘撸贵w可偶聯(lián)至第二抗體以形成抗體異源偶聯(lián)物。在另一方面中，本發(fā)明結(jié)合分子可偶聯(lián)/附著至一種或多種抗原。優(yōu)選地，這些抗原是由給予結(jié)合分子-抗原偶聯(lián)物的個體的免疫系統(tǒng)識別的抗原。抗原可相同，但還可彼此不同。附著抗原與結(jié)合分子的偶聯(lián)方法為本領(lǐng)域中熟知且包括(但不限于)使用交聯(lián)劑。本發(fā)明結(jié)合分子將結(jié)合流感病毒HA且附著至結(jié)合分子的抗原將起始T細胞對偶聯(lián)物的有力攻擊，這最終將破壞流感病毒。[0131]除通過直接或經(jīng)由(例如)連接體間接偶聯(lián)以化學方式產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物之外，還可以包含本發(fā)明結(jié)合分子及適宜標簽的融合蛋白質(zhì)的形式產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物。融合蛋白質(zhì)可通過本領(lǐng)域中已知方法產(chǎn)生，例如，通過構(gòu)建包含編碼結(jié)合分子的核苷酸序列與框架內(nèi)編碼適宜標簽的核苷酸序列的核酸分子且隨后表達核酸分子以重組方式產(chǎn)生。[0132]本發(fā)明的另一方面是提供編碼至少一種本發(fā)明結(jié)合分子、功能變體或免疫偶聯(lián)物的核酸分子。此類核酸分子可(例如)在如上文所述親和力成熟過程中作為中間體用于克隆目的。在優(yōu)選實施例中，核酸分子是分離或純化的。[0133]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，這些核酸分子的功能變體還意欲成為本發(fā)明的一部分。功能變體是可使用標準遺傳密碼直接翻譯以提供與自親代核酸分子翻譯者相同的氨基酸序列的核酸序列。[0134]優(yōu)選地，核酸分子編碼包含如上文所述⑶R區(qū)的結(jié)合分子。在又一實施例中，核酸分子編碼包含本發(fā)明結(jié)合分子的2個、3個、4個、5個或甚至所有6個⑶R區(qū)的結(jié)合分子。[0135]在另一實施例中，核酸分子編碼包含重鏈的結(jié)合分子，該重鏈包含如上文所述可變重鏈序列。在另一實施例中，核酸分子編碼包含輕鏈的結(jié)合分子，該輕鏈包含如上文所述可變輕鏈序列。下文給出本發(fā)明結(jié)合分子的核苷酸序列以及重鏈及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。[0136]本發(fā)明另一方面是提供包含一種或多種本發(fā)明核酸分子的載體，即核酸構(gòu)建體。載體可源自質(zhì)粒，尤其例如F、Rl、RPl、Col、pBR322、T0L、Ti等；黏粒；噬菌體，例如λ、λ形、M13、Mu、Pl、P22、QP、T-偶數(shù)、T-奇數(shù)、T2、T4、T7等；植物病毒。載體可用于克隆和/或用于表達本發(fā)明結(jié)合分子且甚至可用于基因治療目的。本發(fā)明還涵蓋包含一種或多種本發(fā)明核酸分子可操作地連接至一種或多種調(diào)控表達的核酸分子的載體。載體的選擇取決于所遵循重組程序及所用宿主。在宿主細胞中引入載體尤其可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體(Iipofectamin)轉(zhuǎn)染或電穿孔實現(xiàn)。載體可自主復制或可與已整合其的染色體一起復制。優(yōu)選地，載體含有一種或多種選擇標記物。標記物的選擇可取決于所選宿主細胞，但此對于本發(fā)明并不重要，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。其包括(但不限于)卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、zeocin、皰疫單純性病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠的二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發(fā)明還涵蓋包含一種或多種編碼如上文所述人類結(jié)合分子的核酸分子可操作地連接至一種或多種編碼可用于分離人類結(jié)合分子的蛋白質(zhì)或肽的核酸分子的載體。這些蛋白質(zhì)或肽包括(但不限于)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合金屬的多組氨酸、綠色熒光蛋白質(zhì)、熒光素酶及半乳糖苷酶。[0137]含有上述載體的一個或多個拷貝的宿主是本發(fā)明的又一方面。優(yōu)選地，宿主是宿主細胞。宿主細胞包括(但不限于)哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細菌來源的細胞。細菌細胞包括(但不限于)來自革蘭氏(Gram)陽性細菌或革蘭氏陰性細菌(例如艾氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(E.coli))及假單孢菌屬(Pseudomonas)的若干物種)的細胞。在真菌細胞群中，優(yōu)選使用酵母細胞。在酵母中的表達可通過使用酵母株(尤其例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)及多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha))來達成。此外,可使用昆蟲細胞(例如來自果蠅及Sf9的細胞)作為宿主細胞。此外，宿主細胞可為植物細胞，尤其例如來自作物植物(例如林業(yè)植物)的細胞、或來自提供食物及原材料的植物(例如谷類植物或藥用植物)的細胞、或來自觀賞植物的細胞或來自花球作物的細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因)植物或植物細胞是通過已知方法產(chǎn)生，例如，農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導的基因轉(zhuǎn)移、葉圓片(leafdisc)的轉(zhuǎn)化、通過聚乙二醇介導的DNA轉(zhuǎn)移實施的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、音波處理、微注射或基因槍(bolistic)基因轉(zhuǎn)移。另外，適宜表達系統(tǒng)可為桿狀病毒系統(tǒng)。在本發(fā)明中優(yōu)選為使用哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞或博斯黑色素瘤細胞)的表達系統(tǒng)。哺乳動物細胞提供翻譯后修飾最類似于哺乳動物來源的天然分子的經(jīng)表達蛋白質(zhì)。由于本發(fā)明涉及可能必須給予人類的分子，因此尤其優(yōu)選將為完全人類表達系統(tǒng)。因此，甚至更優(yōu)選地，宿主細胞是人類細胞。人類細胞的實例尤其為HeLa、911、AT1080、A549、293及HEK293T細胞。在優(yōu)選實施例中，人類產(chǎn)生細胞包含以可表達形式編碼腺病毒El區(qū)的核酸序列的至少一功能部分。在甚至更優(yōu)選實施例中，這些宿主細胞源自人類視網(wǎng)膜且經(jīng)包含腺病毒El序列的核酸永生化，例如911細胞或于1996年2月29日以編號96022940寄存于歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollect1nofCellCultures,ECACC,CAMR,Salisbury,WiltshireSP4OJG,GreatBritain)且以商標丨)ER.C'(V;)(PER.C6是CrucellHollandB.V.的注冊商標)出售的細胞是。出于本申請案的目的，“PER.C6細胞”是指以編號96022940寄存的細胞或祖細胞、上游或下游傳代細胞以及來自寄存細胞的祖細胞的后代以及上述的衍生物。在宿主細胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)可根據(jù)本領(lǐng)域中熟知方法實施。使用以商標PER.C6?出售的細胞作為所關(guān)注蛋白質(zhì)的產(chǎn)生平臺已闡述于WO00/63403中，其披露內(nèi)容的全文以引用方式并入本文中。[0138]產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合分子的方法是本發(fā)明的又一方面。該方法包含以下步驟:a)在有益于表達結(jié)合分子的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主，及b)任選地回收所表達結(jié)合分子。所表達結(jié)合分子可自無細胞提取物回收，但優(yōu)選地其是自培養(yǎng)基回收。上述產(chǎn)生方法還可用于制備本發(fā)明結(jié)合分子和/或免疫偶聯(lián)物的功能變體。自無細胞提取物或培養(yǎng)基回收諸如結(jié)合分子等蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。可通過上述方法獲得的結(jié)合分子、功能變體和/或免疫偶聯(lián)物還為本發(fā)明的一部分。[0139]或者，除諸如宿主細胞等宿主中表達之外，本發(fā)明的結(jié)合分子及免疫偶聯(lián)物還可通過常規(guī)肽合成器以合成方式或在無細胞翻譯系統(tǒng)中使用源自本發(fā)明DNA分子的RNA核酸產(chǎn)生。如可通過上述合成產(chǎn)生方法或無細胞翻譯系統(tǒng)獲得的結(jié)合分子及免疫偶聯(lián)物也為本發(fā)明的一部分。[0140]在再一實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子還可在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物(尤其例如兔、山羊或奶牛)中產(chǎn)生并分泌至(例如)其乳中。[0141]在再一替代實施例中，本發(fā)明結(jié)合分子可通過在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物(例如表達人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或兔)中產(chǎn)生。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物具有編碼如上文所述人類結(jié)合分子的全部或一部分的包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因及人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組?？捎昧鞲胁《净蚱淦蔚募兓蚋患苿D(zhuǎn)基因非人類哺乳動物實施免疫。對非人類哺乳動物實施免疫的方案已在本領(lǐng)域中充分確立。參見UsingAntibodies:ALaboratoryManual,編輯:E.Harlow,D.Lane(1998),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork及CurrentProtocolsinImmunology,編輯:J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,ff.Strober(2001),JohnWiley&Sons公司，NewYork，其提示內(nèi)容以引用方式并入本文中。免疫方案通常包括利用或不利用佐劑(例如弗氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant)及弗氏不完全佐劑)的多次免疫，但還可包括裸DNA免疫。在另一實施例中，人類結(jié)合分子是由源自轉(zhuǎn)基因動物的B-細胞、血漿細胞和/或記憶細胞產(chǎn)生。在再一實施例中，人類結(jié)合分子是由通過將自上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物獲得的B-細胞融合至永生化細胞制備的雜交瘤產(chǎn)生?？勺陨鲜鲛D(zhuǎn)基因非人類哺乳動物獲得的B-細胞、血漿細胞及雜交瘤以及可自上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物、B-細胞、血漿細胞和/或記憶細胞以及雜交瘤獲得的人類結(jié)合分子也為本發(fā)明的一部分。[0142]在再一方面中，本發(fā)明提供包含至少本發(fā)明結(jié)合分子(優(yōu)選為人類單克隆抗體)、至少其功能變體、至少本發(fā)明免疫偶聯(lián)物和/或其組合的組合物。此外，這些組合物尤其可包含穩(wěn)定分子(例如白蛋白或聚乙二醇)或鹽。優(yōu)選地，所用鹽是保持結(jié)合分子的期望生物學活性且不賦予任何不期望的毒理學效應(yīng)的鹽。若需要，則本發(fā)明人類結(jié)合分子可涂覆于材料中或上以保護其免受酸或可使結(jié)合分子不活化的其他天然或非天然條件的作用。[0143]在再一方面中，本發(fā)明提供至少包含如本發(fā)明中所定義的核酸分子的組合物。組合物可包含水溶液，例如含有鹽(例如，NaCl或上述鹽)、清潔劑(例如，SDS)和/或其他適宜組分的水溶液。[0144]此外，本發(fā)明是關(guān)于包含至少本發(fā)明結(jié)合分子(例如人類單克隆抗體)(或其片段或變體)、至少本發(fā)明免疫偶聯(lián)物、至少本發(fā)明組合物或其組合的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。本發(fā)明藥物組合物可進一步包含至少一種其他治療劑。適宜試劑也為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。[0145]在某些實施例中，本發(fā)明藥物組合物包含至少一種其他結(jié)合分子，即藥物組合物可為結(jié)合分子的混合劑或混合物。藥物組合物可包含至少兩種本發(fā)明結(jié)合分子、或至少一種本發(fā)明結(jié)合分子及至少一種其他流感病毒結(jié)合和/或中和分子(例如針對HA蛋白質(zhì)或針對存在于流感病毒(例如M2)上的其他抗原結(jié)構(gòu)的另一抗體)和/或中和一種或多種其他病原的結(jié)合分子。在另一實施例中，其他結(jié)合分子可經(jīng)配制用于同時單獨或依序給予。[0146]在某些實施例中，結(jié)合分子在組合使用時展現(xiàn)協(xié)同中和活性。本發(fā)明所用術(shù)語“協(xié)同”意指結(jié)合分子在組合使用時的組合效應(yīng)大于其在個別使用時的加和效應(yīng)。協(xié)同作用結(jié)合分子可結(jié)合流感病毒的相同或不同片段上的不同結(jié)構(gòu)。一種計算協(xié)同作用的方式是藉助組合指數(shù)。組合指數(shù)(Cl)的概念已由Chou及Talalay(1984)闡述。組合物可(例如)包含一種具有中和活性的結(jié)合分子及一種非中和結(jié)合分子。非中和及中和結(jié)合分子還可協(xié)同作用以中和流感病毒。[0147]在某些實施例中，藥物組合物可包含至少一種本發(fā)明結(jié)合分子及至少一種其他結(jié)合分子，優(yōu)選其他流感病毒中和性結(jié)合分子。藥物組合物中的結(jié)合分子優(yōu)選能夠與不同亞型的流感病毒反應(yīng)。結(jié)合分子可具有高親和力且具有寬特異性。優(yōu)選地，兩種結(jié)合分子是交叉中和分子，這是因為其各自中和不同亞型的流感病毒。另外，優(yōu)選地，其盡可能多地中和不同流感病毒亞型中每一者之株。[0148]在某些實施例中，藥物組合物包含至少一種其他預防劑和/或治療劑。優(yōu)選地，這些其他治療劑和/或預防劑是能夠預防和/或治療流感病毒感染和/或自此一感染引起的病況的藥劑。治療劑和/或預防劑包括(但不限于)抗病毒劑。此類藥劑可為結(jié)合分子、小分子、有機或無機化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用于治療感染流感病毒的患者的其他藥劑是M2抑制劑(例如，金剛烷胺、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如，扎那米韋、奧司他韋)。這些藥劑可與本發(fā)明結(jié)合分子組合使用。本文中的“組合”意指同時、作為單獨配制物或作為一種單一組合配制物、或根據(jù)依序給予方案作為單獨配制物以任何順序。能夠預防和/或治療流感病毒感染和/或自此一感染引起的病況的處于實驗階段的藥劑還可用作可用于本發(fā)明中的其他治療劑和/或預防劑。[0149]本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合物在用于人類之前可在適宜動物模型系統(tǒng)中進行測試。此類動物模型系統(tǒng)包括(但不限于)小鼠、雪貂及猴。[0150]通常，藥物組合物必須無菌且在制造及儲存條件下穩(wěn)定。本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫偶聯(lián)物或組合物可呈粉末形式以供在遞送前或遞送時在適當藥學上可接受的賦形劑重構(gòu)。在使用無菌粉末來制備無菌可注射溶液的情形下，優(yōu)選制備方法是真空干燥及冷凍干燥(凍干)，其可產(chǎn)生由活性成分與任何其他所期望成分構(gòu)成的粉末(來自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液)。[0151]或者，本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫偶聯(lián)物或組合物可呈溶液形式且可在遞送前或遞送時添加和/或混合適當藥學上可接受的賦形劑以提供單位劑量可注射形式。優(yōu)選地，用于本發(fā)明中的藥學上可接受的賦形劑適于高藥物濃度，可維持適當流動性且若需要，可延遲吸收。[0152]藥物組合物的最佳給予途徑的選擇將受到若干因素影響，包括組合物內(nèi)活性分子的物理化學性質(zhì)、臨床狀況的緊急程度及活性分子的血漿濃度與期望治療效應(yīng)的關(guān)是。例如，若需要，則本發(fā)明結(jié)合分子可利用將保護其免于快速釋放的載體制備，例如受控釋放配制物，包括埋植劑、透皮貼劑及微囊封遞送系統(tǒng)。尤其可使用生物可降解的生物兼容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。此外，可能需要用防止人類結(jié)合分子不活化的材料或化合物涂覆結(jié)合分子或共給予結(jié)合分子與該材料或化合物。例如，結(jié)合分子可以適當載體(例如，脂質(zhì)體或稀釋劑)給予個體。[0153]給予途徑可分成兩個主要類別，經(jīng)口及非經(jīng)腸給予。優(yōu)選給予途徑是靜脈內(nèi)或通過吸入。[0154]經(jīng)口劑型尤其可配制呈片劑、喉錠、菱形錠劑、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬質(zhì)膠囊、軟質(zhì)明膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣錠、液體、凝膠或漿液。這些配制物可含有醫(yī)藥賦形劑，包括(但不限于)惰性稀釋劑、造粒劑及崩解劑、結(jié)合劑、潤滑劑、防腐劑、著色劑、矯味劑或甜味劑、植物油或礦物油、潤濕劑及增稠劑。[0155]本發(fā)明藥物組合物還可經(jīng)配制用于非經(jīng)腸給予。用于非經(jīng)腸給予的配制物尤其可呈水性或非水性等滲無菌無毒注射或輸注溶液或懸浮液形式。溶液或懸浮液可包含在所用劑量及濃度下對接受者無毒的試劑，例如1，3-丁二醇、灑林格氏溶液(Ringer’ssolut1n)、漢克氏溶液(Hank’ssolut1n)、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩沖劑、增黏劑或增溶劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑及金屬螯合劑。[0156]在又一方面中，本發(fā)明的結(jié)合分子(諸如人類單克隆抗體)(其功能片段及變體)、免疫偶聯(lián)物、組合物或藥物組合物可用作藥劑或診斷劑。因此，本發(fā)明的另一方面是使用本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫偶聯(lián)物、組合物或藥物組合物診斷、治療和/或預防流感病毒感染的方法。上述分子尤其可用于由B型流感病毒引起的流感病毒感染的診斷、預防、治療或其組合。其適于治療尚未經(jīng)治療的罹患流感病毒感染的患者及已經(jīng)或正在治療流感病毒感染的患者。[0157]上述分子或組合物可結(jié)合可用于診斷、預防和/或治療的其他分子使用。其可在體外、離體或體內(nèi)使用。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子(例如人類單克隆抗體)(或其功能變體)、免疫偶聯(lián)物、組合物或藥物組合物可與抗流感病毒(若有)的疫苗共給予?；蛘?，疫苗還可在給予本發(fā)明分子之前或之后給予。代替疫苗，抗病毒劑還可結(jié)合本發(fā)明結(jié)合分子使用。適宜抗病毒劑如上文所述。[0158]通常將這些分子以治療或診斷有效量配制于本發(fā)明的組合物及藥物組合物中?；蛘?，其可經(jīng)單獨配制并給予。例如，可全身性施加諸如抗病毒劑等其他分子，同時可經(jīng)注射內(nèi)施加本發(fā)明結(jié)合分子。[0159]治療可針對易感染流感的患者群。此類患者群包括(但不限于例如)老年人(例如≥50歲、≥60歲且優(yōu)選≥65歲)、幼兒(例如≤5歲、≤I歲)、住院患者及已用抗病毒化合物治療但顯示不充足抗病毒反應(yīng)的已感染患者。[0160]可調(diào)整劑量方案以提供最佳期望反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。適宜劑量范圍可為(例如)0.01-100mg/kg體重、優(yōu)選0.l_50mg/kg體重、優(yōu)選0.01_15mg/kg體重。此外，例如，可給予單次濃注劑，可經(jīng)一段時間給予若干分次劑量或可根據(jù)治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。本發(fā)明的分子及組合物優(yōu)選無菌。使這些分子及組合物無菌的方法為本領(lǐng)域中熟知。可用于診斷、預防和/或治療的其他分子可以與針對本發(fā)明結(jié)合分子所提出類似的劑量方案給予。若單獨給予其他分子，則可在給予一種或多種本發(fā)明人類結(jié)合分子或藥物組合物之前(例如，之前2min、5min、lOmin、15min、30min、45min、60min、2hr、4hr、6hr、8hr、10hr、12hr>14hr>16hr>18hr>20hr>22hr>24hr>2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)、與其同時或在其之后(例如,之后2min、5min、lOmin、15min、30min、45min、60min、2hr>4hr>6hr>8hr>10hr、12hr>14hr>16hr>18hr、20hr、22h;r、24h;r、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)將其給予患者。通常在人類患者中進行臨床試驗期間分選出確切劑量方案。[0161]人類結(jié)合分子及包含人類結(jié)合分子的藥物組合物尤其有用，且通常在作為體內(nèi)治療劑給予人類時優(yōu)選，這是因為接受者對所給予抗體的免疫反應(yīng)通常將實質(zhì)上小于由給予單株鼠類、嵌合或人源化結(jié)合分子偶然引起的免疫反應(yīng)。[0162]在另一方面中，本發(fā)明是關(guān)于本發(fā)明的結(jié)合分子(中和人類單克隆抗體)(其功能片段及變體)、免疫偶聯(lián)物、核酸分子、組合物或藥物組合物的用途，其用于制備用于診斷、預防、治療或其組合流感病毒感染、特別是由B型流感病毒引起的流感病毒感染的藥劑。[0163]此外，包含至少本發(fā)明的結(jié)合分子(例如中和人類單克隆抗體)(其功能片段及變體)、至少免疫偶聯(lián)物、至少核酸分子、至少組合物、至少藥物組合物、至少載體、至少宿主或其組合的試劑盒也為本發(fā)明的方面。任選地，將本發(fā)明試劑盒的上述組分包裝于適宜容器中并標記用于所指示病況的診斷、預防和/或治療。上述組分可作為水(優(yōu)選無菌)溶液或作為重構(gòu)用凍干(優(yōu)選無菌)配制物儲存于單元或多劑量容器中。容器可自諸如玻璃或塑料等多種材料形成且可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內(nèi)溶液袋或具有可通過皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。試劑盒可進一步包含較多容器，這些容器包含藥學上可接受的緩沖劑。其可進一步包括自商業(yè)及使用者角度合意的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、填充劑、針、注射器、用于一種或多種適宜宿主的培養(yǎng)基及可能甚至至少一種其他治療劑、預防劑或診斷劑。通常在治療、預防或診斷產(chǎn)品的商業(yè)包裝中可包括與試劑盒相關(guān)的說明書，其含有關(guān)于(例如)此類治療、預防或診斷產(chǎn)品的適應(yīng)癥、用法、劑量、制造、給予、禁忌和/或有關(guān)其使用的警告的信息。[0164]本發(fā)明結(jié)合分子還可有利地在體外方法中用作診斷劑用于檢測流感病毒。因此本發(fā)明進一步涉及檢測試樣中的B型流感亞型流感病毒的方法，其中該方法包含以下步驟:[0165](a)使用本發(fā)明結(jié)合分子和/或本發(fā)明免疫偶聯(lián)物分析生物試樣中B型流感病毒抗原的水平；并且[0166](b)比較B型流感病毒抗原的經(jīng)分析水平與對照水平，其中B型流感病毒抗原的經(jīng)分析水平與B型流感病毒抗原的對照水平相比增加指示B型流感病毒感染。[0167]生物試樣可為包括(但不限于)來自(潛在)受感染個體的血液、血清、糞便、痰、鼻咽吸出物、支氣管灌洗物、尿液、組織或其他生物材料的生物試樣或諸如水、飲料等非生物試樣。(潛在)受感染個體可為人類個體，且還可使用本發(fā)明的人類結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物測試疑為流感病毒載體的動物中病毒的存在。首先可操縱試樣以使其更適于檢測方法。操縱尤其意指以病毒將崩解成諸如蛋白質(zhì)、(多)肽或其他抗原片段等抗原組分的方式處理懷疑含有和/或含有病毒的試樣。優(yōu)選地，使本發(fā)明的人類結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物在一定條件下與試樣接觸，這些條件允許在人類結(jié)合分子與可能存在于試樣中的病毒或其抗原組分之間形成免疫復合物。隨后通過適宜手段檢測并測量指示試樣中存在病毒的免疫復合物(若有)的形成。此類方法尤其包括均質(zhì)性及異質(zhì)性結(jié)合免疫分析，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫熒光、免疫組織化學、FACS、BIACORE及蛋白質(zhì)印跡分析。[0168]尤其用于對患者血清及血液及血液源產(chǎn)物進行大規(guī)模臨床篩選的優(yōu)選分析技術(shù)是ELISA及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。尤其優(yōu)選為ELISA測試。在用作這些分析中的試劑時，將本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物便利地結(jié)合至微量滴定孔的內(nèi)表面。本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物可直接結(jié)合至微量滴定孔。然而，本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物與孔的最大結(jié)合可在添加本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物之前通過用多賴氨酸預處理孔來達成。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物可通過已知手段共價附著至孔。通常，使用濃度介于0.01μg/ml至100μg/ml之間的結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物用于涂覆,但還可使用更高以及更低量。然后將試樣添加至經(jīng)本發(fā)明結(jié)合分子或免疫偶聯(lián)物涂覆的孔。[0169]本發(fā)明進一步提供治療或預防個體的B型流感病毒感染的方法，包含向個體給予治療或預防有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫偶聯(lián)物和/或藥物組合物。在某些實施例中，個體是哺乳動物，優(yōu)選為人類。[0170]此外，本發(fā)明結(jié)合分子可用于鑒別流感病毒的具體結(jié)合結(jié)構(gòu)。結(jié)合結(jié)構(gòu)可為蛋白質(zhì)和/或多肽上的表位。其可為線性，且還可為結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象型。在一個實施例中，可藉助PEPSCAN分析來分析結(jié)合結(jié)構(gòu)(尤其參見WO84/03564、W093/09872、Slootstra等，1996)。或者，可針對能夠結(jié)合本發(fā)明結(jié)合分子的肽篩選包含來自流感病毒的蛋白質(zhì)的肽的隨機肽文庫。[0171]本發(fā)明進一步闡釋于以下實例及附圖中。這些實例不欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。[0172]SM[0173]實例I[0174]使用自記憶B細胞提取的RNA構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫。[0175]通過靜脈穿刺將周邊血液自正常健康供體采集于EDTA抗凝試樣管中。如WO2008/028946中所述獲得單鏈Fv(scFv)噬菌體展示文庫，該案件以引用方式并入本文中。利用菌落PCR使用側(cè)接經(jīng)插入VH-VL區(qū)的引物組檢查最終文庫的插入頻率(100-150個單菌落)。通常，超過95%的菌落顯示正確長度插入(參見表1)。使用菌落PCR產(chǎn)物進行隨后DNA序列分析以檢查序列變異并評價顯示完全ORF的菌落的百分比。這通常高于70%(參見表1)。還分析V基因突變的頻率。約95%序列不處于指示成熟過程的種系組態(tài)且與用作文庫的RNA源的B細胞的記憶表型一致。[0176]應(yīng)用兩輪PCR擴增方式，使用顯示于WO2008/028946中的引物組，以自對應(yīng)的供體譜分離免疫球蛋白VH及VL區(qū)。[0177]對對應(yīng)的cDNA的第一輪擴增分別產(chǎn)生VH、Vκ及Vλ區(qū)的約650個堿基對的7種、6種及9種產(chǎn)物。對于IgM記憶B細胞VH區(qū)擴增而言，組合使用OCM恒定引物(IgM恒定重鏈特異性)與OHl至0Η7。第一輪擴增的熱循環(huán)程序為:96°C持續(xù)2min(變性步驟)，96°C持續(xù)30sec/60°C持續(xù)30sec/72°C持續(xù)50sec維持35次循環(huán)，72°C持續(xù)1min進行最終延長及6°C冷凍。將產(chǎn)物加載于I%瓊脂糖凝膠上且使用凝膠提取管柱(Macherey-NageI,MN)自該凝膠分離這些產(chǎn)物并在50μI5mMTris-HCl(pH8.0)中洗脫。使10%第一輪產(chǎn)物(5μI)經(jīng)受第二輪擴增。利用限制位點延伸這些引物，從而使得能夠?qū)?yīng)的VL及VH區(qū)定向克隆至噬菌體展示載體roV-C06中。第二輪擴增的PCR程序如下:96°C持續(xù)2min(變性步驟)，96°C持續(xù)30sec/60°C持續(xù)30sec/72°C持續(xù)50sec維持30次循環(huán),72°C持續(xù)1min進行最終延長及6°C冷凍。首先將第二輪產(chǎn)物(約350個堿基對)加載于凝膠上且自瓊脂糖提取這些產(chǎn)物，如上文所述。然后根據(jù)免疫球蛋白基因產(chǎn)物中所發(fā)現(xiàn)J區(qū)段的天然出現(xiàn)匯集片段，從而對應(yīng)地產(chǎn)生VH、VK及Vλ可變區(qū)的7種、6種及9種匯集物，如表1及2中所示。[0178]為獲得免疫文庫中的免疫球蛋白序列的正規(guī)化分布，根據(jù)表1中所提及的百分比混合6種Vk與9種VA輕鏈匯集物。用SalI及NotI限制酶消化此單一最終VL匯集物(5μg)，將其加載于1.5%瓊脂糖凝膠(約350個堿基對)上且使用MN-提取管柱自該凝膠分離該匯集物且如下將其連接于經(jīng)Sal1-NotI切割的roV-C06載體(約5000個堿基對)中:500ngPDV-C06載體、70ngVL插入物、5μI1X連接緩沖液(NEB)、2.5Τ4DNA連接酶(400U/μI)(NEB)，且添加超純水直至總體積為50μI(載體對插入物的比率是1:2)。在16°C水浴中過夜實施連接。接下來，用水使體積加倍，用等體積酚-氯仿-異戊醇(75:24:1)(Invitrogen)萃取，之后進行氯仿(Merck)萃取，且在-20°C下用IμIPelletPaint(Novogen)UOμI乙酸鈉(3ΜpH5.0)及100μI異丙醇沉淀2hr。隨后在4°C下將所得試樣以20.0OOXg離心30min。用70%乙醇洗滌所得沉淀且在室溫下以20.000Xg離心10min。去除乙醇且將沉淀風干幾分鐘且隨后溶解于含有1mMTris-HCl(pH8.0)的50μI緩沖液中。使用2μI連接混合物使用設(shè)定在1.7kV、2000hm、25yF(時間常數(shù)為約4.5msec)的GenepulserII裝置(B1rad)在經(jīng)冷凍0.1cm電穿孔光析管(B1rad)中轉(zhuǎn)化40μITG-1電穿孔感受態(tài)(electro-competent)細胞(Agilent)。脈沖后,立即在37°C下用含有5%(w/v)葡萄糖(Sigma)的750μISOC培養(yǎng)基(Invitrogen)自光析管沖洗細菌且將其轉(zhuǎn)移至15ml圓底培養(yǎng)管中。使用另一750μISOC/葡萄糖自光析管沖洗殘余細菌且將其添加至培養(yǎng)管中。通過在37°C下在振蕩培育器中以220rpm準確地培養(yǎng)Ihr來回收細菌。將經(jīng)轉(zhuǎn)化細菌平鋪于240mm正方形大培養(yǎng)皿(NUNC)上，這些培養(yǎng)皿含有補充有50μg/ml氨節(jié)青霉素(ampicillin)及5%(w/v)葡萄糖(Sigma)的200ml2TY瓊脂(16g/l細菌用胰蛋白胨、10g/l細菌用酵母提取物、5g/lNaCl、15g/l瓊脂(pH7.0))。出于計數(shù)目的將I對1000及I對10.000稀釋物平鋪于含有相同培養(yǎng)基的15cm培養(yǎng)皿上。將此轉(zhuǎn)化程序依序重復20次且將完全文庫平鋪于總共10個正方形大培養(yǎng)皿上并在37°C培養(yǎng)爐中生長過夜。通常，使用上述方案獲得約lX107cfu。通過將細菌輕輕地刮至12ml2TY培養(yǎng)基/板中自板收獲中間VL輕鏈文庫。通過0D600測量測定細胞質(zhì)量且使用2X細菌的500OD使用兩個maxipr印管柱(MN)根據(jù)制造商說明書進行大量質(zhì)粒DNA制備。[0179]類似于VL可變區(qū)，首先將第二輪VH-JH產(chǎn)物混合在一起以獲得正規(guī)J區(qū)段使用分布(參見表2)，從而產(chǎn)生稱為PHl至PH7的7種VH子匯集物。使用表2中描述的百分比混合匯集物以獲得正規(guī)化序列分布，從而獲得一個VH部分，用SfiI及XhoI限制酶將其消化且連接于如上文所述獲得的Sfi1-XhoI切割的I3DV-VL中間文庫中。除所用240mm板的數(shù)目以外，TGl的連接裝配、純化方法、后續(xù)轉(zhuǎn)化及細菌的收獲準確地如針對VL中間文庫(參見上文)所述。對于最終文庫而言，使用20個板，從而產(chǎn)生約2X107cfu。利用菌落PCR使用側(cè)接經(jīng)插入VH-VL區(qū)的引物組檢查最終文庫的插入頻率(100-150個單菌落)。通常，超過95%的菌落顯示正確長度插入(參見表3)。使用菌落PCR產(chǎn)物進行隨后DNA序列分析以檢查序列變異并評價顯示完全ORF的菌落的百分比。這通常高于70%(參見表3)。還分析V基因突變的頻率。約95%序列不呈指示成熟過程的種系組態(tài)且與用作文庫的RNA源的B細胞的記憶表型一致。最終，使文庫復蘇并通過使用CT輔助噬菌體(參見WO02/103012)擴增且將其用于通過淘選方法進行噬菌體抗體選擇，如下文所述。[0180]實例2[0181]帶有抗B型流感的單鏈Fv片段的曬菌體的選擇。[0182]使用抗B型流感(B/0h1/01/2005、B/Florida/04/2006及B/Brisbane/60/2008)的重組血球凝集素(HA)的抗體噬菌體展示文庫實施選擇。在PBS(5.0μg/ml)中稀釋HA抗原，以每管2ml將其添加至MaxiSorp?Nunc-免疫管(Nunc)中，且在4°C下在旋轉(zhuǎn)輪上培育過夜。排空免疫管且用阻斷緩沖液(存于PBS中的2%脫脂乳粉(ELK))洗滌三次。隨后，用阻斷緩沖液完全填充免疫管且在室溫下培育l_2hr。在室溫下將噬菌體展示文庫的等分試樣(350-500μ1，使用CT輔助噬菌體(參見WO02/103012)擴增)在阻斷緩沖液(任選地:補充有10%未加熱不活化胎牛血清及2%小鼠血清)中阻斷1-2hr。將阻斷噬菌體文庫添加至免疫管中，在室溫下培育2hr，且用洗滌緩沖液(存于PBS中的0.05%(v/v)Tween-20)洗滌，以去除未結(jié)合噬菌體。通過在室溫下與Iml10mM三乙胺(TEA)—起培育1min自對應(yīng)的抗原洗脫經(jīng)結(jié)合噬菌體。隨后，混合經(jīng)洗脫噬菌體與0.5mlIMTris-HClpH7.5以中和pH。使用此混合物感染已在37°C下生長至約0.3的OD600nm的5mlXLl-Blue大腸桿菌培養(yǎng)物。在37°C下使噬菌體感染XLl-Blue細菌30min。然后，在室溫下將混合物以3000Xg離心1min且將細菌沉淀再懸浮于0.5ml2-胰蛋白胨酵母提取物(2TY)培養(yǎng)基中。將所得細菌懸浮液劃分于兩個補充有四環(huán)素(tetracycline)、氨芐青霉素及葡萄糖的2TY瓊脂板上。在使板在37°C下培育過夜后，自板刮出菌落且使用其來制備富集噬菌體文庫，基本上如DeKruif等人(1995a)及WO02/103012中所述。簡言之，使用刮出細菌來接種含有氨芐青霉素、四環(huán)素及葡萄糖的2TY培養(yǎng)基且使其在37°C的溫度下生長至約0.3的OD600nm。添加CT輔助噬菌體且使其感染細菌，此后將培養(yǎng)基更換成含有氨芐青霉素、四環(huán)素及卡那霉素的2TY。在30°C下持續(xù)培育過夜。第二天，通過離心自2TY培養(yǎng)基去除細菌，此后使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl使培養(yǎng)基中的噬菌體沉淀。最終，將噬菌體溶解于具有1%牛血清白蛋白(BSA)的2mlPBS中，過濾滅菌且用于下一輪選擇。對相同HA亞型或?qū)Σ煌瑏喰偷腍A實施第二輪選擇。[0183]實施連續(xù)兩輪選擇，然后分離個別單鏈噬菌體抗體。在第二輪選擇后，使用個別大腸桿菌菌落來制備單株噬菌體抗體?；旧鲜箓€別菌落以96孔板形式生長至對數(shù)期且用VCS-Ml3輔助噬菌體感染，此后過夜產(chǎn)生噬菌體抗體。含有噬菌體抗體的上清液直接用于ELISA中用于結(jié)合HA抗原。或者，使噬菌體抗體經(jīng)PEG/NaCl沉淀且過濾滅菌以用于ELISA與流式細胞術(shù)分析(通常用在ELISA中呈陽性的純系進行)。[0184]實例3[0185]HA特異性單鏈噬菌體抗體的確認[0186]在ELISA中確認在上述篩選中獲得的含有單鏈噬菌體抗體的所選上清液的特異性，即結(jié)合不同HA抗原。出于此目的，將表達桿狀病毒的重組B型流感HA(B/0h1/01/2005、B/Malaysia/2506/2004、B/Jilin/20/2003、B/Brisbane/60/2008及B/Florida/04/2006)(ProteinSciences,CT,USA)涂覆(0.5μg/ml)至Maxisorp?ELISA板上。在涂覆后，用含有0.1%v/vTween-20的PBS將板洗滌三次且在室溫下在含有2%ELK的PBS中阻斷Ihr0將所選單鏈噬菌體抗體在含有4%ELK的等體積PBS中培育lhr，以獲得經(jīng)阻斷噬菌體抗體。將板排空，用PBS/0.1%Tween-20洗滌三次且將經(jīng)阻斷單鏈噬菌體抗體添加至孔中。培育一小時；用PBS/0.1%Tween-20將板洗滌五次。使用偶聯(lián)至過氧化物酶的抗M13抗體檢測(使用OD492nm測量)經(jīng)結(jié)合噬菌體抗體。作為對照，同時不利用單鏈噬菌體抗體及利用無關(guān)陰性對照單鏈噬菌體抗體實施程序。[0187]自用免疫文庫對不同HA抗原進行選擇，獲得14種對Yamagata樣與Victoria樣B型流感HA二者具有特異性的獨特單鏈噬菌體抗體(sc08-031、sc08-032、sc08_033、sc08_034、sc08_035、sc08_059、scl0-023、scl0-032、scl0-049、scl0-051、scll-035、scll-036、scll-038及scll-039)。參見表4。[0188]使用該14種噬菌體抗體來構(gòu)建完全人類免疫球蛋白以供進一步表征(參見實例4)。[0189]實例4[0190]自所選單鏈Fv構(gòu)建完全人類免疫球蛋白分子(人類單克隆抗體)[0191]自所選特異性單鏈噬菌體抗體(scFv)純系，獲得質(zhì)粒DNA且使用標準測序技術(shù)測定核苷酸序列。使用MGT/V-QUEST搜索頁(Brochet，等人(2008))確定scFv的VH及VL基因一致性(參見表5)。[0192]通過限制性消化(Sfil/Xhol)克隆scFv的重鏈可變區(qū)(VH)以供在用相同酶消化的IgG表達載體pIg-C911-HCYI中表達。還使用用于插入片段的Sall/Notl及用于靶載體的Xhol/Notl將輕可變區(qū)(VL)克隆至其IgG指定表達載體pIG-C909-CK或pIg-C910_Cλk中，如先前于WO2008/028946中所述。[0193]為去除一種抗體(CR8059)中的潛在去酰胺位點，通過裝配PCR產(chǎn)生單一氨基酸突變抗體(CR8071)。產(chǎn)生兩個各自含有期望突變的重疊PCR片段。將這些片段以等摩爾比率混合且在第二輪PCR中用作模板以獲得全長LC序列。使用標準測序技術(shù)確認所有構(gòu)建體的核苷酸序列。將編碼人類IgGl重鏈及輕鏈的所得表達構(gòu)建體一起在HEK293T細胞中瞬時表達。一周后，獲得含有人類IgGl抗體的上清液且使用標準純化程序處理。針對B型流感HA抗原在介于10μg/ml至0.003μg/ml之間的濃度范圍中滴定人類IgGl抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。包括無關(guān)抗體作為對照抗體。[0194]所選免疫球蛋白分子的重鏈及輕鏈二者的CDR的氨基酸序列于表5中給出。重鏈及輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列及氨基酸序列于下文給出。[0195]實例5[0196]抗B型流感IgG的交叉結(jié)合反應(yīng)性[0197]使用所選抗B型流感抗體通過FACS分析來測試結(jié)合寬度。出于此目的，使用脂質(zhì)體(Iipofectamin)(Invitrogen)以I對5的比率將編碼HA的全長重組B型流感表達載體(B/Mississippi/04/2008、B/Houston/B60/1997、B/Nashville/45/1991、B/Florida/01/2009、B/Mississippi/07/2008及B/0h1/01/2005)轉(zhuǎn)染至PER.C6*細胞中。轉(zhuǎn)染后48小時，通過FACS(CantoII，BDb1science)分析在表面上表達B型流感HA的PER.C6?細胞。對此，將細胞與IgG抗體一起培育I小時，之后用含有0.1%BSA的PBS實施三個依序洗滌步驟。使用也培育I小時的PE-偶聯(lián)二級抗人類抗體檢測結(jié)合抗體。作為陰性對照，使用未經(jīng)轉(zhuǎn)染PER.C6K細胞且將其與二級抗體一起培育。FACS結(jié)果顯示，B型流感結(jié)合抗體CR8033、CR8059、CR8071、CR10032及CR10051顯示結(jié)合所有6種所測試B型流感HA(表6)。[0198]實例6[0199]競爭結(jié)合交叉反應(yīng)性抗B型流感IgG的HA[0200]確認上述抗B型流感IgG抗體競爭B型流感HA上的表位。對此，使用EZ-連接磺基-NHS-LC-LC-生物素試劑盒(Pierce)用生物素標記B/Brisbane/60/2008、B/Florida/04/2006及B/Jillin/20/2003。將1μI10mM生物素溶液(其是6倍摩爾過量的生物素)添加至110μg重組HA中，且在室溫下培育30至40分鐘。使用Amicon超離心過濾器(0.5ml，1KUltracel-1OK膜；Millipore,目錄編號:UFC501096)去除游離未納入生物素。對此，將試樣(300μI)加載于管柱上且在埃彭道夫臺式離心機(Eppendorftabletopcentrifuge)(20800rcf)中以14000RPM旋轉(zhuǎn)10分鐘。丟棄流動槽且將0.4mlDPBS緩沖液加載于管柱上并再次旋轉(zhuǎn)。將此步驟重復兩次。通過倒置管柱將經(jīng)標記試樣回收至新收集管中；然后加載200μ1DPBS并在臺式離心機中以1000rpm旋轉(zhuǎn)I分鐘。使用NanodropND-1000裝置(ThermoScientific)測量HA濃度。[0201]使用在室溫下在動態(tài)緩沖液中預先潤濕30分鐘的經(jīng)抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)涂覆的生物傳感器(ForteB1,目錄編號為18-5019)根據(jù)表7中的設(shè)定在Octet-QK生物層干涉儀(ForteB1)上進行實際競爭實驗。當?shù)诙贵w在第一抗體存在下能夠結(jié)合B型流感HA時，認為此無競爭性(參見表8)。作為對照，使用主干結(jié)合抗體CR9114(如共同待決申請案EP11173953.8中所述)及不結(jié)合抗體CR8057(如WO2010/130636中所述)。[0202]抗體CR10023及CR10049與CR8033競爭結(jié)合?？贵wCR10032及CR10051與CR8059競爭結(jié)合?？贵wCR10049與CR10032競爭結(jié)合。所測試抗體皆不與主干結(jié)合抗體CR9114競爭。這些結(jié)果指示，B型流感HA上存在至少3至4個不同表位(圖1)。[0203]實例7[0204]IgG的交叉中和活性[0205]為確定所選IgG是否能夠阻斷多種B型流感株，實施體外病毒中和分析(VNA)。對在MDCK細胞培養(yǎng)基(補充有20mMHepes及0.15%(w/v)碳酸氫鈉的MEM培養(yǎng)基(完全MEM培養(yǎng)基)，補充有10%(v/v)胎牛血清)中培養(yǎng)的MDCK細胞(ATCCCCL-34)實施VNA。將用于分析中的B型流感Yamagata樣(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria樣(B/Malaysia/2506/2004及B/Brisbane/60/2008)株全部稀釋至5.7X13TCID50/ml(50%組織培養(yǎng)感染劑量/ml)的滴定度,其中根據(jù)Spearman及Karber的方法計算滴定度。將IgG制劑(lOOμg/ml)于一式四份孔中連續(xù)2倍稀釋(1:2-1:512)于完全MEM培養(yǎng)基中。將50μI各別IgG稀釋物與50μI病毒懸浮液(100TCID50/35μI)混合且在37°C下培育lhr。然后將懸浮液以一式四份轉(zhuǎn)移至含有存于100μI完全MEM培養(yǎng)基中的鋪滿MDCK培養(yǎng)物的96孔板中。在使用前，將MDCK細胞以2Χ14個細胞/孔接種于MDCK細胞培養(yǎng)基中，使其生長直至細胞已達到鋪滿，用300-350μIPBS(pH7.4)洗滌且最終將100μI完全MEM培養(yǎng)基添加至各孔中。在37°C下將所接種細胞培養(yǎng)3_4天且每天觀察致細胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)展。比較CPE與陽性對照。[0206]CR8032、CR8033、CR8034、CR8035、CR8059、CR8071、CR10023、CR10032、CR10049、CR10051、CR11035、CR11036、CR11038及CR11039全部顯示對Yamagata及Victoria樣B型流感病毒株二者的代表株的交叉中和活性。參見表9。[0207]實例8[0208]IgG的受體結(jié)合阻斷活性[0209]為確定所選IgG是否能夠阻斷受體介導的B型流感株與宿主細胞的結(jié)合，實施血球凝集抑制(HI)分析。將B型流感Yamagata樣(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria樣(B/Malaysia/2506/2004及B/fcisbane/60/2008)病毒株稀釋至8個HA單位(如在HAU分析中所測定)，且與等體積連續(xù)稀釋的IgG組合并在室溫下培育lhr。將等體積的0.5%火雞紅血球(TRBC)添加至孔中，并持續(xù)培育30min。對扣狀物形成(Buttonformat1n)評分作為血球凝集的證據(jù)。[0210]CR8059、CR8071、CR10032、CR10051及CRl1036不顯示對任何所測試B型流感病毒株的HI活性(CR11036>10yg/ml，其他抗體>50μg/ml)，從而指示，其不阻斷受體結(jié)合?？贵wCR8033及CR10023顯示對僅Yamagata-而非Victoria樣B型流感病毒株的代表株的HI活性?？贵wCRl1035顯示對僅Victoria-而非Yamagata樣B型流感病毒株的代表株的HI活性?？贵wCR10049、CR11038及CR11039顯示對Yamagata與Victoria樣B型流感病毒株二者的代表株的HI活性。參見表10。[0211]可替代地，設(shè)計免疫熒光進入分析來分析給定抗體阻斷病毒的受體結(jié)合及內(nèi)在化的能力。因此，預培育病毒與連續(xù)兩倍稀釋步驟中的抗體，然后將其于感染培養(yǎng)基(DMEM+200mM谷氨酰胺)中添加至平鋪于96孔盤中的鋪滿單層MDCK細胞并保持2至3小時。隨后去除接種物并用所示濃度的抗體替代并在37°C、5%C02下保持16-18hr。此后，去除上清液并將板在80%丙酮中固定以供隨后通過使用小鼠單株抗NP—級抗體(SantaCruz,sc-52027)及Alexa488_偶合抗小鼠二級抗體(InvitrogenA11017)標記感染細胞、之后用DAPI標記細胞核實施免疫熒光檢測(參見圖2a)。如利用HI分析所發(fā)現(xiàn)，抗體CR8033特異性阻斷Yamagata樣病毒B/Florida/04/2006而非Victoria樣病毒B/Malaysia/2506/2004的病毒進入?？贵wCR8059不阻斷所測試B型流感病毒的進入。隨后使用BDPathway855生物成像器分析一些板。為評價進入抑制程度,使用BDPathway成像分析工具分析每給定孔高于界定背景的熒光強度及感染細胞(使用DAPI染色來界定細胞)的量。經(jīng)抗體的所示稀釋物處理的感染細胞與經(jīng)不結(jié)合對照抗體處理的感染細胞相比的百分比展示于圖2b中。[0212]實例9[0213]抗HAIgG的釋出抑制[0214]為研究抗體的作用機制，設(shè)計釋出分析來分析在抗體處理條件下感染后IShr病毒粒子釋放至上清液中的量。在此類上清液的凝膠電泳、之后蛋白質(zhì)印跡后檢測到(或不存在)抗HA信號視為存在(或不存在)所釋放病毒粒子的指示。[0215]在實驗前4小時，將40，000個MDCK細胞/孔于DMEM/谷氨酰胺中接種至96孔板中。在單獨實驗中滴定達成90%-100%感染所需病毒量。將所需量病毒添加至細胞且在37°C,5%CO2下培育。3小時后，去除上清液并用PBS將細胞洗滌三次以去除未內(nèi)在化病毒粒子。用含有mAb(以20μg/ml開始的連續(xù)稀釋物)的感染培養(yǎng)基補充細胞。在37°C、5%0)2下16-18hr后，收獲上清液并溶解剩余細胞(TrisHClpH7.5,150mMNaCl,5mMEDTA,I%(v/v)Triton-X)。使試樣經(jīng)受SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡以分析釋放至上清液中的病毒粒子的量，如通過使用兔多克隆抗HA染色(ProteinSciences)、之后HRP-偶合抗兔F(ab，)2_片段(JacksonTmmunoResearchLaboratories,111-036-047)使WB顯影所測量。如圖3中所示，抗體CR8033與CR8059二者皆以濃度依賴性方式抑制病毒粒子的釋放。其他實驗已顯示，至少CR8071及CR10051也抑制病毒粒子的釋放。[0216]通過用80%丙酮固定以相同方式處理的孔來檢查對細胞的適當感染。使用免疫熒光標記利用小鼠單株抗NP—級抗體(SantaCruz,sc-52027)及Alexa488_偶合抗小鼠二級抗體(InvitrogenA11017)來評價感染量。隨后使用BDPathway855生物成像器分析板(結(jié)果未顯示)。[0217]實例10[0218]B型流感感染細胞的掃描電子顯微術(shù)[0219]在實驗前一天將MDCK細胞接種于玻璃蓋玻片上。第二天，用不同量的病毒感染細胞以確定在感染后18hr產(chǎn)生90%-100%感染細胞的量。初始感染后三小時，去除上清液；用PBS將細胞洗滌三次，然后添加含有所示濃度抗體的培養(yǎng)基。再經(jīng)過15-18hr后，去除細胞培養(yǎng)基且將細胞在2.5%戊二醛緩沖液中固定并儲存在4°C下直至進一步分析。使用戊二醛(GA)和/或四氧化鋨(0s04)將試樣進一步化學固定。在SEM成像前，使樣品經(jīng)受丙酮去水及臨界點干燥。最終，將細胞封固于氧化鋁平臺(aluminastub)上并用碳薄層涂覆且在ZeissUltra55SEM顯微鏡中檢查。[0220]與未受感染對照(圖4a)相比，B型流感感染的MDCK細胞的表面覆蓋有電子致密球形粒子(圖4b)。與抗體CR8059—起培育不會阻止這些球形粒子的形成(圖4c)，而與抗體CR8033—起培育顯著減少粒子的形成(圖4d)。與CR8059培育的細胞相比，在CR8033培育的細胞上不能容易地檢測到出芽病毒粒子(圖4e及f)。[0221]實例U[0222]人類IgG單克隆抗體體內(nèi)抗致命性B型流感攻擊的預防活性[0223]實施研究以測試單克隆抗體CR8033及CR8071體內(nèi)抗兩種B型流感病毒的致命性攻擊的預防效應(yīng)。在小鼠致命性攻擊模型中利用適應(yīng)小鼠的B型流感/Florida/04/2006病毒測試mAbCR8033及CR8071的預防功效。使B/Florida/04/2006病毒在5次肺至肺傳代后適應(yīng)小鼠。使適應(yīng)小鼠的B型流感第5次傳代病毒在含胚雞蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周齡，η=8只/組)適應(yīng)并維持至少4天時間，然后開始實驗。于攻擊前第-1天將mAbCR8033及CR8071以0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.7mg/kg及5mg/kg經(jīng)靜脈內(nèi)給予至尾靜脈(尾骨肌靜脈)中，假定每只小鼠平均重量為18g且固定劑量體積為0.2ml。同時向?qū)φ战M給予媒介物對照。然后于第O天通過鼻內(nèi)接種用25LD5tl適應(yīng)小鼠的B/Florida/04/2006B型流感病毒攻擊小鼠。圖5顯示在給予mAb后小鼠的存活率。向小鼠給予劑量低至0.2mg/kg的CR8033及0.6mg/kg的CR8071顯示顯著高于媒介物治療對照動物的存活率。[0224]或者，在小鼠致命性攻擊模型中利用適應(yīng)小鼠的B型流感/Malaysia/2506/2004病毒測試mAbCR8033及CR8071的預防功效。使B/Malaysia/2506/2004病毒在4次肺至肺傳代后適應(yīng)小鼠。使適應(yīng)小鼠的B型流感第4次傳代病毒在含胚雞蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周齡，n=8只/組)適應(yīng)并維持至少4天時間，然后開始實驗。于攻擊前第_1天將MAbCR8033及CR8071以0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、l.7mg/kg及5mg/kg經(jīng)靜脈內(nèi)給予尾靜脈(尾骨肌靜脈)中，假定每只小鼠平均重量為18g且固定劑量體積為0.2ml。同時向?qū)φ战M給予媒介物對照。然后于第O天通過鼻內(nèi)接種用25LD5Q適應(yīng)小鼠的B/Malaysia/2506/2004B型流感病毒攻擊小鼠。圖5顯示在給予mAb后小鼠的存活率。向小鼠給予劑量低至0.2mg/kg的CR8033及0.6mg/kg的CR8071顯示顯著高于媒介物治療對照動物的存活率。[0225]這些結(jié)果顯示，如本文所鑒別及研發(fā)的人類抗流感抗體CR8033及CR8071當于感染前一天分別以等于或高于0.2mg/kg或0.6mg/kg劑量給予時,能夠提供針對B/Yamagata與B/Victoria譜系二者的B型流感病毒的致命性劑量的體內(nèi)保護。[0226]表1:第二輪VL區(qū)擴增概述[0227][0228]【權(quán)利要求】1.一種結(jié)合分子，該結(jié)合分子能夠特異性結(jié)合B/Yamagata和B/Victoria譜系的B型流感病毒株的血球凝集素(HA)并且能夠中和該B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的所述B型流感病毒株，其中該結(jié)合分子不結(jié)合A型流感病毒的HA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子結(jié)合B型流感病毒的該HA蛋白質(zhì)的頭部區(qū)域、特別是B型流感病毒的HAl的頭部區(qū)域。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:71中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%-,91%-,92%-,93%-,94%-,95%-,96%-,97%-,98%-,99%或更聞序列致性的氣基Ife序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:73中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含含有該氨基酸序列SEQIDNO:71的重鏈可變區(qū)以及含有該氨基酸序列SEQIDNO:73的輕鏈可變區(qū)。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:75中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%-,91%-,92%-,93%-,94%-,95%-,96%-,97%-,98%-,99%或更聞序列致性的氣基Ife序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:77中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含含有該氨基酸序列SEQIDNO:75的重鏈可變區(qū)以及含有該氨基酸序列SEQIDN0:77的輕鏈可變區(qū)。9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含由氨基酸序列SEQIDN0:78組成的重鏈可變區(qū)以及由氨基酸序列SEQIDNO:79組成的輕鏈可變區(qū)。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:113中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%-,91%-,92%-,93%-,94%-,95%-,96%-,97%-,98%-,99%或更聞序列致性的氣基Ife序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:115中所述的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有至少或至少約80%、90%-,91%-,92%-,93%-,94%-,95%-,96%-,97%-,98%-,99%或更聞序列致性的氣基Ife序列。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子包含含有該氨基酸序列SEQIDNO:113的重鏈可變區(qū)以及含有該氨基酸序列SEQIDNO:115的輕鏈可變區(qū)。13.—種結(jié)合分子，該結(jié)合分子與根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的結(jié)合分子免疫特異性競爭結(jié)合B型流感病毒HA蛋白質(zhì)上的表位。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子抑制B型流感病毒自受感染細胞的釋出。15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子是人類單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。16.一種免疫偶聯(lián)物，包含至少一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合分子并且進一步包含至少一種標簽。17.一種對根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的結(jié)合分子進行編碼的核酸分子。18.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的結(jié)合分子、根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫偶聯(lián)物和/或根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸分子，用作藥劑，優(yōu)選用于診斷、預防和/或治療由B型流感病毒引起的流感感染。19.一種根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的結(jié)合分子的功能變體。20.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的結(jié)合分子和/或根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫偶聯(lián)物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。21.一種檢測B型流感病毒感染的方法，包括:(a)使用根據(jù)權(quán)利要求1至15所述的結(jié)合分子和/或根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫偶聯(lián)物分析生物試樣中B型流感病毒抗原的水平；并且(b)比較B型流感病毒抗原的該經(jīng)分析水平與對照水平，其中B型流感病毒抗原的該經(jīng)分析水平與該B型流感病毒抗原的該對照水平相比增加，則指示B型流感病毒感染?！疚臋n編號】C07K16/10GK104169298SQ201380012721【公開日】2014年11月26日申請日期:2013年3月7日優(yōu)先權(quán)日:2012年3月8日【發(fā)明者】T·H·J·克瓦克斯,R·福格爾斯申請人:克魯塞爾荷蘭公司