抗adamts-5抗體,其衍生物和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠識(shí)別并結(jié)合表位的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段(所述表位包含于ADAMTS-5的間隔結(jié)構(gòu)域中)、編碼同一物質(zhì)的核酸和表達(dá)載體、其生產(chǎn)方法和用途。
【專利說明】抗ADAMTS-5抗體，其衍生物和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗ADAMTS-5抗體，所述抗體用于軟骨降解相關(guān)病癥的治療。
[0002] 具體而言，可在骨關(guān)節(jié)炎和其他類型的關(guān)節(jié)炎中觀察到這類降解。

【背景技術(shù)】
[0003] 骨關(guān)節(jié)炎（0A)是一組重疊的不同疾病，其具有不同的病因但類似的生物、形態(tài)和 臨床結(jié)果。疾病過程不僅影響關(guān)節(jié)軟骨，還涉及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑 膜和關(guān)節(jié)周圍的肌肉。最終，關(guān)節(jié)軟骨退化并伴隨纖顫、裂縫、潰瘍和失去關(guān)節(jié)表面的全部 厚度。該病癥的特征為鄰近病灶區(qū)滑膜關(guān)節(jié)內(nèi)的關(guān)節(jié)軟骨缺失，與骨的肥大（骨刺和軟骨 下骨硬化）和關(guān)節(jié)囊的增厚相關(guān)。可將其解釋為滑膜關(guān)節(jié)對(duì)損傷的反應(yīng)。該現(xiàn)象可發(fā)生在 任何關(guān)節(jié)中，但在手、脊椎、膝、腳和臀的所選關(guān)節(jié)中最常見。嚴(yán)重時(shí)，該病理性變化會(huì)導(dǎo)致 輻射變化（失去關(guān)節(jié)間隙和骨刺），這被用于流行病學(xué)研究以估計(jì)在不同關(guān)節(jié)位點(diǎn)上0A的 普遍程度。目前，0A發(fā)作的分子和細(xì)胞機(jī)制仍未知；有假說指出異常的負(fù)荷以及外傷可能 起一定作用，但似乎可確定基因和遺傳因素也涉及其中。若存在，炎癥僅次于主要事件。
[0004] 0A是最常見的關(guān)節(jié)炎形式。世界衛(wèi)生組織（WHO)估計(jì)，在全球范圍內(nèi)超過60歲的 人群中9. 6%的男性和18%的女性患有癥狀性0A，并將0A歸類為女性殘疾的第4大病因和 男性殘疾的第8大病因。據(jù)信膝0A的殘疾風(fēng)險(xiǎn)與心臟疾病相同。
[0005]另一種常見的關(guān)節(jié)炎形式，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)是一種以導(dǎo)致軟骨降解、骨侵蝕 和疼痛的關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性炎癥疾病，導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾和過早死亡。
[0006] 雖然0A和RA可由不同的病因引起并根據(jù)不同的途徑發(fā)展，但它們?nèi)怨灿杏绍浌?基質(zhì)合成和分解失衡組成的基本過程，使得關(guān)節(jié)軟骨破壞，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)不 穩(wěn)定、疼痛和慢性殘疾。此外，盡管受0A和RA影響的患者人數(shù)令人注目，但對(duì)于其病原學(xué)、 發(fā)病機(jī)理和發(fā)展仍知之甚少。甚至更令人注目的是，對(duì)于這些疾病的治療，只存在很少的疾 病改善性抗風(fēng)濕性藥物（DMARD)，且其主要限于RA。
[0007] 對(duì)于0A，在不存在療法的情況下，治療只能是緩解性的，限于使用C〇x-2選擇性抑 制劑（如塞來考昔），以及傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥（NSAID)(如萘普生和雙氯芬酸），或者甚至 更老的用于疼痛控制的藥物（如乙酰氨基酚）。其他類型的藥物（包括諸如軟骨素和硫酸 鹽葡糖胺的化合物）也是針對(duì)0A的治療選擇，但許多醫(yī)生對(duì)其效力仍不確信。
[0008] 關(guān)于RA，在過去十年中，通常由NSAID支持的DMARD(尤其是氨甲喋呤和新生物劑 的使用）和/或皮質(zhì)類固醇的優(yōu)化使用提供了疼痛緩解以及在一定程度上控制了炎癥，顯 著增加了控制的成功率。然而，傳統(tǒng)DMAI?的起效緩慢且具有促進(jìn)頻繁監(jiān)控的毒性。此外， 傳統(tǒng)的NSAID藥物的胃腸道副作用以及選擇性C0X-2抑制劑的心血管和腎副作用使NSAID 的使用大為失色。
[0009]因此，用于防止軟骨降解的新治療劑的研究引起了極大興趣，原因在于0A和RA影 響了全世界數(shù)以百萬計(jì)的人，隨著平均人口年齡的增長(zhǎng)，預(yù)期發(fā)病率上升。
[0010] 〇A和RA中出現(xiàn)的軟骨降解是酶對(duì)其結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行切割的結(jié)果。軟骨主要由軟骨 細(xì)胞和胞外基質(zhì)（ECM)構(gòu)成，所述胞外基質(zhì)由蛋白多糖（主要是蛋白聚糖聚合物）、膠原 和水組成?；|(zhì)中，蛋白聚糖聚合物、透明質(zhì)酸（HA)和II型膠原之間的相互作用為軟骨 提供了獨(dú)特的可壓縮性和彈性，用于承重和關(guān)節(jié)活動(dòng)功能的生物機(jī)械特性。蛋白聚糖聚合 物由三個(gè)球形區(qū)組成：靠近蛋白 N末端的G1和G2以及位于C末端的G3。G1和 G2區(qū)被短 的球G結(jié)構(gòu)域（IGD)隔開，而G2和G3區(qū)被長(zhǎng)的糖胺聚糖（GAG)附著區(qū)隔開。通過輔助蛋 白，G1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了蛋白聚糖聚合物與脫的結(jié)合區(qū)。蛋白聚糖聚合物的 GAG附著區(qū)提供 了結(jié)合水所需的高陰離子電荷密度并賦予軟骨確保其功能所需的獨(dú)特滲透特性。因此，對(duì) 導(dǎo)致蛋白聚糖聚合物切割的生物化學(xué)機(jī)制的理解有助于開發(fā)適用于阻斷或控制 0A疾病的 治療藥物。關(guān)節(jié)炎中軟骨完整性的缺失與蛋白水解切割所導(dǎo)致的蛋白聚糖聚合物完整性 的受損相關(guān)。最近，蛋白聚糖聚合物酶（主要是蛋白聚糖聚合物酶 _2(也稱為ADAMTSj) 和蛋白聚糖聚合物酶-1(也稱為ADAMTS_ 4))經(jīng)鑒定屬于軟骨降解的關(guān)鍵酶。具體而言， 出版物（Glasson 等，2〇〇5· Nature. 434:644-64 和 Stanton 等，2〇〇5· Nature. 434:648-652) 顯示ADAMTS-5在與小鼠中0A和RA的兩個(gè)模型相關(guān)的病原性關(guān)節(jié)變化中起基礎(chǔ)作用。 ADAMTS-4和-5都是谷氨酰內(nèi)肽酶（glutamylendopeptidase)并在五個(gè)特定位點(diǎn)切割蛋 白聚糖聚合物：Glu373-Ala374(球間結(jié)構(gòu)域-I⑶）、Glul545-Glyl546、Glul714-Glyl715、 Glul819-Alal820 和 Glul919-Leul920 鍵（人序列），導(dǎo)致軟骨破壞。
[0011]人 ADAMTS-4(圖 1，SEQ_ ID N0:1)和 ADAMTS-5 (圖 1，SEQ. ID N0:2)是由細(xì)胞分泌 至胞外空間的多結(jié)構(gòu)域金屬蛋白酶。兩種酶均具有類似的結(jié)構(gòu)域排布，由信號(hào)序列（SS)、前 結(jié)構(gòu)域（Pro)、催化金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域（Cat)、去整合素（Dis)結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白（TS) I型結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸（CysR)結(jié)構(gòu)域和間隔（Sp)結(jié)構(gòu)域組成。此外，ADAMTS-5在間隔結(jié) 構(gòu)域后包含額外的TS結(jié)構(gòu)域。上文提到的所有催化結(jié)構(gòu)域外的結(jié)構(gòu)域都在天然蛋白底物 的識(shí)別和處理過程中其重要作用，稱為"外位點(diǎn)"。
[0012] 例如，已證明蛋白聚糖聚合物酶的Sp和CysR結(jié)構(gòu)域包含調(diào)節(jié)蛋白酶與其底物親 和性的 GAG 結(jié)合基序（Kashiwagi 等，2004. J Biol Chem· 279:10109-10119) ;(Gendron 等， 2007. J Biol Chem. 282:18294-18306) ;(Flannery，Curr. 11:614-619) ;(Zeng 等，2006. Biochim Biophys Acta· 1760:517-524)。
[0013] 因此，人們對(duì)開發(fā)用于〇A和/或RA治療的ADAMTS-4和-5抑制劑的興趣日 益增強(qiáng)。已開發(fā)了多種金屬蛋白酶抑制劑，且一些已經(jīng)在患有癌癥（Zucker等，2000. Oncogene. 19:6642-6650)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Milner 和 Cawston，2005. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4:363-375)的患者中進(jìn)行臨床測(cè)試，但這些藥物未能顯 示有效性并表現(xiàn)出副作用（如骨骼肌疼痛和輕度的血小板減少）（Zucker等，2000· Oncogene. 19:6642-6650)。這些失敗被認(rèn)為是由于缺少抑制劑的選擇性和對(duì)生物學(xué)上重要 的脫靶金屬蛋白酶的抑制以及其他副作用。因此，選擇性是無毒治療性抑制劑的前提條件。 增加針對(duì)特定金屬蛋白酶選擇性的一種方法是產(chǎn)生變構(gòu)或外位點(diǎn)結(jié)合。結(jié)合至酶外位點(diǎn)的 抑制劑能夠阻斷與天然ECM底物的相互作用并可成為有吸引力的激活定點(diǎn)抑制劑的替代 選擇（因?yàn)槠渚哂懈叨忍禺愋郧夷軌蛴行У貎H阻斷針對(duì)靶底物的水解），從而最小化體內(nèi) 副作用（Troeberg 等，2008. Faseb J· 22:3515-3524)。
[0014] 申請(qǐng)W0 2011/0〇2968公開了能夠結(jié)合人ADAMTS-5催化結(jié)構(gòu)域和粉碎蛋白 (desintegrin)結(jié)構(gòu)域的抗體。文件 W0 01/11〇74 和 W0 00/53774 公開了 ADAMTS-5 蛋白并 一般地涉及了針對(duì)這類蛋白的抗體。
[0015] 發(fā)明描述
[0016]本發(fā)明中，發(fā)明人分離了識(shí)別并結(jié)合ADAMTS-5 (稱為抗體抗Sp_ADAMTS-5)的間隔 結(jié)構(gòu)域中所含表位的抗體。所述抗體可用于人類治療應(yīng)用。所述抗體通常是完全人抗體， 或嵌合或人源化的，以在給予患者時(shí)使針對(duì)所述抗體的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)最小化。如本文所 述，可從此類抗體設(shè)計(jì)或衍生出其它抗原結(jié)合分子，例如，抗原結(jié)合抗體片段、抗體衍生物 和多特異性分子。本發(fā)明的抗體顯示了針對(duì)軟骨基質(zhì)退化的抑制活性，所述抗體控制軟骨 基質(zhì)降解酶的生成并增強(qiáng)軟骨基質(zhì)合成，從而治療和/或預(yù)防軟骨降解。因此，所述抗體可 用于軟骨降解相關(guān)病癥的治療和/或預(yù)防。這類病癥包括骨關(guān)節(jié)炎（ 0A)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、痛風(fēng)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膿毒性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性多肌痛、強(qiáng)直性脊柱 炎、假痛風(fēng)、多肌炎、纖維組織肌痛或萊姆病。
[0017] 具體而言，本發(fā)明的抗體可用于治療和/或預(yù)防被歸類為早期至晚期0A和RA的 疾病。0A從初期至晚期的各期是根據(jù)0ARSI和曼金分類法（Mankin classification)進(jìn)行 分類的。
[0018] 在兩種疾病中，被分類為任意上述等級(jí)或評(píng)分的疾病都伴隨有作為疾病病癥的軟 骨退化。本發(fā)明的抗體可有效地用于治療或預(yù)防被歸類為初期至晚期0A和RA的疾病。 [0019] 這類抗體的抗體結(jié)合片段以及包含此類抗原結(jié)合片段的分子（包括工程改造的 抗體片段、抗體衍生物、雙特異性抗體和其它多特異性分子）也是本發(fā)明的目的。
[0020] 包括本發(fā)明抗體的藥物組合物和試劑盒或其它物品也是本發(fā)明的部分。
[0021] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是能夠識(shí)別并結(jié)合特定表位的抗體、其重組或合成的抗 原結(jié)合片段，所述表位包括在ADAMTS-5的SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸874區(qū)域中。 優(yōu)選的表位包括在SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸745中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨 基酸746至氨基酸763中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸764至氨基酸779中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸780至氨基酸795中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸796至氨基酸811 中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸812至氨基酸827中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸828 至氨基酸843中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2的氨基酸別4至氨基酸859中、優(yōu)選在SEQ ID No. 2 的氨基酸860至氨基酸874中。更優(yōu)選地，所述表位包括在SEQ ID No. 2的氨基酸757至 氨基酸771區(qū)域中。
[0022] 優(yōu)選地，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段包括至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDRH3)氨基酸序列,所述⑶RH3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID 恥:62、65、68、71、74、77、80、83、86、89和92。
[0023] 優(yōu)選地，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH2) 氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少 8〇%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、79、82、85、88 和 91。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDRH1)氨基酸序列，所述CDRH1氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少8〇%的相 同性：SEQ ID 吣:60、63、66、69、72、75、78、81、84、87和90。
[0025] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括至少一 個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL 3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列 具有至少 80%的相同性：SEQ ID 觀:29、32、35、38、41、44、47、50、53、56和59。 ?〇026]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括輕 鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氛基酸序列與選自下組的氣基酸序列具有 至少 80%的相同性：28、31、34、37、40、43、46、49、52、55 和 58。
[0027]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)（CDRL1)氨基酸序列，所述CDRL1氨基酸序列與選自下組的氛基酸序列具有至少 80%的相同性：27、30、33、36、39、42、45、48、51、54和57。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段包括重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDRH1)氨基酸序列，所述CDRH1氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID敝6〇、63、66、69、72、75、7 8、81、84、87和9〇;以及重鏈互補(bǔ)決定區(qū)〇1)職） 氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少 80 %的相同性：SEQ ID恥:61、64、67、70、73、76、79、82、85、88和91;以及重鏈互補(bǔ)決定區(qū)仰職3)氨基酸序列， 所述CDRH3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:62、 65、68、71、74、77、80、83、86、89 和 92。
[0029] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)（CDRL1)氨基酸序列，所述CDRL1氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:27、30、33、36、39、42、45、48、51、54 和 57;以及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID 購:28、31、34、37、40、43、46、49、52、 55和58;以及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（〇)1^3) 氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80 %的相同性：SEQ ID 如：29、32、35、38、41、44、47、50、53、56和59。
[0030] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段包括與SEQ ID No. 60具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、與SEQ ID No· 61具有至少80%相同 性的CDRH2氨基酸序列，以及與SEQ ID No· 62具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。
[0031] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括 與SEQIDNo.27具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、與SEQIDNo·28具有至少 800/^目同性的CDRL2氨基酸序列，以及與SEQ ID階.29具有至少8〇%相同性的00此3氨基 酸序列。
[0032] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段包括與SEQ ID No. 81具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、與SEQ ID No. 82具有至少8〇%相同 性的CDRH2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 83具有至少8〇%相同性的CDRH3氨基酸序列。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括與SEQ ID No. 48具有至少80%相同性的CDRL1氨基酸序列、與SEQ ID No· 49具有至少80%相同性的 CDRL2氨基酸序列，以及與SEQID No. 50具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0033] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段包括與SEQ ID No. 87具有 至少80°/^目同性的CDRH1氨基酸序列、與SEQ ID此.88具有至少80%相同性的00拙2氨基 酸序列，以及與SEQ ID No. 89具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述 抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包括與SEQ ID Νο· 54具有至少80%相同性的⑶RL1 氨基酸序列、與SEQ ID Νο·55具有至少80%相同性的⑶RL2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 56具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0034] 在本發(fā)明中，"至少80%相同性"指所述相同性可以是與提及序列存在至少80%或 至少85 %或90 %或％ %或100 %的序列相同性。
[0035] 優(yōu)選地，上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段是單克隆抗體或嵌合或人源 化的，或去免疫化的或完全人抗體。
[0036] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的醫(yī)療用途。優(yōu) 選地，用于治療和/或預(yù)防軟骨降解相關(guān)的病癥，如骨關(guān)節(jié)炎和/或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。優(yōu)選 地，上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段可用于治療多配聚糖-4介導(dǎo)的病理反應(yīng)，尤 其是多配聚糖-4介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的病理反應(yīng)。
[0037]本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼上文所定義的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的 核酸分子。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的核酸分子包括至少 一個(gè)選自SEQ ID No. 99至SEQ ID No. 120的核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸包括至少一個(gè)以 下序列：SEQ ID N0. :99、1〇〇、113、114、117 和 118。
[0038]本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的表達(dá) 載體。
[0039]本發(fā)明的另一個(gè)目的是包括上述核酸的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生本 發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段。
[0040]本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的方 法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生上述抗體的細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述抗體。
[0041] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種藥物組合物，所述組合物包含至少一種上述抗體、其 重組或合成的抗原結(jié)合片段，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述組合物包括有效量的抗體、 其重組或合成的抗原結(jié)合片段。藥物組合物在該領(lǐng)域中是常規(guī)的，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人 員基于一般常識(shí)來制備。包含所述抗體和/或其片段和/或重組衍生物和/或偶聯(lián)物與至 少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載劑混合的藥物組合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物用于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。
[0043]本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療和/或預(yù)防軟骨降解相關(guān)病癥（如骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎和其他形式的關(guān)節(jié)炎）的方法，所述方法包括給予治療有效量的上述抗體、其重 組或合成的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療和/或預(yù)防關(guān)節(jié)破壞、治療和/或 預(yù)防自身免疫和/或炎癥疾病的方法，所述方法包括給予治療有效量的上述抗體、其重組 或合成的抗原結(jié)合片段。
[0044]本發(fā)明的一個(gè)目的是減少和/或抑制ADAMTS-5的方法，所述方法包括給予有效量 的上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段。
[0045] ^在本發(fā)明中，公開的CDR的突變體可通過使所述CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸 失變來廣生。已知位于CDR中適當(dāng)位置的單氨基酸取代就足以改善親和性。研究人員已采 用定點(diǎn)突變來使一些免疫球蛋白產(chǎn)物的親和性增加約 1〇倍。這種通過使CDR突變來增加 或減少（即調(diào)節(jié)）抗體親和性的方法是公知常識(shí)（參見例如 Paul，w. E.，1993)。因此，使本 發(fā)明CDR發(fā)生氨基酸取代、缺失或添加以增加或減少（即調(diào)節(jié)）結(jié)合親和性或特異性也在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0046]為簡(jiǎn)便起見，本發(fā)明的優(yōu)選抗體命名為CRB0017(包括SEQ ID Νο·3和SEQ ID No. 4)、CRB0102(包括 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18)以及 CRB0123C 包括 SEQ ID No. 21 和SEQ ID No. 22)，如表III所示。雖然本發(fā)明著眼于此類抗體以作為本發(fā)明的示例，但本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，一旦確定本公開內(nèi)容，其它類似的抗體及其抗體片段，以及這些 類似抗體的抗體片段的產(chǎn)生和使用都落在本發(fā)明范圍內(nèi)。此類類似抗體可由本領(lǐng)域技術(shù)人 員通過合理量的實(shí)驗(yàn)來產(chǎn)生。
[0047] 更優(yōu)選地，所述抗體是含有所述表位結(jié)合區(qū)的scFv、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片 段、多聚體抗體、肽或蛋白水解片段。優(yōu)選地，所述scFv片段包括選自SEQ ID No. 125至 132 和 SEQ ID no. 135、136、137 的序列。
[0048] 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明的抗體或其功能 性衍生物，或與上述核酸雜交，或由其簡(jiǎn)并序列組成。
[0049] 制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所述方法包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程培 養(yǎng)宿主細(xì)胞和分離抗體。
[0050] 對(duì)于本發(fā)明的工業(yè)方面而言，本文所公開的抗體可以該【技術(shù)領(lǐng)域】通用的方法在藥 物組合物中適當(dāng)?shù)刂苽洹?br> [0051] 本發(fā)明的抗體可包括至少一種上文所定義的CDRH，所述CDRH含有不超過4個(gè)氨基 酸，優(yōu)選不超過2個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。本發(fā)明的抗體還可包括 至少一種上文所定義的CDRL，所述CDRL含有不超過4個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過2個(gè)氨基酸的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。
[0052] 本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與ADAMTS-5的結(jié)合。治療或預(yù)防軟骨降解相關(guān)病癥的方法包 括給予需要治療的患者有效量的至少一種上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段。在一 些方面，本發(fā)明包括一種抑制對(duì)象中ADAMTS-5與蛋白聚糖聚合物結(jié)合的方法，所述方法包 括給予有效量的至少一種上述抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段。
[0053] 本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段選擇性結(jié)合ADAMTS-5的間隔結(jié)構(gòu) 域，優(yōu)選Kd小于等于2nM。
[0054] 在一些方面，本發(fā)明包括治療或預(yù)防對(duì)象中軟骨降解相關(guān)病癥的方法，所述方法 包括給予需要治療的患者有效量的至少一種本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片 段，并同時(shí)或依次給予特異性止痛的藥劑。
[0055] 本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段是中和抗體（即降低或消除相關(guān)抗 原生物活性的抗體），所述中和抗體結(jié)合ADAMTS-5并降低ADAMTS-5與蛋白聚糖聚合物結(jié)合 的可能性。
[0056] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段在SEQ. ID N0:2的殘基 732-874位置上與ADAMTS-5結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，與ADAMTS-5結(jié)合時(shí)，本發(fā)明的抗體、 其重組或合成的抗原結(jié)合片段位于距離ADAMTS-5的至少一種以下殘基8?；蚋〉木嚯x 上：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、 T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、 R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、 A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、1786、N787、G788、K789、Y790、 M791、1792、S793、T794、S795、E796、T797、1798、1799、D800、1801、N802、G803、T804、V805、 M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、 M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、L830、1831、V832、Q833、1834、L835、 A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、 V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、 G866、S867、Ν868、Κ869、V870、G871、S872、Η873 或 Τ874。
[0057] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段阻斷抗體在距 離ADAMTS-5的殘基8埃以內(nèi)的位置上與ADAMTS-5結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述ADAMTS-5 的殘基選自至少一種以下 ADAMTS-5 殘基：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、 K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、1751、P752、E753、G754、 A755、T756、H757、1758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、 R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、 L785、1786、N787、G788、K789、Y790、M791、1792、S793、T794、S795、E796、T797、1798、1799、 D800、1801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、 D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、 L830、1831、V832、Q833、1834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、 V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、 N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873 或 T874。
[0058] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段在與蛋白聚糖聚合物結(jié)合 ADAMTS-5的位置重疊的位置上結(jié)合ADAMTS-5。
[0059] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段降低了蛋白聚糖聚合物結(jié) 合ADAMTS-5的可能性，所述結(jié)合發(fā)生距離至少一種以下的ADAMTS-5殘基8埃以內(nèi)的位置 上：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、 T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、 R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、 A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、1786、N787、G788、K789、Y790、 M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、 M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、 M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、L830、1831、V832、Q833、1834、L835、 A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、 V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、 G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873 或 T874。
[0060] 本發(fā)明提供包含治療有效量的本文公開的抗體、pH保持在約4. 5至約6. 5的緩沖 液和任選的表面活性劑的制劑。
[0061] 所述制劑通常用于本發(fā)明公開的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其活性 濃度原則為約〇· lmg/ml至約100mg/ml。在某些實(shí)施方式中，所述抗體、其重組或合成抗原 結(jié)合片段的濃度是約〇· lmg/ml至lmg/ml ;優(yōu)選為lmg/ml至10mg/ml，優(yōu)選為10至l〇〇mg/ ml〇
[0062] 出于本文目的，"藥物組合物"是適合且合適給予哺乳動(dòng)物（尤其是人）的藥物組 合物。因此，所述組合物可用于治療哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥。此外，所述組合物中的抗體 已經(jīng)過一次或多次純化或分離步驟，從而已將可能對(duì)其治療應(yīng)用產(chǎn)生千擾的污染物分離在 夕卜。所述藥物組合物通常包括治療性的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。所述組 合物通常是無菌的，并且可被凍干。下文更詳細(xì)地描述了藥物制備。
[0063] 可通過混合具有所需純度的抗體和任選的生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn) 定劑（Remington's Pharmaceutical Sciences (《雷明頓藥物科學(xué)》）第 16 版，0sol，A. 編，1980)來制備凍千制劑或水溶液形式的所述一種或多種抗體的治療制劑?？山邮艿倪\(yùn) 載體、賦形劑或穩(wěn)定劑就使用的劑量和濃度而言是對(duì)接受者無毒的，并且可包括緩沖液、抗 氧化劑、防腐劑、肽、蛋白質(zhì)、親水性聚合物、螯合劑（如EDTA)、糖類、成鹽的反荷離子（如 鈉）；金屬復(fù)合物（例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物）；和/或非離子表面活性劑（例如T寶EE_、 PLURONICS?或聚乙二醇（PEG))。
[0064] 活性成分也可包入通過例如凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊中，示例分別是羥 甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯）微膠囊，或包入膠體藥物遞送系統(tǒng) (例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊）或包入乳池液（macroemulsion) 中。此類技術(shù)可參見Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明頓藥物科學(xué)》）第16 版，OsolA.編（1980)。用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可通過無菌濾膜過濾容易地 實(shí)現(xiàn)。
[0065] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，就疾病預(yù)防或治療而言，本發(fā)明的抗Sp-ADAMTS-5抗體的 合適劑量將取決于待治療的疾病類型、所述疾病的嚴(yán)重性和療程、所述抗體是否以預(yù)防或 治療目的給予、先前的治療、患者的臨床史和對(duì)所述抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)師的判斷。所 述抗體適于以一次或經(jīng)一系列治療給予所述患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重性，給予患者的 抗體或其片段的初始候選劑量是約1 μ g/kg至15mg/kg,例如，通過一次或多次分開給予或 通過連續(xù)輸注來給予。對(duì)于經(jīng)數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)給藥，可根據(jù)所述病癥使治療持續(xù)直 至疾病癥狀得到所需的抑制。然而，也可采用其他劑量方案?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)和方法來容 易地監(jiān)測(cè)治療進(jìn)展。
[0066]所述抗體組合物應(yīng)以遵循良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方式來制備、配劑和給予。本發(fā)明的抗 體/衍生物可通過任何合適的途徑給予。這包括（但不限于）腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮 下、關(guān)節(jié)內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚給藥。優(yōu)選的給藥方式是關(guān)節(jié)內(nèi)途徑。 這種情況下，考慮的因素包括治療的具體病癥、治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀 況、所述病癥的起因、試劑的遞送位點(diǎn)、給藥方法、給藥安排，以及醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的其它 因素。待給予的抗體的"治療有效量"將由此類考慮來決定，并且是所需的最小量，以預(yù)防、 改善或治療疾病或病癥。所述抗體不需要，但可任選地與一種或多種當(dāng)前使用的試劑一同 配制以預(yù)防或治療所針對(duì)的病癥。此類其它試劑的有效量取決于所述制劑中抗體的量、病 癥或治療類型，以及上述其它因素。
[0067]本文的術(shù)語"抗體"以其最廣泛含義使用，并且涵蓋不同抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于 單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體），和抗體片段（前提是它們顯 示所需的抗原結(jié)合活性）。
[0068] "抗體片段"指除完整抗體以外的分子，所述分子包含完整抗體的部分，該部分結(jié) 合與所述完整抗體結(jié)合的抗原?？贵w片段的示例包括但不限于，F(xiàn)v、Fab、Fab'、Fab，-SH、 F(ab'）2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗 體。
[0069] 作為參考抗體的"結(jié)合相同表位的抗體"指在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中阻斷參考抗體與其抗 原50%或更多的結(jié)合的抗體，或者相反地，在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中參考抗體阻斷所述抗體與其抗原 50%或更多的結(jié)合。本文提供了示例性競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。
[0070] 術(shù)語"嵌合"抗體指其中重鏈和/或輕鏈部分來源于特定來源或物種，而剩余的重 鏈和/或輕鏈來源于不同的來源或物種的抗體。
[0071] 抗體的"類別"指恒定結(jié)構(gòu)域或其重鏈具有的恒定區(qū)的類型。有五種主要的抗體 類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中的幾種還可分成亞類（同種型），例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為[α ]、 [δ ]、[ ε ]、[ γ ]和[μ ]。
[0072] 本文中術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義包含至少一部分恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)。 所述術(shù)語包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。除非本文中另有定義，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中氨基 酸殘基的編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)（也稱為EU索引，參見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》），第5版，公共健康服務(wù)部 (Public Health Services)，國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)，馬里蘭 州貝塞斯達(dá)，1991)。
[0073] "構(gòu)架"或"FR"指高變區(qū)（HVR)殘基以外的可變區(qū)殘基。可變區(qū)的FR通常由四個(gè) FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出現(xiàn)在VH(或VL)的以下 序列中：FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0074] 術(shù)語"全長(zhǎng)抗體"、"完整抗體"和"全抗體"在本文中可互換使用，以表示具有與天 然抗體結(jié)構(gòu)基本類似的結(jié)構(gòu)或者具有包含本文所定義的Fc區(qū)的重鏈的抗體。
[0075] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"、"宿主細(xì)胞系"和"宿主細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用，并且指已引入 外源核酸的細(xì)胞，包括此類細(xì)胞的子代。宿主細(xì)胞包括"轉(zhuǎn)化株"和"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"，其包括最 初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及其衍生的子代，不計(jì)傳代次數(shù)。子代的核酸含量可不與親本細(xì)胞完全相同， 并可包含突變。本文包括功能或生物活性與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的功能或生物活 性相同的突變子代。
[0076] "人抗體"是具有的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，或具有的氨基酸 序列來源于非人來源但使用人抗體庫的抗體，或具有其它編碼人抗體的序列的抗體。人抗 體的這一定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0077] "人共有構(gòu)架"是代表人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇中最常出現(xiàn)的氨 基酸殘基的構(gòu)架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變結(jié)構(gòu)域序列的亞組。 通常，序列的亞組是Kabat等定義的亞組，參見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》），第5版，NIH出版物，馬里蘭州 貝塞斯達(dá)（1991)，卷1-3)。
[0078] "人源化"抗體指含有來自非人類HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的 嵌合抗體。在某些實(shí)施方式中，人源化抗體基本包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的全 部，其中，全部或基本全部的HVR(例如CDR)對(duì)應(yīng)于非人抗體的那些，并且全部或基本全部 的FR對(duì)應(yīng)于人抗體的那些。人源化的抗體可任選地包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少 一部分?？贵w的"人源化形式"，例如非人抗體，指已經(jīng)過人源化的抗體。
[0079] "去免疫化"抗體是基于HLA結(jié)合（T細(xì)胞刺激的基本要求）破壞的免疫原性降低 的抗體。
[0080] 本文所用術(shù)語"高變區(qū)"或"HVR"指抗體可變結(jié)構(gòu)域的各區(qū)域，其中序列高度可 變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)（"高變環(huán)"）。通常，天然的四鏈抗體包含六個(gè)HVR;三個(gè) 在VH(HI，H2, H3)，三個(gè)在VL(LI，L2, L3)。HVR通常包含來自高變環(huán)和/或來自"互補(bǔ)決 定區(qū)"（CDR)的氨基酸序列，后者具有最高的序列可變性和/或涉及抗原識(shí)別。示例性 高變環(huán)出現(xiàn)在氨基酸殘基 26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (HI)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia 和 Lesk，J_Mol_Biol_ 196:901-917, 1987)。示例性 CDR(CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出現(xiàn)于L1的氨基酸殘基24-34、L2的氨基酸殘 基50-56、L3的氨基酸殘基89-97、Η1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-65以及H3 的氨基酸殘基 95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (《免 疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》），第5版，公共健康服務(wù)部（Public Health Services)，國(guó)立 衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)，馬里蘭州貝塞斯達(dá)，1991)。除VH中的 CDR1外，⑶R通常包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含與抗原接觸的"特異性決定殘 基"或"SDR"。SDR包含在稱為小型-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的CDR區(qū)中。示例性 a_CDR(a_CDR-Ll、a_CDR-L2、a-CDR-L3、a _CDR_Hl、a-CDR-H2 和 a-CDR-H3)出現(xiàn)于 L1 的氛基 酸殘基31-34、L2的氨基酸殘基50-55、L3的氨基酸殘基89-96、H1的氨基酸殘基31-35B、 H2的氨基酸殘基50-58以及H3的氨基酸殘基95-102(參見Almagro和Fransson，F(xiàn)ront. Biosci. 13:1619-1633, 2008)。除非另有說明，本文中根據(jù)Kabat等對(duì)可變結(jié)構(gòu)域中的HVR 殘基和其他殘基（例如FR殘基）進(jìn)行編號(hào)。
[0081] 本文所用術(shù)語"單克隆抗體"指獲自基本均一抗體群的抗體，即，除可能的變體抗 體（例如少量存在的包含天然發(fā)生的突變或在單克隆抗體制備生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的變體）以 夕卜，所述群包含的單獨(dú)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位。不同于通常包含針對(duì)不同決 定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制劑，單克隆抗體制劑中的各單克隆抗體均針對(duì)抗 原上的單一決定簇。因此，定語"單克隆"表明的抗體特征在于獲自基本均一的抗體群，而 不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生所述抗體。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可 以通過不同技術(shù)制備，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法和使用 包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體 的此類方法和其它示例性方法。
[0082] 術(shù)語"包裝插頁"指治療性產(chǎn)品的商品包裝中常包括的說明書，所述說明書包含關(guān) 于這類治療性產(chǎn)品使用的說明、用法、劑量、給藥、聯(lián)合治療、禁忌癥和/或警告的信息。 [0083] 與參照多肽序列相關(guān)的"氨基酸序列相同性百分率"被定義為，在對(duì)齊所述 序列并引入缺口（如有需要）以達(dá)到最大序列相同性百分率之后，候選序列中與參照多肽 序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率，并且認(rèn)為任何保守性取代都不作為所述 序列相同性的部分。以測(cè)定氨基酸序列相同性百分率為目的的比對(duì)可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍 內(nèi)的不同方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用公共渠道可獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megal ign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于比對(duì)序列的合適參數(shù)，包括使比較 的序列實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)最大對(duì)齊所需的任何算法。
[0084]術(shù)語"藥物制劑"指此類形式的制劑：所述制劑允許其中所含活性成分的生物學(xué)活 性有效，并且不含具有待給予該制劑的對(duì)象不可接受的毒性的額外成分。
[0085] "藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"指藥物制劑中活性成分以外的成分，其對(duì)對(duì)象無毒。藥 學(xué)上可接受的運(yùn)載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0086] 本文中所用的"治療"（及其語法變化形式）指試圖改變受治療的個(gè)體的自然病 程，并且可供預(yù)防或在臨床病理學(xué)的病程中采用的臨床介入。所需的治療效果包括但不限 于，預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理學(xué)結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、 減緩疾病進(jìn)展速率、改善或減輕疾病狀態(tài)，和減輕或改善預(yù)后。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明 的抗體用于延遲疾病發(fā)展或減緩疾病進(jìn)展。
[0087] 術(shù)語"可變區(qū)"或"可變結(jié)構(gòu)域"指涉及抗體與抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域。 天然抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)（分別為VH和VL)通常具有類似結(jié)構(gòu)，其中各結(jié)構(gòu)域包 含四個(gè)保守的框架區(qū)（FR)和三個(gè)高變區(qū)（HYR,參見例如Kindt等，Kuby Immunology (《免 疫學(xué)》），第6版，WHF公司（W. H. Freeman and Co.)，第91頁，2007)。單個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu) 域足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可使用結(jié)合特定抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域以分 離結(jié)合所述抗原的抗體來分別篩選互補(bǔ)VL或VH結(jié)構(gòu)域的庫（參見例如Portolano等， J. Immunol. 150:880-887, 1993 ;Clarkson 等，Nature 352:624-628, 1991)。
[0088] 本文所用術(shù)語"載體"指一種核酸分子，所述核酸分子能夠增殖其連接的另一核 酸。該術(shù)語包括作為自復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體以及整合至其引入的宿主細(xì)胞基因組的載體。 某些載體能夠引導(dǎo)其操作性連接的核酸進(jìn)行表達(dá)。這類載體在本文中稱為"表達(dá)載體"。 [0089] 在另一個(gè)方面，所述抗體或其衍生物包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)序列，所述序列 與選自下組的氨基酸序列存在至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或 100%的序列相同性：SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 或 24。 [0090] 在另一個(gè)方面，所述抗體或其衍生物包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VK或VL)序列，所述序 列與選自下組的氨基酸序列存在至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或 100%的序列相同性：SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21 或 23。 [0091] 在某些實(shí)施方式中，與所述SEQ ID No·具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同性的VH序列或VK/VL序列相對(duì)于參考序列 含有取代（例如保守性取代）、插入或缺失，但包含該序列的抗Sp-ADAMTS-5抗體保留了結(jié) 合ADAMTS-5的間隔結(jié)構(gòu)域的能力。在某些實(shí)施方式中，在⑶ RH3的序列中（如在SEQ ID No. 62中）共取代、插入和/或缺失了 1至4個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，取代、插入或缺 失發(fā)生在HVR外（即在FR中）。
[0092]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是抗體 CRB0017、CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123、 CRB0124,如表III所定義。
[0093]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其片段的解離常數(shù)（Kd)為小于ΙΟΟηΜ、小于 10nM、小于InM、小于(X lnM、小于〇· 〇1油或小于〇. 〇〇inM或更小，例如從10-8M至10-13M， 例如從10-9M至10-13M。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方式中，如以下試驗(yàn)中所述，通過使用感興趣的抗體的Fab進(jìn)行了放 射性標(biāo)記抗原結(jié)合試驗(yàn)（RIA)以測(cè)量Kd jab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和性的測(cè)量方法如下：在 未標(biāo)記抗原的滴定系列（titration series)存在的情況下，使用最小濃度的（I)-標(biāo)記的 抗原平衡Fab,隨后使用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原（參見例如 chen等，j. M〇1. Biol·293:865-881(1999))。
[0095] 通過參考以下附圖的非限制性實(shí)施例來描述本發(fā)明。
[0096] 圖1. ADAMTS-4和ADAMTS-5的示意圖。兩種酶都是從細(xì)胞分泌至胞外空間的多結(jié) 構(gòu)域金屬蛋白酶。兩種酶都具有類似的結(jié)構(gòu)域排布，由信號(hào)序列（SS)、前結(jié)構(gòu)域（Pro)、催 化金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域（Cat)、去整合素（Dis)結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白（TS) I型結(jié)構(gòu)域、富半 胱氨酸（CysR)結(jié)構(gòu)域和間隔（Sp)結(jié)構(gòu)域組成。此外，ADAMTS-5在間隔結(jié)構(gòu)域后包含額外 的TS結(jié)構(gòu)域。
[0097] 圖2. FPLC純化后ADAMTS_5p75的Western印記分析，使用抗蛋白的FLAG標(biāo)簽的 抗體。使用識(shí)別含有FLAG肽序列的融合蛋白的單克隆抗體探測(cè)Western印記（西格瑪奧 德里奇公司（Sigma-Aldrich)，單克隆抗FLAG M2,1:1000稀釋）。為使用化學(xué)發(fā)光的過氧 化物酶底物進(jìn)行檢測(cè)，使用了抗小鼠 IgG-過氧化物酶（1:10, 000)。TS5二ADAMTS-5轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞；NT =未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；Μ =模擬對(duì)照。
[0098] 圖3.分離的抗Sp_ADAMTS-5scFv與間隔結(jié)構(gòu)域-GST和GST陰性對(duì)照的ELISA反 應(yīng)性。以10 μ g/mL的濃度包被間隔結(jié)構(gòu)域-GST和GST抗原。以50和/或5 μ g/mL的濃 度使用抗Sp_ADAMTS-5scFV (數(shù)據(jù)未顯示）。顯示了兩個(gè)重復(fù)孔中所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的450nm處平 均吸光度，SD以誤差線的形式顯示。
[0099] 圖4.夾心ELISA。3(^8/11^濃度下溶液中包被的0?0017_18〇4與間隔結(jié)構(gòu) 域-GST和/或GST結(jié)合的稀釋曲線。作為二抗，使用了抗GST (1:1000)，隨后使用抗兔IgG HRP(1:2000)進(jìn)行最終檢測(cè)。顯示了兩個(gè)重復(fù)孔中所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的450nm處平均吸光度，SD 以誤差線的形式顯示。
[0100] 圖5.使用Biacore X-100在溶液中進(jìn)行的CRB0017_IgG4結(jié)合間隔結(jié)構(gòu)域-GST 的動(dòng)力學(xué)分析。將5610RU的CRB0017_IgG4固定在CM5芯片上。分別進(jìn)行180s和800s的 結(jié)合和解離。下表顯示了 CRB0017_IgG4/間隔結(jié)構(gòu)域-GST相互作用所確定的動(dòng)力學(xué)速率 常數(shù)和親和性。
[0101] 圖6.使用CRB0017_IgG4進(jìn)行的ADAMTS-5全長(zhǎng)（TS5-FL)的免疫沉淀（IP)。使用 抗Sp_ADAMTS-5CRB0017_IgG4抗體（在泳道1、2和3中分別使用11、22和:寒μ|)，或者使 用11μ g的不相關(guān)抗體作為陰性對(duì)照（泳道4)，對(duì)Mg透析/親和純化的TS5-FL進(jìn)行免 疫沉淀（IP)。使用抗FLAG抗體（1:1000)通過免疫印記分析免疫沉淀。對(duì)應(yīng)于TS5-FL p75 蛋白，觀察到CRB0017_IgG4-免疫沉淀的約81kDa TS5-FL條帶。免疫沉淀的TS5-FL蛋白 的分子量略高于由其氨基酸組成預(yù)測(cè)的值。該差異是因?yàn)镈is、CysR、Sp結(jié)構(gòu)域中的N-糖 基化和C端結(jié)構(gòu)域上的〇-糖基化。圖左側(cè)顯示了分子量標(biāo)記。
[0102] 圖 7.使用 CRB0017_IgG4 進(jìn)行的 ADAMTS-4 全長(zhǎng)（TS4-FL)的 IP。使用抗 Sp_ ADAMTS-5CRB0017_IgG4抗體（在泳道1和2中分別使用30和60 μ g)，或者使用不相關(guān)抗 體（3() pg )作為陰性對(duì)照（泳道3)，對(duì)0.2yg透析/親和純化的TS4-FL進(jìn)行免疫沉 淀（IP)。在泳道4中，加載了透析/親和純化的TS4-FL作為陽性對(duì)照。使用抗FLAG抗體 (1:1000)通過免疫印記分析免疫沉淀。對(duì)應(yīng)于TS4-FL p68蛋白，觀察到CRB0017_IgG4-免 疫沉淀的約75kDa TS5-FL條帶。免疫沉淀的TS4-FL蛋白的分子量略高于由其氨基酸組成 預(yù)測(cè)的值，這主要是因?yàn)樵摰鞍字写嬖诘腘-和0-糖基化。圖左側(cè)顯示了分子量標(biāo)記。
[0103] 圖8.抗Sp_ADAMTS-5IgG4在IL-1 α誘導(dǎo)的牛軟骨體外蛋白水解中的作用。該圖 代表了在CRB0017IgG4存在或不存在的條件下孵育48小時(shí)后IL_i α 5ng/ml活性（三個(gè)不 同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。各實(shí)驗(yàn)中使用人天然的IgG4(賽羅泰克公司（Serotec))作為陰性對(duì)照。 各實(shí)驗(yàn)中使用合成的ADAMTS-5抑制劑（Cpd23)和天然的ADAMTS-5抑制劑（TIMP-3)作為 陽性對(duì)照。結(jié)果以糖胺聚糖（GAG)釋放百分比的形式顯示，即以蛋白聚糖聚合物片段的形 式從培養(yǎng)的軟骨中釋放的GAG的量；該方法測(cè)量了細(xì)胞因子在刺激軟骨代謝中的效率。
[0104] 圖9.在骨關(guān)節(jié)炎的STR/ort小鼠模型中螺旋B-ADAMTS-5結(jié)合蛋白CRB0016_IgG4 作用的評(píng)價(jià)。在各動(dòng)物的兩膝中經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)給予CRB0016_IgG4,第一次在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)給予并 在6周后再次給予，劑量為1、2和12 μ g/膝。第一次給藥后三個(gè)月時(shí)，根據(jù)組織病理學(xué)評(píng) 估，CRB0016_IgG4沒有改變STR八)rt小鼠品系中0A的過程。等級(jí)定義為通過關(guān)節(jié)軟骨的裂 縫深度。階段定義為與潛在等級(jí)無關(guān)的關(guān)節(jié)室一側(cè)中所涉及軟骨的水平程度。總之，兩者 一起構(gòu)建了骨關(guān)節(jié)炎過程的嚴(yán)重度或病理進(jìn)展的指標(biāo)，實(shí)際上0ARSI評(píng)分定義為等級(jí)X階 段。細(xì)胞損失定義為特定關(guān)節(jié)室中經(jīng)歷細(xì)胞死亡的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞占比。GAG(糖胺聚糖）損 失定義為代表針對(duì)GAG的異染性的陽離子染色損失并由此進(jìn)行評(píng)估，例如甲苯胺藍(lán)或番紅 OoMankin將他的評(píng)分定義為等級(jí)、細(xì)胞損失和GAG損失的總和，同時(shí)將總評(píng)分定義為0ARSI 評(píng)分和細(xì)胞損失和GAG損失的總和。所有上述參數(shù)構(gòu)成了 〇A的特性，且其評(píng)分用于測(cè)量病 變的嚴(yán)重度和發(fā)展。
[0105] 圖10.在骨關(guān)節(jié)炎的STR/ort小鼠模型中CRB0017_IgG4作用的評(píng)價(jià)。在各動(dòng)物 的兩膝中經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)給予CRB0017_IgG4,第一次在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)給予并在6周后再次給予，劑 量為1、2和12ug/膝。第一次給藥后三個(gè)月時(shí)，在STR/ort小鼠模型中，CRB017_IgG4顯 示出降低0A嚴(yán)重度方面劑量依賴的活性。所有參數(shù)由圖9定義。
[0106] 圖11. A)CRB0017_IgG4能夠以劑量依賴的方式識(shí)別從透化或非透化細(xì)胞中分泌 的ADAMTS-5。作為對(duì)照，使用了抗ADAMTS-5商品化抗體催化結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)抗ADAMTS-5商 品化抗體cys結(jié)構(gòu)域的抗體。B)CRB0017_IgG4不與在HEK293細(xì)胞的細(xì)胞表面上的任何蛋 白發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0107] 圖12.在夾心ELISA中使用以下文材料部分所述進(jìn)行包被的mAb CRB0017_IgG4 攻擊從 Hek293_ADAMTS-5 (ADAMTS-5 濃縮培養(yǎng)基（cond. Medium))和 Hek293 (Hek-293 濃縮 培養(yǎng)基）收獲的上清液。"無 mAb CRB0017"是孔未包被CRB0017_IgG4的對(duì)照條件，"無培 養(yǎng)基"是孔中未加入上清液的對(duì)照條件，"Ab"是孔中僅加入二抗的對(duì)照條件。如圖所示， CRB0017_IgG4能夠以高特異性識(shí)別從表達(dá)HEK293的細(xì)胞中分泌的ADAMTS-5。
[0108] 圖13.單側(cè)內(nèi)側(cè)半月板撕裂模型（MMT)是一種廣泛使用的膝0A的大鼠外科模型。 發(fā)生了快速進(jìn)展的退行性變化，包括軟骨細(xì)胞和蛋白聚糖損失、基質(zhì)原纖化和產(chǎn)生裂縫、形 成骨刺。手術(shù)后一周，使用CRB001 7_IgG4 35ug/膝、CRBOOHYOyg/膝或載劑經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi) 給予大鼠。注射后三周時(shí)，處死動(dòng)物并處理股脛關(guān)節(jié)用于組織學(xué)分析。與載劑相比，使用 CRB0017_IgG4治療后所有組織學(xué)評(píng)分均出現(xiàn)了劑量依賴的下降。
[0109] 圖14.游離的多配聚糖_4對(duì)mAb ADAMTS-5與mAb CRB0017包被平板結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng) 性抑制。阻斷前使mAb CRB0017(包被緩沖液中2yg/ml)吸附至免疫板。加入經(jīng)固定的 11^13〇^0017前，使六0六1?^-5(4以8/1111)在多配聚糖-4(0.1以8/1111)存在的情況下孵育。使 用抗FLAG商品化抗體顯示ADAMTS-5與mAbCRB0017包被平板的結(jié)合。
[0110] 圖 15. mAbs 抗間隔結(jié)構(gòu)域CRB0017_IgG4、CRBO〇93_IgG4、CRB〇 94_IgG4和 CRB0124_ IgG4能夠在夾心ELISA中以相當(dāng)?shù)奶禺愋蕴禺惖刈R(shí)別全長(zhǎng)ADAMTS-5。該試驗(yàn)中，mAb CRB0123_IgG4對(duì)ADAMTS-5的結(jié)合能力高于其他抗間隔結(jié)構(gòu)域mAb。
[0111] 發(fā)明詳述
[0112] 序列描述
[0113] SEQ· ID N0:1 :ATS4_A，具有血小板反應(yīng)蛋白基序4的去整合素和金屬蛋白酶 (UniProtKB/Swiss-Prot:075173. 3)
[0114] SEQ. ID N0:2 :ATS5_A，具有血小板反應(yīng)蛋白基序5的去整合素和金屬蛋白酶 (UniProtKB/Swiss-Prot:Q9UNA0. 2)
[0115] 下文中：VK =輕鏈，VH =重鏈，CDRL =輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，⑶RH =重鏈互補(bǔ)決定區(qū)。
[0116] SEQIDNO:3至SEQIDNO:94，SEQIDNO:125至132以及SEQIDNO:135至SEQ ID N0:137是氨基酸序列，SEQ ID N0:95至120是核苷酸序列。
[0117] SEQ. ID N0:3,CRB0017VK
[0118] SEQ. ID N0:4, CRB0017VH
[0119] SEQ. ID N0:5, CRB0018VK
[0120] SEQ. ID N0:6, CRB0018VH
[0121] SEQ. ID N0:7, CRB0019VK
[0122] SEQ. ID N0:8, CRB0019VH
[0123] SEQ. ID N0:9, CRB0091VK
[0124] SEQ. ID NO: 10, CRB0091VH
[0125] SEQ. ID NO: 11, CRB0092VL
[0126] SEQ. ID NO: 12, CRB0092VH
[0127] SEQ. ID NO: 13, CRB0093VK
[0128] SEQ. ID NO: 14, CRB0093VH
[0129] SEQ. ID NO: 15, CRB0094VL
[0130] SEQ. ID N0:16, CRB0094VH
[0131] SEQ. ID NO: 17, CRB0102VK
[0132] SEQ. ID NO: 18, CRB0102VH
[0133] SEQ. ID NO: 19, CRB0122VL
[0134] SEQ. ID NO: 20, CRB0122VH
[0135] SEQ. ID NO: 21, CRB0123VK
[0136] SEQ. ID NO :22, CRB0123VH
[0137] SEQ. ID NO :23, CRB0124VL
[0138] SEQ. ID NO :24, CRB0124VH
[0139] SEQ. ID NO :25, CRB0016VK
[0140] SEQ. ID NO :26, CRB0016VH
[0141] SEQ. ID NO :27, CDRL1-17
[0142] SEQ. ID NO: 28, CDRL2_17
[0143] SEQ. ID NO: 29, CDRL3_17
[0144] SEQ. ID N0:30, CDRL1-18 〔0145U gmpID NO: 310DRL2I18 〔0146U gmpΙο NO: 320DRL3I18 〔0147U gmpid NO: 330DRLI19 〔0148〕 SEPID NO: 340DRL2I19 〔0149U gmpΙο NO: 350DRL3I19 〔015s SEQ· ID NO: 360DRLI91 〔0151U gmpΙα NO: 370DRL2I91 〔0152U gmpΙα NO: 380DRL3I91 〔0153U gmpid NO: 390DRLI92 〔01541--1gmpid NO: 400DRL2I92 〔015s SEQ· ID NO :410DRL3I92 〔0156U gmpid NO: 420DRLI93 〔01571--1gmpid NO: 430DRL2I93 〔01581--1gmpΙο NO: 440DRL3I93 〔0152gmpΙο NO: 450DRLIM〔016Sgmpid NO: 460DRL2IM S161I--Igmpid NO: 470DRL3IM 〔0162U gmpΙα NO: 480DRLI102 〔0163U gmpid NO: 490DRL2I102 〔0164U gmpΙο NO: 500DRL3I102 〔0165〕 SEQ· ID NO: 510DRLI122 〔0166U gmpΙο NO: 520DRL2I122 〔0167U gmpid NO: 530DRL3I122 〔0168〕 SEQ· ID NO: 540DRL1I123 〔0169U gmpΙο NO: 550DRL2I123 〔017s SEPID NO: 560DRL3I123〔01711--1gmpid NO: 570DRLI1M 〔01721--1gmpid NO: 580DRL2I1M 〔01731--1gmpid NO: 590DRL3I1M 〔01741--1gmpid NO: 600DRHI17〔0175〕 SEPID NO :610DRH2I17 〔0176〕 SEPID NO: 620DRH3I17 〔0177〕 gmpid NO: 630DRHI18 〔0178〕 SEPID NO: 640DRH2I18 〔0179〕 SEPID NO: 650DRH3I18 〔0180〕 SEPID NO: 660DRHI19 〔0181〕 gmpid NO: 670DRH2I19 〔0182〕 SEPID NO: 680DRH3I19 〔0183U gmpid NO: 690DRHI91
[0184] SEQ. ID NO: 70, CDRH2_91
[0185] SEQ. ID N0:71, CDRH3_91
[0186] SEQ. ID N0:72, CDRH1_92
[0187] SEQ. ID N0:73, CDRH2_92
[0188] SEQ. ID N0:74, CDRH3_92
[0189] SEQ. ID N0:75, CDRH1_93
[0190] SEQ. ID N0:76, CDRH2_93
[0191] SEQ. ID NO: 77, CDRH3_93
[0192] SEQ. ID N0:78, CDRH1_94
[0193] SEQ. ID N0:79, CDRH2_94
[0194] SEQ. ID N0:80, CDRH3_94
[0195] SEQ. ID N0:81, CDRH1_102
[0196] SEQ. ID N0:82, CDRH2_102
[0197] SEQ. ID N0:83, CDRH3_102
[0198] SEQ. ID N0:84, CDRH1_122
[0199] SEQ. ID N0:85, CDRH2_122
[0200] SEQ. ID N0:86, CDRH3_122
[0201] SEQ. ID N0:87, CDRH1_123
[0202] SEQ. ID N0:88, CDRH2_123
[0203] SEQ. ID N0:89, CDRH3_123
[0204] SEQ. ID N0:90, CDRH1_124
[0205] SEQ. ID N0:91, CDRH2_124
[0206] SEQ. ID N0:92, CDRH3_124
[0207] SEQ. ID NO:93, lexA-間隔結(jié)構(gòu)域
[0208] SEQ. ID NO:94,間隔結(jié)構(gòu)域-GST
[0209] SEQ. ID NO :95, CRB0016_VK
[0210] SEQ. ID N0:96, CRB0016_IgG4
[0211] SEQ. ID N0:97, CRB0017_VK_CK
[0212] SEQ. ID NO:98, CRB0017_IgG4
[0213] SEQ. ID NO :99, CRB0017_VK
[0214] SEQ. ID NO: 100, CRB0017_VH
[0215] SEQ. ID NO: 101, CRB0018_VK
[0216] SEQ. ID NO: 102, CRB0018_VH
[0217] SEQ. ID NO: 103, CRB0019_VK
[0218] SEQ. ID NO: 104, CRB0019_VH
[0219] SEQ. ID NO: 105, CRB0091_VK
[0220] SEQ. ID NO: 106, CRB0091_VH
[0221] SEQ. ID NO:107, CRB0092_VL
[0222] SEQ. ID NO: 108, CRB0092_VH
[0223] SEQ. ID NO: 109, CRB0093_VK
[0224] SEQ. ID NO:110, CRB0093_VH
[0225] SEQ. ID NO: 111, CRB0094_VL
[0226] SEQ. ID NO:112, CRB0094_VH
[0227] SEQ. ID NO: 113, CRB0102_VL
[0228] SEQ. ID NO: 114, CRB0102_VH
[0229] SEQ. ID NO: 115, CRB0122_VL
[0230] SEQ. ID NO: 116, CRB0122_VH
[0231] SEQ. ID NO: 117, CRB0123一VK
[0232] SEQ, ID NO: 118, CRB0123_VH
[0233] SEQ. ID NO: 119, CRB0124_VL
[0234] SEQ. ID NO:120, CRB0124_VH
[0235] SEQ. ID NO: 121,人間隔結(jié)構(gòu)域 _M
[0236] SEQ. ID N0:122,螺旋 _B_ADAMTS-5_M
[0237] SEQ. ID NO: 123,人間隔結(jié)構(gòu)域
[0238] SEQ. ID N0:124,螺旋 _B_ADAMTS_5
[0239] SEQ. ID NO:125, CRB0017-scFv
[0240] SEQ. ID NO:126, CRB0018_scFv
[0241] SEQ. ID NO:127, CRB0019_scFv
[0242] SEQ. ID NO:128, CRB0091_scFv
[0243] SEQ.ID NO:129, CRB0092_scFv
[0244] SEQ. ID NO:130, CRB0093_scFv
[0245] SEQ. ID NO: 131, CRB0094_scFv
[0246] SEQ. ID NO:132, CRB0102_scFv
[0247] SEQ. ID N0:133,人 ADAMTS-5-cDNA
[0248] SEQ. ID N0:134,人 ADAMTS-4_cDNA
[0249] SEQ. ID NO:135, CRB0122_scFv
[0250] SEQ. ID NO:136, CRB0123_scFv
[0251] SEQ. ID NO:137, CRB0124-scFv
[0252] SEQ. ID NO: 138,小肽接頭
[0253] SEQ. ID NO: 139-216,合成的引物
[0254] 材料和方法
[0255] 來自人淋巴細(xì)胞的SPLINT文庫
[0256] 用于人類疾病治療的治療性抗體的開發(fā)長(zhǎng)期以來始終是抗體領(lǐng)域許多研 究人員的目標(biāo)。獲得這類抗體的一種方法是通過由人淋巴細(xì)胞構(gòu)建的胞內(nèi)抗體的 單爸文庫（Single Pot Library of Intracellular Antibodies)(SPLINT 文庫）。 SPLINT 技術(shù)表達(dá) pMVl 載體（來源于 pLinker220 載體（Visintin 等，2004. JImmunol Methods. 290:135-153))中克隆的人scFv(單鏈抗體片段）文庫，其與Vpi6激活結(jié)構(gòu)域融 合?？勺儏^(qū)與小肽接頭（SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT，SEQ ID No. 138)連接。pMVl 含有 LEU2 基 因和bla基因，所述LEU2基因使質(zhì)粒維持并在缺少亮氨酸的培養(yǎng)基上在酵母株系L40中進(jìn) 行選擇，所述bla基因使質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行選擇。
[0257] 為構(gòu)建人SPLINT文庫，使用了來自100個(gè)未免疫供體的外周血。收集了來自各供 體的約2-20ml血液樣本。使用Ficoll plaque試劑（安瑪西亞公司（Amersham)，美國(guó)）從 外周血中分離B淋巴細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將稀釋的血液樣本（血液與PBS的比例為1:1)小心疊 放在Ficoll plaque試劑頂部，隨后將兩相溶液以400 Xg離心30分鐘。從兩相之間的界面 處收集B淋巴細(xì)胞。使用RNeasy小型試劑盒（凱杰公司（Qiagen))根據(jù)生產(chǎn)商說明書從 B淋巴細(xì)胞中提取總RNA。從B淋巴細(xì)胞中制備總RNA，并在用于分離mRNA前收集總RNA。 使用Oligotex mRNA小型試劑盒（凱杰公司（Qiagen))根據(jù)生產(chǎn)商說明書制備mRNA。根 據(jù)生產(chǎn)商說明書使用Therm〇S CriptTMRT-PCR系統(tǒng)（英杰公司（Invitrogen))進(jìn)行cDNA合 成反應(yīng)。使用寡（dT)20以合成V-基因庫的cDNA。為減少擴(kuò)增偏置，發(fā)明人使用引物組中 所有可能的組合（對(duì)于huSPLINT_09參見表I ;對(duì)于huSPLINT_10參見表II)進(jìn)行了 62次 (對(duì)huSPLINT_09)和75次（對(duì)huSPLINT_10)獨(dú)立的PCR反應(yīng)以擴(kuò)增V基因片段。
[0258] 理論上涵蓋整個(gè)人抗體基因庫的引物序列獲自頂GT/GENE-DB (Giudicel 1 i 等，2〇〇5· Stud Health Technol Inform. II6:3-8)，并根據(jù)先前公開的方法改良 (Sblattero 和 Bradbury,1998· Immunotechnology. 3:271-278) ; (Marks 等，1991. Eur J Immunol· 21:985-991) ; (Orlandi 等，1992.Biotechnology. 24:527-531)。在該 方法中，單個(gè)重排的重鏈和輕鏈可變區(qū)獨(dú)立地?cái)U(kuò)增并通過一系列重疊的聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)步驟連接以得到用于克隆的最終 scFv產(chǎn)物（Visintin等，2004. J Immunol Methods. 290:135-153)。
[0259] 用于huSPLINT_9(表I)的PCR反應(yīng)包括7個(gè)VH正向引物和與之配對(duì)的4個(gè)VH 反向引物，生成總共28個(gè)反應(yīng)；而4個(gè)Vk正向引物和與之配對(duì)的4個(gè)反向引物生成了總 共16個(gè)反應(yīng)；9個(gè)νλ正向引物和與之配對(duì)的2個(gè)νλ反向引物生成了總共18個(gè)反應(yīng)。 [0260] 表I :人V-基因鏈的huSPLINT_09PCR反向（rv)和正向（fw)引物。
[0261]

【權(quán)利要求】
1. 一種能夠識(shí)別并結(jié)合表位的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述表位包含于 ADAMTS-5的SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸874的區(qū)域中。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH3)氨基酸序列，所述⑶RH3氨基酸序 列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:62、65、68、71、74、77、80、 83、86、89 和 92。
3. 如權(quán)利要求2所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH2)氨基酸序列，所述⑶RH2氨基酸 序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、 79、82、85、88 和 91。
4. 如權(quán)利要求3所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH1)氨基酸序列，所述⑶RH1氨基酸 序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:60、63、66、69、72、75、 78、 81、84、87 和 90。
5. 如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、 其重組或合成的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL3)氨基酸序列，所述 CDRL3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:29、32、35、 38、41、44、47、50、53、56 和 59。
6. 如權(quán)利要求5所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL2)氨基酸序列，所述⑶RL2氨基酸 序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：28、31、34、37、40、43、46、49、52、55 和58。
7. 如權(quán)利要求6所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL1)氨基酸序列，所述⑶RL1氨基酸 序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：27、30、33、36、39、42、45、48、51、54 和57。
8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、 其重組或合成的抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH1)氨基酸序列，所述 CDRH1氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:60、63、66、 69、72、75、78、81、84、87和90;以及重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（〇)冊(cè)2)氨基酸序列，所述〇)冊(cè)2氨基 酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、 79、 82、85、88和91;以及重鏈互補(bǔ)決定區(qū)〇：0冊(cè)3)氨基酸序列，所述^冊(cè)3氨基酸序列與選 自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:62、65、68、71、74、77、80、83、86、 89 和 92。
9. 如權(quán)利要求8所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合成 的抗原結(jié)合片段還包含至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL1)氨基酸序列，所述⑶RL1氨基酸 序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80 %的相同性：SEQ ID NO: 27、30、33、36、39、42、 45、48、51、54和57;以及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)〇^此2)氨基酸序列，所述^此2氨基酸序列與選 自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:28、31、34、37、40、43、46、49、52、 55和58;以及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列與選自下組的 氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:29、32、35、38、41、44、47、50、53、56 和 59。
10. 如權(quán)利要求8所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID No. 60具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，與SEQ ID No. 61具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 62具有至少80% 相同性的CDRH3氨基酸序列。
11. 如權(quán)利要求10所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段還包含與SEQ ID No. 27具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，與 SEQ ID No. 28具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 29具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
12. 如權(quán)利要求8所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID No. 81具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，與SEQ ID No. 82具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 83具有至少80% 相同性的⑶RH3氨基酸序列。
13. 如權(quán)利要求12所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段還包含與SEQ ID No. 48具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，與 SEQ ID No. 49具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 50具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
14. 如權(quán)利要求8所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID No. 87具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，與SEQ ID No. 88具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 89具有至少80% 相同性的CDRH3氨基酸序列。
15. 如權(quán)利要求14所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、其重組或合 成的抗原結(jié)合片段還包含與SEQ ID No. 54具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，與 SEQ ID No. 55具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及與SEQ ID No. 56具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
16. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段，所述抗體、 其重組或合成的抗原結(jié)合片段是單克隆抗體或嵌合或人源化的，或去免疫化的或完全人抗 體。
17. 用于治療和/或預(yù)防軟骨降解相關(guān)病癥的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體、其 重組或合成的抗原結(jié)合片段。
18. 用于治療和/或預(yù)防骨人關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述 的抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段。
19. 一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1-18中定義的抗體、其重組或合成的 抗原結(jié)合片段。
20. 如權(quán)利要求19所述的編碼抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段的核酸分子，所述 核酸分子包含至少一個(gè)選自SEQ ID No. 99至SEQ ID No. 120的核酸序列。
21. -種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體編碼如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的抗體。
22. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求19或20所述的核酸。
23. 如權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述 的抗體。
24. -種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要 求23所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。
25. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的 抗體、其重組或合成的抗原結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
26. 如權(quán)利要求25中所述的組合物在關(guān)節(jié)內(nèi)給藥中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK104245737SQ201380019819
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月13日
【發(fā)明者】R·秋薩洛利, M·維辛廷, G·卡塞利, L·C·羅瓦迪 申請(qǐng)人:羅達(dá)制藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司