靶向突變體α-螺旋束細(xì)胞因子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子，其具有與α-螺旋束細(xì)胞因子受體降低的活性，其中所述α-螺旋束細(xì)胞因子被特異地遞送至靶細(xì)胞。優(yōu)選地，所述α-螺旋束細(xì)胞因子是突變體，更優(yōu)選地是突變體干擾素，其對(duì)干擾素受體具有低親和力，其中所述突變體干擾素被特異地遞送至靶細(xì)胞。通過將該經(jīng)修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子與靶向部分(優(yōu)選抗體)融合來實(shí)現(xiàn)靶向。本發(fā)明還涉及使用這樣的靶向修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子治療疾病。優(yōu)選實(shí)施方案是使用靶向突變體干擾素治療疾病，優(yōu)選病毒性疾病和腫瘤。
【專利說明】靶向突變體α-螺旋束細(xì)胞因子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子，其具有通過α-螺旋束細(xì)胞因子受體 的降低的活性，其中所述α-螺旋束細(xì)胞因子被特異地遞送至靶細(xì)胞。優(yōu)選地，所述螺 旋束細(xì)胞因子是突變體，更優(yōu)選地是突變體干擾素，其對(duì)千擾素受體具有低親和力，其中所 述突變體干擾素被特異地遞送至靶細(xì)胞。通過將經(jīng)修飾的 α-螺旋束細(xì)胞因子與靶向部分 (優(yōu)選抗體）融合來實(shí)現(xiàn)靶向。本發(fā)明還涉及使用這樣的經(jīng)靶向修飾的α_螺旋束細(xì)胞因 子來治療疾病。優(yōu)選實(shí)施方案是使用靶向突變體干擾素治療疾病，優(yōu)選病毒性疾病和腫瘤。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞因子是一類在細(xì)胞間通訊中起重要作用的小分子蛋白質(zhì)?？梢曰谄浣Y(jié)構(gòu)將 細(xì)胞因子分類，最大的一類是四股α-螺旋束家族?；谑荏w的使用，可以將該家族進(jìn)一步 分為干擾素（IFN)和白細(xì)胞介素（IL)-2, -3, -10和-12亞家族。α螺旋束細(xì)胞因子作為 潛在的用于治療人類疾病的生物藥具有重要性；非限制性例子有，紅細(xì)胞生成素被用于治 療貧血癥或紅細(xì)胞缺乏癥，生長(zhǎng)激素（somatotropin)用于治療生長(zhǎng)素缺乏癥，以及白細(xì)胞 介素 -2用于治療癌癥。
[0003] 在α -螺旋束細(xì)胞因 子中，I型IFNs屬于具有重要生物學(xué)功能的細(xì)胞因子家族。 在人類中，有17種不同的I型IFNs(13a，β，ε，κ，ω)，它們通過遍在表達(dá)的、由IFNAR1 和IFNAR2兩條鏈組成的細(xì)胞表面受體來傳遞信號(hào)。IFN受體復(fù)合物的組裝起始幾個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)路徑的激活，依據(jù)細(xì)胞類型，這些路徑改變細(xì)胞的分化和/或功能。
[0004] 通過對(duì)幾乎所有細(xì)胞類型起作用，I型IFN可以阻止生產(chǎn)性病毒感染。此外，它還 表現(xiàn)出顯著的抗血管生成和促凋亡效果。I型IFNs也深度參與先天性和獲得性免疫的幾 個(gè)功能的調(diào)節(jié)以及骨穩(wěn)態(tài)。它特別是在樹突細(xì)胞和破骨細(xì)胞的激活/分化中起作用。事實(shí) 上，I型IFN系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物的健康至關(guān)重要。
[0005] 在小鼠中的臨床前研究已確立了 I型IFN治療病毒或腫瘤疾病的顯著功效。值 得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)，通過IFN治療治愈實(shí)驗(yàn)性腫瘤的小鼠可免疫抵抗最初的腫瘤，表明 IFN不僅引起腫瘤排除過程，而且也打破對(duì)腫瘤的免疫耐受。基于這些研究，IFN α被批準(zhǔn) 臨床用于治療病毒性感染和癌癥。更為近來，發(fā)現(xiàn)ΙΡΝβ在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化中有效， 并也被批準(zhǔn)用于該病況。不幸的是，常常發(fā)現(xiàn)IFN的臨床功效令人失望，如今，其它治療策 略例如特異的抗病毒化合物、化療和單克隆抗體，如果可能的話，已經(jīng)在很大程度上取代了 IFN的廣譜應(yīng)用。如今，IFN僅是HBV和HCV慢性感染和有限種類腫瘤的一線治療選擇。
[0006] 由于顯著的全身性毒性和副作用，包括類流感綜合癥、抑郁癥、肝中毒、自身免疫 疾病、甲狀腺功能不全和體重下降，I型IFN在臨床實(shí)踐中的功效受限于無效的給藥。由此， 非常值得將IFN活性僅靶向應(yīng)該被IFN治療的（例如，感染的器官或腫瘤團(tuán)塊）或應(yīng)該被 IFN激活的（例如，免疫細(xì)胞子集）細(xì)胞群體。
[0007] 為了解決或限制細(xì)胞因子的全身性毒性，有人提議通過抗體-細(xì)胞因子融合蛋白 進(jìn)行細(xì)胞因子的特異性靶向（Ortiz-Sanchez等，2008)。Rossi等（2009)詳細(xì)公開了 CD20 靶向的四聚體IFNa及其在B細(xì)胞淋巴瘤治療中的使用。然而，融合體保留了其生物學(xué)活 性，并甚至比商業(yè)的聚乙二醇化IFN活性更強(qiáng)，這意味著在人類治療中不需要的副作用將 仍然會(huì)存在，并甚至更嚴(yán)重。本專利申請(qǐng)公開了作為靶向部分的抗體與野生型IFN、以及與 突變的IFN的融合體。然而，據(jù)說IFN片段應(yīng)該保留其至少80%水平或甚至比野生型IFN 更高水平的內(nèi)源活性。同樣，在該情況下，融合體保留不需要的野生型的副作用。
[0008] 令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，可以將經(jīng)修飾的、對(duì)a -螺旋束細(xì)胞因子受體具有降低 的親和力和由此具有降低的特異生物活性的a -螺旋束細(xì)胞因子與靶向部分融合，其中針 對(duì)靶細(xì)胞，生物活性被恢復(fù)，但針對(duì)不被構(gòu)建體靶向的細(xì)胞，生物活性不被恢復(fù)。這樣的構(gòu) 建體具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)，其具有較小副作用，特別是較低的全身性毒性，而保留了對(duì)抗靶細(xì)胞的 生物活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是靶向構(gòu)建體，其包含經(jīng)修飾的a-螺旋束細(xì)胞因子和靶向 部分，其中該細(xì)胞因子的特征是對(duì)a-螺旋束細(xì)胞因子受體具有降低的親和力。a-螺旋 束細(xì)胞因子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，其包括但不限于心肌營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子NNT- 1，睫狀神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞集落刺激因 子，心肌營(yíng)養(yǎng)素 -1，紅細(xì)胞生成素，F(xiàn)LT3配體，生長(zhǎng)激素，干擾素 a_l，2,4,5,6,7,8,10,13， 14，16，17,21，干擾素 0，干擾素 ￥，干擾素 1^,干擾素 8，干擾素 1：1，干擾素〇-1，白細(xì)胞 介素 2, 3,4, 5,6, 7,9,10,11，12 a 鏈，13,15,19, 20, 21，22, 23, 24, 26,27,28A，29,31，干細(xì) 胞因子，瘦蛋白，白血病抑制因子，制瘤素 M，催乳素以及促血小板生成素。關(guān)于a-螺旋束 細(xì)胞因子的綜述，見Conklin (2004)。經(jīng)修飾的a -螺旋束細(xì)胞因子是指，該a -螺旋束細(xì) 胞因子已被改變從而具有改變了的對(duì)受體的親和力，最終結(jié)果是相比于與受體正常結(jié)合的 內(nèi)源野生型細(xì)胞因子，經(jīng)修飾的a -螺旋束細(xì)胞因子對(duì)受體具有降低的親和力和由此降低 的生物學(xué)活性。這樣的修飾可以是降低正常野生型細(xì)胞因子的活性的修飾，或可以是增加 同源的非內(nèi)源a-螺旋束細(xì)胞因子的親和力（例如但不限于小鼠 a-螺旋束細(xì)胞因子，其 與人a-螺旋束細(xì)胞因子受體結(jié)合）。修飾可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何降低或增加 活性的修飾，包括但不限于化學(xué)和/或酶學(xué)修飾，例如聚乙二醇化和糖基化、與其它蛋白質(zhì) 融合、以及突變。優(yōu)選地，這樣的修飾是突變，更優(yōu)選地，修飾是降低 a_螺旋束細(xì)胞因子的 親和力的突變。本文中，降低的親和力和由此降低的生物學(xué)活性是指，相比于與受體正常結(jié) 合的a-螺旋束細(xì)胞因子，經(jīng)修飾的a-螺旋束細(xì)胞因子具有低于該a-螺旋束細(xì)胞因子 生物學(xué)活性的70%、更優(yōu)選低于該a -螺旋束細(xì)胞因子生物學(xué)活性的60%、更優(yōu)選低于該 a -螺旋束細(xì)胞因子生物學(xué)活性的50%、更優(yōu)選低于該a -螺旋束細(xì)胞因子生物學(xué)活性的 40%、更優(yōu)選低于該a -螺旋束細(xì)胞因子生物學(xué)活性的30%、更優(yōu)選低于該a -螺旋束細(xì)胞 因子生物學(xué)活性的20%、最優(yōu)選低于該a -螺旋束細(xì)胞因子生物學(xué)活性的10%的生物學(xué)活 性。優(yōu)選地，經(jīng)修飾的a-螺旋束細(xì)胞因子是野生型a-螺旋束細(xì)胞因子的突變體，其活性 與野生型a-螺旋束細(xì)胞因子相比較?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何方法測(cè)定親和 力和/或活性。優(yōu)選地，通過測(cè)定和定量STAT磷酸化，測(cè)量活性。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是靶向構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含突變體IFN和靶向部 分，該突變體IFN的特征是具有與IFN受體降低的親和力。IFN可以是任何IFN，包括但不 限于IFNa、IFN3和ω。本文中使用的突變體IFN可以是任何具有與受體較低的親和力 和由此較低的抗增殖活性和/或較低的抗病毒活性的突變體形式。事實(shí)上，如Piehler等 (2000)所揭示的，相對(duì)親和力與相對(duì)抗增殖活性以及與相對(duì)抗病毒活性直接相關(guān)?？梢酝?過如Brecht (1993)等所描述的在流過條件（flow through conditions)下，以反射干涉光 譜法測(cè)定，相比于野生型IFN對(duì)受體的親和力，突變體IFN對(duì)受體的親和力。突變體可以是 點(diǎn)突變體、缺失或插入突變體，或它們的組合。優(yōu)選地，通過活性誘變（例如，但不限于通過 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行定點(diǎn)誘變），獲得所述突變體IFN。優(yōu)選地，所述突變體IFN具有 低于野生型IFN的生物學(xué)活性70%、更優(yōu)選低于野生型IFN的生物學(xué)活性60%、更優(yōu)選低 于野生型IFN的生物學(xué)活性50%、更優(yōu)選低于野生型IFN的生物學(xué)活性40%、更優(yōu)選低于 野生型IFN的生物學(xué)活性30%、更優(yōu)選低于野生型IFN的生物學(xué)活性20%、最優(yōu)選低于野 生型的生物學(xué)活性10%的生物學(xué)活性，其中所述野生型IFN為突變體IFN的來源IFN(即， 其編碼序列被突變來獲得突變體IFN的野生型IFN)。IFN的突變體形式為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所知曉。作為一個(gè)非限定性例子，Piehler等（2000)中列出了 IFNa2突變體。優(yōu)選地， 所述IFN是I型IFN。更優(yōu)選地，所述突變體是IFN a，更優(yōu)選地，所述突變體是IFN a 2。 更優(yōu)選地，所述IFN a 2突變體在區(qū)域144-154、優(yōu)選在位置148,149和/或153的一個(gè)或 多個(gè)氨基酸上被突變，更優(yōu)選地，所述IFN a 2突變體選自IFN a 2L153A，IFN a 2R149A和 IFN a 2M148A。最優(yōu)選地，所述突變體選自IFN a 2L153A和IFN a 2R149A。
[0011] 優(yōu)選地，所述受體是IFNAR2。
[0012] 優(yōu)選地，所述靶向部分靶向在表達(dá)IFN受體的細(xì)胞，優(yōu)選表達(dá)IFNAR2的細(xì)胞上表 達(dá)的標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶向部分針對(duì)組織特異性標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述 組織是癌癥組織。所述癌癥可以是任何癌癥，包括但不限于B細(xì)胞淋巴癌、肺癌、乳腺癌、結(jié) 腸直腸癌或前列腺癌。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶向部分針對(duì)選自Her2和CD20的 標(biāo)記物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶向部分針對(duì)病毒感染性細(xì)胞所特異的細(xì)胞表面 標(biāo)記物，例如但不限于流感M2蛋白、LMP1和EBV蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向部 分針對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)記物，例如DC-STAMP或RANK。實(shí)際上，已知IFN-β在骨穩(wěn)態(tài)中起重要作 用，其受共表達(dá)RANK和IFNAR的細(xì)胞的調(diào)節(jié)（Abraham等，2009)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述靶向部分針對(duì)在IFN可以調(diào)節(jié)活性和/或分化的免疫細(xì)胞類型的表面上特異表達(dá)的標(biāo)記 物。一個(gè)實(shí)例是在樹突細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞上特異表達(dá)的標(biāo)記物TOL2。
[0013] 如本文中使用的，靶向部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的作為特異性結(jié)合蛋白 復(fù)合體的一部分的蛋白質(zhì)，或任何特異性結(jié)合蛋白或蛋白片段。其包括但不限于碳水化 合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD) (Blake等，2006)、植物凝血素結(jié)合蛋白、重鏈抗體（hcAb)、單結(jié)構(gòu) 域抗體（sdAb)、小分子抗體（minibodies) (Tramontane)等，1994)、§它源重鏈抗體的可變 結(jié)構(gòu)域（VHH)、新抗原受體的可變結(jié)構(gòu)域（VNAR)、親和體（affibodies) (Nygren等，2〇〇8)、 alphabodies(W02010066740)、經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（DARPins) (Stumpp等， 2008)、anticalins(Skerra 等，2008)、knottins(Kolmar 等，2008)和工程化 CH2 結(jié)構(gòu)域（納 米抗體；Dimitrov,2009)。優(yōu)選地，所述靶向部分由單個(gè)多肽鏈組成，并且不被翻譯后修飾。 更優(yōu)選地，所述IE向部分是納米抗體（nanobody)。
[0014] 靶向構(gòu)建體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何靶向構(gòu)建體。作為一個(gè)非限定性實(shí) 例，靶向部分可以與突變體干擾素化學(xué)連接，或其可以是重組融合蛋白。優(yōu)選地，所述靶向 構(gòu)建體是重組融合蛋白。靶向部分可以直接與突變體IFN融合，或其可以借助接頭片段融 合?？梢栽谕蛔兊腎FN的氨基末端或羧基末端融合靶向部分；優(yōu)選地，所述靶向部分在突變 的IFN分子的最氨基末端融合。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體用作藥物。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體在制造治療癌癥的藥物中的用 途。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體在制造治療病毒疾病的藥物中 的用途。作為非限定性實(shí)例，所述病毒疾病可以是HIV感染、HBV感染或HCV感染。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體用于治療癌癥。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體用于治療病毒疾病。作為非限定 性實(shí)例，所述病毒疾病可以是HIV感染、HBV感染或HCV感染。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體用于治療涉及骨降解的疾病，例 如但不限于骨質(zhì)疏松。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的靶向構(gòu)建體和合適的賦 形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，這樣的藥物組合物可以單獨(dú)使用，或用于組合治療，例如但不 限于與化療組合。
[0022] 附圖簡(jiǎn)述
[0023]圖1 :表示納米抗體-IFN融合蛋白的結(jié)構(gòu)元件。
[0024] 圖2 :所示IFN制劑在HL116細(xì)胞（圖A和B)或表達(dá)鼠瘦蛋白受體（mLR)的HL116 細(xì)胞（圖C和D)中誘導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶活性。圖A和C與圖B和D分別在兩個(gè)獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)中產(chǎn)生。因此，僅可以進(jìn)行豎向比較（圖A對(duì)圖C，或圖B對(duì)圖D)。
[0025]圖3 :在表達(dá)痩蛋白受體和IFN誘導(dǎo)的莖火蟲莖光素酶的細(xì)胞與表達(dá)IFN誘導(dǎo)的 海腎莖光素酶但缺乏痩蛋白受體的細(xì)胞的1 :1的共培養(yǎng)物中，納米抗體-IFNa2R149A或 IFNa 2(7PM)誘導(dǎo)的海腎（Renilla)(淺灰色）和莖火蟲（深灰色）螢光素酶活性。蠻光素 酶活性表示為3nM IFNa 2誘導(dǎo)的莖光素酶活性的百分比。
[0026] 圖4 :經(jīng)純化的靶向mLR的構(gòu)建體的活性：A.對(duì)其在表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞（HL116-mLR) 或缺乏靶標(biāo)的細(xì)胞（HL116)上的特異性活性的定量。B.不同構(gòu)建體靶向效率的計(jì)算。 [0027] 圖5 :構(gòu)建體4-11-IFNA2-R149A在存在和缺乏未綴合的痩蛋白受體結(jié)合性納米抗 體時(shí)的活性。將表達(dá)mLR的HL116細(xì)胞，在存在或缺乏（對(duì)照）100倍摩爾過量的游離4-11 納米抗體的情況下，與分別在其相應(yīng)EC50濃度的IFN- a 2 (IFNA2)或融合至納米抗體4-11 的IFNA2_R149A (納米抗體-IFNA2-R149A)孵育6小時(shí)。
[0028] 圖6 :利用痩蛋白結(jié)合納米抗體4-10,實(shí)行突變體IFN的靶向。
[0029] 圖 7 :在存在抗 IFNAR1 單克隆抗體 64G12(Benoit 等· J. Immunol. 150， 7〇7-716·1993)或抗 IFNAR2 單克隆抗體 MMHAR2(PBL Interferon Source)時(shí)，納米抗 體-IFNa 2R149A在表達(dá)mLR的HL116細(xì)胞中誘導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶活性。
[0030] 圖8 :4-11-IFNA2-R149A靶向表達(dá)mLR的細(xì)胞的特異性。A :對(duì)于親本IFNA2(左上 圖）或4-11-IFNA2-R149AC左下圖），EMCV在HL116細(xì)胞（深灰色符號(hào)）或HL116-mLR細(xì) 胞（淺灰色符號(hào)）上的致細(xì)胞病變效應(yīng)。B :上圖：計(jì)算的抗病毒活性EC50 ;下圖：計(jì)算的靶 向效率。
[0031] 圖9 :IFNa 2(圖A)和納米抗體-iFNa 2R149A(2R5A ;圖B)對(duì)在其表面表達(dá)不同 數(shù)量的Her2分子（分別為10.9 X 1〇3和478 X 103)的BXPC3和BT474細(xì)胞系的特異性活 性（EC50)。圖A的縱坐標(biāo)比例與圖B的縱坐標(biāo)比例不可比。
[0032] 圖10 :1R59B-IFNA2-Q124R對(duì)表達(dá)人Her2的小鼠細(xì)胞的靶向。在有或無 Her2表 達(dá)的BTG9A細(xì)胞中〇ASL2mRNA表達(dá)的定量。
[0033] 圖11 :使用單鏈抗體將突變體IFNA2靶向表達(dá)人Her2的小鼠細(xì)胞。在有或無 Her2 表達(dá)的BTG9A細(xì)胞中ISG15mRNA表達(dá)的定量。
[0034] 圖I2 :Her2磷酸化激活的控制：泳道3至6 :在使用構(gòu)建體1R59B-IFNA2_Q124R以 不同濃度（泳道3至5為200pM,泳道6為2nM)和時(shí)間（泳道3 :5分鐘，泳道4和6 :10分 鐘，泳道5 :30分鐘）處理的表達(dá)人Her2的BTG9A細(xì)胞的提取物中無磷酸化的Her2。
[0035] 泳道7和8 :用于檢測(cè)人BT474細(xì)胞系中磷酸化Her2的對(duì)照。
[0036] 泳道1 :BTG9A細(xì)胞的提取物。泳道2 :表達(dá)人Her2的BTG9A細(xì)胞的提取物。
[0037] 圖13 :抗ro-L2122-IFNA2-Q124R靶向內(nèi)源表達(dá)KI-L2的小鼠原代細(xì)胞?；钚詼y(cè)量 為STAT磷酸化。淺灰色區(qū)域代表TO-L2陰性細(xì)胞群體；深灰色區(qū)域代表PD-L 2陽性群體。
[0038] 圖14 :122-IFNA2-Q124R體內(nèi)靶向表達(dá)PD-L2的細(xì)胞。以PBS、對(duì)照構(gòu)建體（與突 變體IFNA2-Q124R融合的抗GFP納米抗體，標(biāo)示為對(duì)照）或靶向突變體IFN(靶向至H)-L 2， NM22-IFN2-Q124R，標(biāo)示為122-Q124R)對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)（IP)或靜脈內(nèi)（IV)注射。淺灰 色區(qū)域代表PD-L2陰性細(xì)胞群體；深灰色區(qū)域代表PD-L2陽性群體。
[0039] 圖15 :在小鼠中靜脈注射122-IFN-Q124R后的劑量反應(yīng)曲線。淺灰色區(qū)域代表 PD-L2陰性細(xì)胞群體；深灰色區(qū)域代表PD-L2陽性群體。
[0040] 圖16 :靶向突變體痩蛋白誘導(dǎo)的瘦蛋白依賴的生長(zhǎng)：突變體痩蛋白活性的丟失可 以在表達(dá)人TNFR1的Ba/F3細(xì)胞中救回。上圖：使用H6-瘦蛋白構(gòu)建體的實(shí)驗(yàn)；下圖：使用 mleptin構(gòu)建體的實(shí)驗(yàn)。H6表示his標(biāo)簽（6xhis)。
[0041] 圖17 :革E向瘦蛋白構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。 實(shí)施例
[0042] 實(shí)施例的材料和方法
[0043] 納米抗體和ScFv
[0044] 抗鼠痩蛋白受體的納米抗體4-11描述于Zabeau等（2〇12)中和專利W0 2006/053883中。將其編碼序列克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pMEI7(Takebe等，1988)中，與 Slgk引導(dǎo)肽、HA標(biāo)簽和白蛋白融合。質(zhì)粒名稱：pMET7SlgK-HA-4. 11-白蛋白。
[0045] 納米抗體4-10也描述于Zabeau等（2012)中。
[0046] 抗Her2納米抗體1R59B和2R5A描述于Vaneycken等（2011)中。將它們?cè)趐MET7 載體中與人IFNA2-Q124R和與人IFNA2-R149A融合。通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生融合蛋白。
[0047] 抗FD-L2納米抗體122來自Johan Grooten(VIB)。將其在pMET7載體中與人 IFNA2-Q124R融合。通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生融合蛋白，使用HisPur Ni-NTA純化試劑盒 (Pierce，Thermo Scientific)進(jìn)行純化。
[0048] 抗 TNF 納米抗體獲自 Claude Libert (VIB)。
[0049] 抗 Her2ScFv 獲自 Andrea Plllckthun ('ν----?等，1"8)。將其在 ρΜΕ?7 載體中與 人IFNA2-Q124R融合。通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生融合蛋白。
[0050] 抗 GFP 對(duì)照納米抗體獲自 Katrien Van Impe (University Ghent)。
[0051] 干擾素
[0052] IFN α 2和IFNAR2親和力分別降低10和100倍的突變體L153A與R149A已描述于 Roisman等（2001)中。將IFN編碼序列克隆到ρΤ3Τ7載體（Stratagene)中，與ybbR標(biāo)簽 融合。質(zhì)粒名稱：pT 7T3ybbR-IFNa2, pT7T3ybbR-IFNa2-Ll53A，pT7T3ybbR-IFNa2_R149A。
[0053] 人IFNA2Q124R具有與鼠 IFNAR1鏈的高親和力和與鼠 IFNAR2鏈的低親和力 (Weber 等，1987)。
[0054] 納米抗體-IFN融合構(gòu)建體
[0055] 使用來自 Roche Diagnostics 的擴(kuò)展高保真（Expand High Fidelity) PCR 體系， 和以下引物：正向：5' GGGGGGTCCGGACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCACCCTGCTTCTCCCGCC TCCCCAGCATCACCTGCCAGCCCAGCMGTGATAGCCTGGMTTTATTGC3'，反向：5' CGTCTAGATCATTCCTT ACTTCTTAMC3'，從相應(yīng)的pT3T7ybbR IFNa2質(zhì)粒中，通過PCR合成IFN α 2,野生型和L153A 與R149A編碼序列。該P(yáng)CR在IFN的氨基最末端引入His標(biāo)簽和一系列5個(gè)脯氨酸-丙氨 酸-絲氨酸（PAS)重復(fù)。以BspEI和Xbal消化PCR產(chǎn)物，克隆到經(jīng)BspEI-Xbal消化過的 pMET7 SlgK-HA-4. 11-白蛋白載體中，以得到 pMET7 SlgK-HA-4. U-His-PAS-ybbr-IFNA2， pMET7 SlgK-HA-4. 11-His-PAS-ybbr-IFNA2_L153A和pMET7 SlgK-HA-4. 11-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A。
[0056] 納米抗體-IFN融合蛋白的生產(chǎn)
[0057] 在補(bǔ)加有10 % FCS的DMEM中生長(zhǎng)HEK293T細(xì)胞。使用 lipofectamin(Invitrogen)，以 pMET7 SlgK-HA-4· ll-His-PAS-ybbr_IFNA2，pMET7 SlgK-HA-4. ll-His-PAS-ybbr-IFNA2-L153A，pMET7 SlgK-HA-4· ll-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A， pMET7SlgK-HA-2R5A-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A，pMET7SlgK-HA-lR59B-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R,pMET7 SlgK-HA-4D5-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R或pMET7 SlgK-HA-122-His -PAS-ybbr-IFNA2-Q124R進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，保存于-20°C。
[0058] 可選地，將編碼不同納米抗體-IFN融合體的編碼序列亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pBAC_3(Novagen)中。使用BacVector試劑盒（Novagen)通過昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)，使 用HisPur Ni-NTA純化試劑盒（Pierce, Thermo Scientific)和凝膠過濾將蛋白質(zhì)純化至均 質(zhì)。通過在280nm處的吸收值測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。
[0059] IFN受體細(xì)胞系
[0060] HL116克?。║z6等· 1994)來自人HT1080細(xì)胞系。其包含由IFN誘導(dǎo)性6-16 啟動(dòng)子控制的蠻火蟲螢光素酶基因。以編碼鼠瘦蛋白受體的短同種型的表達(dá)載體（ΡΜΕΠ mLRsh_FLAG，Eyckerman 等，1999)和 pSV2neo (Southern 和 Berg 1982)共轉(zhuǎn)染 HL116 細(xì)胞。 在含G418的培養(yǎng)基中分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。在使用來自R&D的生物素化抗小鼠瘦蛋白受 體抗體BAF497和鏈霉親和素 -APC (BD bioscience)，通過FACS分析鼠瘦蛋白受體的表面表 達(dá)水平后，選擇克隆10。
[0061] 用 p6-16-RL --由 IFN 誘導(dǎo)性 6-16 啟動(dòng)子（來自 pl· 8gpt-5, Pellegrini 等· 1989)控制的編碼海腎螢光素酶的質(zhì)粒（來自pRL-null，Promega)、pBB3(Bourachot 等.1982)和鮭精DNA(Sigma)共轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞。在含HAT的培養(yǎng)基中分離穩(wěn)定的經(jīng)轉(zhuǎn) 染的克隆。根據(jù)IFN誘導(dǎo)下高水平的海腎螢光素酶活性誘導(dǎo)，選擇克隆4。
[0062]人胰腺癌 BXPC3 (Tan 等，1明6 ;ATCC :CRL 1687)和乳腺癌 BT474 (Lasfargues 等， 1979 ;ATCC :HTB-20)細(xì)胞系獲自ATCC。小鼠 BTG9A細(xì)胞描述于υζ?等（1990)中。
[0063] 螢光素酶活性的測(cè)量
[0064] 通過定量HL116細(xì)胞和表達(dá)mLR的HL116克隆10中誘導(dǎo)的螢光素酶活性來測(cè)量 IFN特異性活性。以GraphPad Prism軟件，使用非線性數(shù)據(jù)回歸，計(jì)算EC50。
[0065]在6小時(shí)的IFN刺激后，使用來自Promega的螢火蟲螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或雙螢光 素酶報(bào)告者檢測(cè)系統(tǒng)，在Berthold centro LB9601uminometer上測(cè)定蠻光素酶活性。
[0066]定量 RT-PCR
[0067] 通過RT-PCR，相對(duì)于GAPDH或β -肌動(dòng)蛋白，定量干擾素誘導(dǎo)性基因6-16的表達(dá)。 以靶向或?qū)φ誌FN處理細(xì)胞4小時(shí)。以Rneasy柱（Qiagen)純化總RNA。以隨機(jī)引物引導(dǎo)， 使用Moloney鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。如Coccia等（2004)中描 述，使用Light Cycler進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)。
[0068] 對(duì)于Her2,通過定量RT-PCR，使用Light Cycler(Roche)和以下引物：〇ASL2正向： CAC-GAC-TGT-AGG-CCC-CAG-CGA ;0ASL2 反向：AGC-AGC-TGT-CTC-TCC-CCT-CCG ; β 肌動(dòng)蛋白 正向：AGA-GGG-AAA-TCG-TGC-GTG-AC;0 肌動(dòng)蛋白反向：CAA-TAG-TGA-TGA-CCT-GGC-CGT， 檢測(cè)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中鼠 BTG9A和表達(dá)人Her2的BTG9A細(xì)胞，分析0ASL2基因的表 達(dá)相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)。以類似方法，使用相同的β-肌動(dòng)蛋白引物 和以下引物 ISG15 引物：ISG15 正向：GAG-CTA-GAG-CCT-GCA-GCA-AT ;ISG15 反向： TTC-TGG-GCA-ATC-TGC-TTC-TT,測(cè)量 Her2 靶向細(xì)胞中 ISG 的表達(dá)。
[0069] 抗病毒檢測(cè)
[0070] 使用EMC病毒進(jìn)行抗病毒檢測(cè)，按Stewart (1979)中的描述，對(duì)病毒復(fù)制依賴的致 細(xì)胞病變效應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。
[0071] Her2磷酸化的測(cè)量
[0072] 以 200pM 至 2nM 的 1R59B-IFNA2-Q124R 處理表達(dá)人 Her2 的 BTG9A 細(xì)胞 10 至 30 分鐘。在RIPA中裂解細(xì)胞，并在7% SDS-PAGE(40u g/泳道）后，于Odyssey Fc(Licor Bioscience)上，以 western 印跡進(jìn)行分析。以抗 Her2Y-P 1248(Upstate#06_229)和山羊 抗兔第二抗體 IRDye 680(Licor Bioscience#926-32221)檢測(cè)磷酸-Her2。
[0073] STAT1磷酸化的測(cè)量
[0074] 使用 STAT1-PY701 (PE) (BecktonDickinston#6l2564)，按生產(chǎn)商指導(dǎo)的 PhosFlow 技術(shù)，通過FACS檢測(cè)在Y701上磷酸化的STAT1。
[0075] 靶向痩蛋白構(gòu)建體
[0076] 耙向瘦蛋白構(gòu)建體的序列示于圖17中。所示LS6是指該氨基酸突變至S或N。
[0077] 實(shí)施例1 :納米抗體-干擾素融合蛋白
[0078] 圖1顯示以IFNa 2野生型或L153A和R149A突變體構(gòu)建的納米抗體-IFN融合蛋 白的不意圖。
[0079] 實(shí)施例2 :納米抗體-IFN融合蛋白的IFN活性被靶向表達(dá)鼠痩蛋白受體的細(xì)胞
[0080] 檢測(cè)HL116和表達(dá)鼠瘦蛋白受體的HL116-mLR克隆10細(xì)胞中帶有IFNa 2WT, IFN a 2L153A或R149A的3個(gè)納米抗體融合蛋白。在該檢測(cè)系統(tǒng)中也檢測(cè)單獨(dú)的1FN a 2， 以檢查兩個(gè)細(xì)胞克隆在其IFN反應(yīng)性上沒有不同。確實(shí)，HL116和HLll6-mLR克隆10細(xì)胞 對(duì)該IFN都同等敏感（圖2A和2C，黑色符號(hào)）。然而，相較于親本HL116細(xì)胞，在表達(dá)痩蛋 白受體的細(xì)胞中，3個(gè)納米抗體-IFN融合蛋白的IFN活性急劇增加（圖2A與圖2C比較，圖 2B與圖2D比較）。
[0081] 我們估計(jì)，表達(dá)痩蛋白受體的細(xì)胞比親本HL116細(xì)胞分別對(duì)納米抗體-IFN WT、 L153A和R149A敏感10、100和 1000 倍。由于IFN突變體L153A和R149A對(duì)IFNAR2的親和 力分別為相對(duì)于WT的0. 1和0. 01，在由IFNAR2結(jié)合位點(diǎn)中的突變導(dǎo)致的活性丟失與納米 抗體引起的靶向效率之間存在相關(guān)性。
[0082] 為了確定納米抗體-IFN融合蛋白的IFN活性是否僅遞送至表達(dá)納米抗體靶標(biāo)的 細(xì)胞或也遞送至相鄰的細(xì)胞，在HL116-mLR_克隆10和ΗΤ1〇8〇-6-16海腎螢光素酶克隆4 的共培養(yǎng)物中檢測(cè)納米抗體-IFNa 2R149A。兩種細(xì)胞都將對(duì)IFN刺激作出反應(yīng)而表達(dá)蠻光 素酶活性，但是表達(dá)納米抗體靶標(biāo)的細(xì)胞將顯示出蠻火蟲螢光素酶活性，而缺乏痩蛋白受 體的細(xì)胞將顯示出海腎螢光素酶活性。選擇納米抗體-IFNa 2R14M蛋白的稀釋度為1/30， 該稀釋度在攜帶瘦蛋白受體的細(xì)胞中誘導(dǎo)最大反應(yīng)而在缺乏納米抗體靶標(biāo)的細(xì)胞中誘導(dǎo) 最小反應(yīng)（見圖2B和D，黑色曲線）。圖3清楚顯示，在用納米抗體-IFNa 2R149A刺激共 培養(yǎng)物后，海腎螢光素酶活性不被誘導(dǎo)，表明靶向IFN活性僅被遞送至表達(dá)納米抗體所識(shí) 別的抗原的細(xì)胞上。
[0083] 通過加入到表達(dá)或不表達(dá)用于靶向的鼠痩蛋白受體的HL116中，比較野生型和兩 種突變體IFN(L153A and R149A)的活性，進(jìn)一步說明靶向的效率。結(jié)果清楚地顯示，構(gòu)建 體被靶向時(shí)，突變體的活性更高，突變體的靶向效應(yīng)比野生型的大（圖4A和B)。
[0084] 為了證明靶向是納米抗體特異的，在存在或缺乏（對(duì)照）100倍摩爾過量的游離 4-11納米抗體時(shí)，用IFN-α 2(表示為IFNA2)或融合至納米抗體4-11的IFNA2-R149A(Nan obody-IFNA2-R149A)以其各自的EC50濃度與表達(dá)mLR的HL116細(xì)胞孵育6小時(shí)。裂解細(xì) 胞，測(cè)量IFN誘導(dǎo)的螢光素酶活性。如圖5所示，非祀向的IFN不被游離納米抗體抑制，而 靶向構(gòu)建體則被強(qiáng)烈抑制，表明了靶向的特異性效果。
[0085] 靶向至瘦蛋白受體獨(dú)立于受體上的表位：使用與納米抗體4-11識(shí)別受體上不同 的結(jié)構(gòu)域的抗痩蛋白受體納米抗體4-10 (Zabeau等，2012)，利用靶向突變體IFN可以得到 類似的激活（圖6)。
[0086] 實(shí)施例3 :納米抗體-IFN融合蛋白在表達(dá)瘦蛋白受體的細(xì)胞上的IFN活性通過兩 條IFN受體鏈介導(dǎo)
[0087] 為了確定納米抗體-IFN融合蛋白的IFN活性是否需要IFN受體的激活，以 抗IFNAR1或IFNAR2的中和抗體預(yù)處理表達(dá)鼠瘦蛋白受體的HL116細(xì)胞，然后以納米抗 體-IFNA2-R149A融合蛋白進(jìn)行刺激。測(cè)量IFN誘導(dǎo)的螢光素酶的活性。圖7顯示，抗IFNAR1 和抗IFNAR2中和抗體均抑制納米抗體-IFNA2-R149A的IFN活性。
[0088] 實(shí)施例4 :4-ll-IFNA2-R149A在表達(dá)鼠瘦蛋白受體的細(xì)胞中靶標(biāo)特異性的誘導(dǎo)抗 病毒活性
[0089] 抗病毒活性是IFN反應(yīng)的一個(gè)部分，牽涉幾個(gè)基因的表達(dá)。因此，在使用抗瘦蛋白 受體抗體4-11實(shí)現(xiàn)突變體R149A IFN靶向后，控制了抗病毒活性在表達(dá)mLR的細(xì)胞上。結(jié) 果概述于圖8中?；钚詼y(cè)量為有或無瘦蛋白受體表達(dá)時(shí)HL116細(xì)胞上的致細(xì)胞病變效應(yīng)。 與HL116細(xì)胞相比，在表達(dá)瘦蛋白受體的細(xì)胞上檢測(cè)的4-11-IFNA2-R149A納米抗體-IFN 融合蛋白的特異性抗病毒活性高716倍。
[0090] 實(shí)施例5 :表達(dá)Her2的細(xì)胞上IFN活性的祀向
[0091] 為了證明以上概念不限于細(xì)胞因子受體靶向，我們使用抗Her2的納米 抗體2R5A(Vaneycken等，2011)和突變體IFNa 2R149A構(gòu)建了類似的融合蛋白 (2R5A-IFNA2-R149A)。在BXPC3 (胰腺癌，來自ATCC)和BT474 (乳腺癌，來自ATCC)細(xì)胞系 中檢測(cè)了該分子，并針對(duì)6-16IFN誘導(dǎo)性基因的誘導(dǎo)，與IFN-a 2(IFNA2)的活性進(jìn)行比較， 所述誘導(dǎo)通過定量RT-PCR相對(duì)于GAPDH來測(cè)定。BXPC3和BT474細(xì)胞系在其表面表達(dá)的 Her2分子的數(shù)量不同（分別為10. 9 X 103和478 X 103,如Gaborit等（2011)所報(bào)道）。
[0092] 圖9顯示了針對(duì)BXPC3和BT474細(xì)胞系上IFN可誘導(dǎo)基因 6-16的誘導(dǎo)，IFNA2活 性（圖A)和2R5A-IFNA2-R149A活性（圖B)的EC5Q測(cè)定。圖A顯示，BXPC3和BT474細(xì)胞 系表現(xiàn)出對(duì)IFN- α 2相同的敏感性。圖B顯示，2R5A-IFNA2-R149A納米抗體-IFN融合蛋白 在比BXPC3表達(dá)多40倍的Her2分子的ΒΤ474細(xì)胞系上功效強(qiáng)得多。
[0093] 綜上，可以將使I型IFN活性靶向表達(dá)特定細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞的概念（如在表 達(dá)鼠瘦蛋白受體的人細(xì)胞上證實(shí)對(duì)），延伸至未轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞，其中所述未轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞以 在幾類乳腺癌中天然發(fā)現(xiàn)的水平表達(dá)來自不同結(jié)構(gòu)家族的另外細(xì)胞表面分子。
[0094] 實(shí)施例6 :突變體IFNA2-Q149R靶向表達(dá)人Her2的小鼠細(xì)胞
[0095] 使用納米抗體1R59B在1R59B-IFNA2-Q124R中，將突變體人IFNA2Q149R靶向表達(dá) 人Her2的鼠細(xì)胞。IFNA2Q124R具有與鼠 IFNAR1鏈的高親和力和與鼠 IFNAR2鏈的低親和 力（Weber等，1987)。由IFN引起的誘導(dǎo)通過RT-QPCR測(cè)量為0ASL2信使RNA的表達(dá)。結(jié) 果示于圖10中。在表達(dá)Her2的細(xì)胞中清楚地存在靶向特異性誘導(dǎo)，而在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BTG9A 細(xì)胞中沒檢測(cè)到顯著表達(dá)。
[0096] 當(dāng)使用抗Her2的Her2特異性ScFv實(shí)現(xiàn)突變體IFN Q124R的靶向時(shí)，也得到了類 似的結(jié)果。在該情況下，利用ISG15信使RNA表達(dá)，測(cè)量IFN誘導(dǎo)。結(jié)果示于圖11中。同 樣，在表達(dá)Her2的細(xì)胞中可見ISG15的特異性誘導(dǎo)，而突變體IFN對(duì)不表達(dá)Her2的細(xì)胞具 有很小的效應(yīng)。
[0097] 實(shí)施例7 :構(gòu)建體1R59B-IFNA2-Q124R不激活Her2的磷酸化 [0098] 為了檢查Her2的靶向是否導(dǎo)致Her2激活，測(cè)定了靶向細(xì)胞中Her2的磷酸化。結(jié) 果示于圖12中，其清楚地顯示，在1R59B-IFNA2-Q124R靶向細(xì)胞中不能檢測(cè)到磷酸化的 Her2,無論處理的濃度或時(shí)間為多少。
[0099] 實(shí)施例8 :抗PD-L2Nbl22_IFNA2-Q124R構(gòu)建體活性被靶向表達(dá)TO-L2的小鼠原代 細(xì)胞
[0100] 自小鼠腹膜腔分離細(xì)胞，在體外以Nbl22-IFNA2-Q124R或天然mIFNa/β處理 30分鐘。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、滲透化、以抗f>D-L2 (APC) (BD#560086)和STAT1-PY701 (PE) (BD#612564)的抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過FACS進(jìn)行分析。
[0101] PD-L2陽性細(xì)胞群占小鼠腹膜腔中總細(xì)胞群的20%。
[0102]結(jié)果示于圖Π 中。從該圖清楚地得知，在未處理的細(xì)胞，或在非靶向的、鼠 IFN處 理的細(xì)胞中，對(duì)于表達(dá)和不表達(dá)PD-L2的細(xì)胞，STAT1-P的峰相符。此外，可見鼠 IFN處理明 顯誘導(dǎo)STAH-P。然而，僅對(duì)于表達(dá)PD-L2的細(xì)胞，以靶向突變體IFN處理導(dǎo)致了 STAH-P 發(fā)生特異遷移。
[0103] 在類似實(shí)驗(yàn)中分析脾細(xì)胞的IFN反應(yīng)時(shí)，得到相同的結(jié)果。PD-L2陽性細(xì)胞群占小 鼠脾中總細(xì)胞群的1 %，這表明小細(xì)胞群也可以被有效地靶向。
[0104] 實(shí)施例9 :體內(nèi)注射122-IFNA2-Q124R構(gòu)建體僅在表達(dá)H)-L2的細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN反 應(yīng)
[0105] 以 PBS、NM22-IFNA2-Q124R 或與 IFNA2-Q124R 融合的對(duì)照 Nb (抗 GFP)注射（IP 或IV)小鼠。注射后30分鐘，殺死小鼠，通過以PBS沖洗腹膜腔，自腹膜腔回收細(xì)胞，固定 (PhosLow 固定緩沖液 I BD#557870)，滲透化（PhosFlow Perm緩沖液 III，BD#558050)，以抗 PD-L2(APC) (BD#560086)和 STAT1_PY701(PE) (BD#612564)抗體標(biāo)記，通過 FACS 進(jìn)行分析。 結(jié)果示于圖14中。在以PBS或?qū)φ占{米抗體處理的PD-L2陽性和陰性細(xì)胞中，STAT1-P是 一致的。然而，當(dāng)小鼠被注射靶向突變體IFN時(shí)，可見STAT1-P的明顯誘導(dǎo)（僅在PDL2陽 性細(xì)胞群中）。
[0106] 作為對(duì)照，在i.v.注射了不同劑量天然小鼠 IFN(10 000,100 000或1000 000單 位）的小鼠中檢查了 STAT1-P,在ro-L2陽性和ro-L2陰性細(xì)胞之間未能檢測(cè)到STAT1-P的 差異。
[0107] 圖15顯示了靜脈注射Nbl22-IFNA2-Q124R構(gòu)建體后的類似劑量反應(yīng)曲線。即使 在64ng的最低劑量時(shí)，在表達(dá)TO-L2的細(xì)胞中也可見STAH-P的遷移。
[0108] 實(shí)施例10 :使用截短的TNFa受體，將突變體痩蛋白靶向痩蛋白受體
[0109] Ba/F3細(xì)胞在生長(zhǎng)上依賴于IL-3。在以mLR轉(zhuǎn)染后，Ba/F3細(xì)胞也用痩蛋白增殖。 與其受體具有降低的親和力的痩蛋白突變體在誘導(dǎo)和維持Ba/F3-mLR細(xì)胞增殖上功效較 低。瘦蛋白突變體L86S和突變體L86N在親和力上分別具有中度和劇烈降低，由此誘導(dǎo)增 殖的能力分別中度和劇烈降低。
[0110] 以缺乏其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的人TNFa受體l(hTNFRl)對(duì)Ba/F3-mLR細(xì)胞進(jìn)行另外的轉(zhuǎn) 染，引入非功能性受體，該非功能性受體能夠作為膜結(jié)合胞外標(biāo)記物起作用。
[0111] 由瘦蛋白和抗人TNFR1納米抗體（在此為nb96)組成的嵌合蛋白將結(jié)合到攜帶 mLR的細(xì)胞和攜帶hTNFRl的細(xì)胞。具有瘦蛋白突變體L86S和L86N的嵌合蛋白對(duì)LR的親 和力降低，但保留了其對(duì)hTNFRl的親和力。
[0112] 通過以表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hek293T細(xì)胞來制備嵌合蛋白。以0.45 μ m濾器過濾上 清，系列稀釋于96孔板中用于檢測(cè)。以純化的重組痩蛋白的系列稀釋液作為參照。每個(gè)孔 室中3000至10000個(gè)細(xì)胞，4或5天后，通過以XTT染色測(cè)量增殖。測(cè)量450nm處的0D值。 對(duì)于使用不同瘦蛋白構(gòu)建體（見圖17)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示于圖16中。關(guān)于兩個(gè)構(gòu)建體， 對(duì)于突變體構(gòu)建體可見hTNFR依賴的生長(zhǎng)刺激，而hTNFR的表達(dá)不影響以wt (非靶向）瘦 蛋白處理的細(xì)胞的生長(zhǎng)。從這些結(jié)果中可清楚得知，靶向可以補(bǔ)償突變的負(fù)效應(yīng)。
[0113] 參考文獻(xiàn)
[0114] -Abraham, A. K. , Ramanathan, Μ. Weinstock-Guttman, Β. and Mager, D. E. (2009). Biochemical pharmacology 77,1757-1762.
[0115] -Benoit,P. ?Maguire, D. ,Plavec,I. ,Kocher,H. ?Tovey,M. and Meyer, F. (1993). J. Immunol.，150,707-716
[0116] -Blake，A. W.，McCartney，L.，F(xiàn)lint，J.，Bolam，D. N.，Boraston，A. B.，Gilbert， H. J.，and Knox, J.P. (2006). J. Biol. Chem.，281，29321_29329.
[0117] -Bourachot，B.，Jouanneau，J.，Giri，I.，Katinka，M.，Cereghini，S.，and Yaniv， M. (1982). EMBO J.，1,895-900.
[0118] -Brecht，A.，Gauglitz，G. And Polster，J· (1993) · Biosens· Bioelectron· · 8， 387-392.
[0119] -Coccia, E. M. , Severa, M, Giacomini, E. ,Monneron, D. , Remoli,M-E. , Julkunen, I. , Celia, M. , Lande, R. and Uze, G. (2004). Eur. J. Immunol. 34. 796-805.
[0120] -Conklin, D. (2004). J. Computiational Biol. 11,1189-1200.
[0121] -Dimitrov, D. S. (2009).mAbs 1,26-28.
[0122] -Eyckerman, S. , Waelput, W. , Verhee, A. , Broekaert, D. , Vendekerckhove, J., and Tavernier, J. (1999). Eur. Cytok. Netw. 10,549-559.
[0123] -Gaborit，N.，Labouret，C.，Vallaghe，J.，Peyrusson，F(xiàn).，Bascoul-Mollevi，C. ? Crapez,E. ,Azria,D. ,Chardes,T. ,Poul,M. A. ,Mathis,G. ,Bazin,H. ,Pelegrin,A. (2011). J. Biol. Chem. 286,11337-11345.
[0124] -Ortiz-Sanchez，E.，Helguera，G.，Daniels，T. R. and Penichet，M. L· (2008) · Expert Opin. Biol. Ther. ,8,609-632.
[0125] -Pellegrini, S. , John, J. , Shearer, M. , Kerr, I. M. and Stark, G. R. (1989). Mol. Cell. Biol. 9,4605-4012.
[0126] -Piehler，J.，Roisman，L. C. and Schreiber，G. (2000) · J. Biol. Chem. 275， 40425-40433.
[0127] -Lasfargues, E. Y. , Coutino, W. G. and Dion, A. S. (1979). In Vitro, 15,723-729.
[0128] -Nygren, P. A. (2008). FEBS J·，275,2668-2676.
[0129] -Roisman, L. C. , Piehler, J. , Trosset, J. Y. , Scheraga, H. A. and Schreiber, G. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. YSA, 98,13231-13236.
[0130] -Rossi , E. A. , Goldenberg, D. M. , Cardi 1 lo, T. M. , Stein, R. And Chang, C.H. (2009)Blood, 114,3964-3871.
[0131] -Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341. Skerra, A. (2008).FEBS J·，275,2677-2683.
[0132] -Stewart II W. E. The interferon system.Springer-Verlag, Wien, New York. 1979.
[0133] -Stumpp, Μ. T. , Binz, Η. K. and Amstutz, P(2008). Drug Discov. Today 13, 695-701.
[0134] -Takabe, Y. , Seiki, M. , Fujisawa, J. , Hoy, P. , Yokata, K. and Arai, N. (1988). Mol. Cell. Biol. 8,466-472.
[0135] -Tan, Μ. H. , Nowak, N. J. , Loor, R. , Ochi, H. , Sandberg, A. A. , Lopez, C. , Pickren, J. W. , Berjian, R. , Douglass, H. 0. jr. and Chu, T. M. (1986)Cancer Invest. 4,15-23.
[0136] -Tramontano, A. , Bianchi, E. , Venturini, S. , Martin, F. , Pessi, A and Sollazzo,M. (1994). J. Mol. Recognition 7,9-24.
[0137] -Uzeet al.Cell 60,225-234(1990).
[0138] -ΙΙζ?，G.，Di Marco，S.，Mouchel-Veilh，Ε·，Monneron，D.，Bandu，Μ· Τ·， Horisberger，Μ· A.，Dorques，A.，Lutfalla，G.，and Mogensen, K. E. (1994). J. Mol. Biol. 243,245-257.
[0139] -Vaneycken，I.，Devoogdt，N.，Van Gassen，N.，Vincke，C.，Xavier，C.，Wernery， U. , Muyldermans, S. , Lahoutte, T. And Caveliers,V. (2011).FASEB J. 25, 2433-2446.
[0140] -Weber et al. (1987) EMBO J. 6, 591-598.
[0141] -Worn et al. , FEBS Lett. 427, 357-361 (1998)
[0142] -Zabeau，L·，Verhee，A.，Catteeuw，D.，F(xiàn)aes，L·，Seeuws，S.，Decruy，T.，Elewaut， D. , Peelman, F. And Tavernier, J. (2012). Biochem. J. . 441,425-434.
【權(quán)利要求】
1. 靶向構(gòu)建體，其包含經(jīng)修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子和靶向部分，其中所述經(jīng)修飾的 α-螺旋束細(xì)胞因子的特征是與α-螺旋束細(xì)胞因子受體的親和力降低。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的靶向構(gòu)建體，其中所述經(jīng)修飾的α-螺旋束細(xì)胞因子是突變體 螺旋束細(xì)胞因子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的靶向構(gòu)建體，其中所述靶向部分靶向在表達(dá)α-螺旋束細(xì)胞 因子受體的細(xì)胞上表達(dá)的標(biāo)記物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的靶向構(gòu)建體，其中所述突變體α-螺旋束細(xì)胞因子是突變體干擾 素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的靶向構(gòu)建體，其中所述靶向部分靶向在表達(dá)干擾素受體的細(xì)胞上 表達(dá)的標(biāo)記物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的靶向構(gòu)建體，其中所述干擾素受體是IFNAR2。
7. 根據(jù)任何上述權(quán)利要求的靶向構(gòu)建體，其中所述靶向部分指向組織特異性標(biāo)記物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一的祀向構(gòu)建體，其中所述祀向部分指向選自Her2、 DC-STAMP和CD20的標(biāo)記物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一的靶向構(gòu)建體，其中所述靶向部分指向病毒感染性細(xì)胞所 特異的細(xì)胞表面標(biāo)記物。
10. 根據(jù)任何上述權(quán)利要求的靶向構(gòu)建體，其中所述靶向部分為抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的靶向構(gòu)建體，其中所述抗體為納米抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4的靶向構(gòu)建體，其中突變體干擾素為突變體干擾素 α 2。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的靶向構(gòu)建體，其中所述突變體干擾素 α 2在區(qū)域144-154的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸上被突變。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12的靶向構(gòu)建體，其中所述突變體干擾素 α 2選自IFNa 2L153A、 IFN a 2R149A 和 IFN a 2M148A。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一的靶向構(gòu)建體用作藥物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一的祀向構(gòu)建體用于治療癌癥。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一的祀向構(gòu)建體用于治療病毒性疾病。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一的靶向構(gòu)建體用于治療涉及骨降解的疾病。
19. 藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一的靶向構(gòu)建體和合適的賦形劑。
【文檔編號(hào)】C07K16/32GK104245734SQ201380015170
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月20日
【發(fā)明者】J·德塔韋尼耶, G·烏茲, G·卡特龍, F·保羅, J·皮勒 申請(qǐng)人:非營(yíng)利性組織佛蘭芒綜合大學(xué)生物技術(shù)研究所, 國(guó)立比利時(shí)根特大學(xué), 科學(xué)研究國(guó)家中心, 蒙彼利埃第二大學(xué), 蒙彼利埃大學(xué)區(qū)醫(yī)療中心, 奧斯納布呂克大學(xué)