用于提高血腦屏障轉(zhuǎn)運的安全性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于提高血腦屏障受體介導(dǎo)的血腦屏障轉(zhuǎn)運的安全性的組合物和方法。
【專利說明】用于提高血腦屏障轉(zhuǎn)運的安全性的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于提高血腦屏障受體介導(dǎo)的血腦屏障轉(zhuǎn)運的安全性的組合物和方 法。
[0002] 背景
[0003] 大分子藥物的腦穿透嚴重受限于在很大程度上不能透過的血腦屏障（BBB)。 有克服該障礙的許多策略，包括利用在腦部微血管內(nèi)皮表達的內(nèi)源受體的轉(zhuǎn)胞吞作用 (transcytosis)運輸通路。已經(jīng)針對這些受體設(shè)計重組蛋白質(zhì)如單克隆抗體，以使得能夠 向腦部進行大分子的受體介導(dǎo)的遞送。已經(jīng)提出了這樣的策略，其在使回到血液的反向轉(zhuǎn) 胞吞作用最小化的同時使腦攝取最大化，以及也使在治療用藥后積累的程度最大化，并且 發(fā)現(xiàn)，對BBB受體具有低親和力的抗體相對于對這種受體的典型高親和力的抗體提供大幅 增加相關(guān)治療部分/分子的BBB轉(zhuǎn)運和CNS滯留的潛力（Atwal等人，Sci. Transl. Med. 3， 84ra43(2011) ;Yu 等人，Sci.Transl.Med.2011 年 5月 25 日：第3卷，第84 期，第 84ra44 頁）。然而，并未完全探宄施用這種抗體和綴合物的安全性。
[0004] 概述
[0005] 單克隆抗體具有用于治療神經(jīng)或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)疾病的極大治療潛力，但 是血腦屏障（BBB)限制其進入腦部。過去的研宄顯示非常小百分比（約0. 1% )的在血流 中循環(huán)的 IgG 穿過 BBB 進入 CNS(Felgenhauer，Klin.Wschr. 52 :1158-1164(1974))，其中該 抗體的CNS濃度可能不足以允許穩(wěn)健的效果。之前發(fā)現(xiàn)，可以通過開發(fā)BBB受體（即運鐵 蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)等）來提 高分布至CNS中的抗體的百分比（參見，例如，W09502421)。例如，可以使抗BBB受體抗體 為多特異性以靶向CNS中的一個或多個所需抗原，或者一個或多個異源分子可以與抗BBB 受體抗體偶聯(lián)；在任何一種情況下，抗BBB受體抗體可以輔助治療性分子穿過BBB向CNS中 遞送。
[0006] 然而，用傳統(tǒng)特異性的高親和力抗體靶向BBB受體通常引起B(yǎng)BB轉(zhuǎn)運的有限增 加。 申請人:后來發(fā)現(xiàn)了，在研宄的抗BBB抗體中，攝取到和分布在CNS中的抗體的數(shù)量與 其對BBB受體的結(jié)合親和力反相關(guān)。例如，相對于更高親和力的抗TfR抗體，以治療劑量 水平給藥的對運鐵蛋白受體（TfR)低親和力的抗體大幅提高了抗TfR抗體的BBB轉(zhuǎn)運 和CNS滯留，并且可以在CNS中更容易地實現(xiàn)治療濃度（Atwal等人，Sci. Transl.Med. 3， 84ra43 (2011))。使用雙特異性抗體實現(xiàn)了這種BBB轉(zhuǎn)運的驗證，所述雙特異性抗體結(jié)合 TfR和淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)裂解酶以及分泌酶（BACE1)兩者。與單獨的單特 異性抗BACE1相比，使用本發(fā)明的方法改造的雙特異性抗TfR/BACEl抗體的單次全身給藥 不僅導(dǎo)致在腦中顯著的抗體攝取，而且還顯著地降低腦A 0 :_4(|水平，表明BBB穿透性影響 抗 BACE1 的效力。（Atwal 等人，Sci.Transl.Med.3,84ra43(2011) ;Yu 等人，Sci.Transl. Med. 3,84ra44(2011))。
[0007] 那些數(shù)據(jù)和實驗突出顯示了使用較低親和力抗體的方法增加抗體被CNS攝取的 若干成因機制。首先，高親和力抗BBB受體（BBB-R)抗體（例如，抗TfR A)通過快速地使在 腦血管系統(tǒng)中的BBB-R飽和來限制腦攝取，因此減少攝取到腦中的抗體的總量并且還限制 其分布至血管系統(tǒng)中。驚人地，降低對BBB-R的親和力提高腦攝取和分布，觀察到從血管系 統(tǒng)到分布在CNS中的神經(jīng)元和相關(guān)的神經(jīng)氈的定位的明顯移動。第二，提出抗體對BBB-R 的較低的親和力消弱了抗體通過BBB-R從BBB的CNS側(cè)回到該膜的血管側(cè)的能力，因為抗 體對BBB-R的整體親和力低并且由于抗體快速擴散到CNS區(qū)室（compartment)中而使抗體 在BBB的CNS側(cè)的局部濃度是不飽和的。第三，在體內(nèi)，以及如對于TfR系統(tǒng)所觀察到的， 對BBB-R具有較低親和力的抗體不會像對BBB-R具有較高親和力的那些那樣被高效地從系 統(tǒng)中清除，并且因此與其較高親和力的對應(yīng)物相比保持在較高的循環(huán)濃度。這是有優(yōu)勢的， 因為較低親和力抗體的循環(huán)抗體水平被維持在治療水平的時間比較高親和力抗體更長，這 因此在更長的時間內(nèi)提高腦對抗體的攝取。此外，在血漿和腦暴露方面的這種提高可以降 低臨床用藥的頻率，這將具有潛在的益處，不僅是對于患者順從性和方便性，而且還在于減 輕抗體和/或與其相偶聯(lián)的治療性化合物的任何潛在的副作用或者脫靶（off-target)效 應(yīng)。
[0008] 選擇/改造以上引用的工作中描述的低親和力BBB-R抗體，以避免干擾運鐵蛋白 與TfR之間的天然結(jié)合，并且因此避免潛在的鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)的副作用。然而，在小鼠中施用這 些抗體中的一些時，觀察到一些明顯的副作用。如在實施例中描述的，小鼠顯示出網(wǎng)織紅細 胞群的明顯消耗的初級反應(yīng)，伴隨著迅速發(fā)作的急性臨床癥狀。使用經(jīng)抗人TfR抗體處理 的人成紅血細胞（erythroblast)細胞系和原始骨髓細胞的另外的體外研宄表明，在人細 胞系統(tǒng)中也可以觀察到TfR陽性紅系細胞的穩(wěn)健消耗（參見，例如，實施例7)。盡管小鼠及 時地從急性臨床癥狀和降低網(wǎng)織紅細胞水平兩者中恢復(fù)，對于能夠安全地用作治療性分子 的抗TfR抗體來說，顯然需要避免或減輕這種對網(wǎng)織紅細胞的影響。
[0009] 因此，本發(fā)明提供這樣的組合物和方法，其大幅減少或消除在抗TfR施用時不希 望的網(wǎng)織紅細胞群下降，同時仍能夠?qū)崿F(xiàn)由以治療濃度施用的低親和力抗TfR抗體提供的 增強的BBB轉(zhuǎn)運、增加的CNS分布和CNS滯留。在本文中所描述的結(jié)果顯示，對抗TfR施用 的初級反應(yīng)（明顯的網(wǎng)織紅細胞消耗和急性臨床體征）很大程度上是由抗體的抗體依賴性 細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC)活性驅(qū)使的，而其余的網(wǎng)織紅細胞消耗作用是由補體通路介 導(dǎo)的。在本文中提供了減輕觀察到的抗TfR抗體對主要和其余網(wǎng)織紅細胞消耗的作用的多 種一般方法，并且其可以單獨或組合使用。
[0010] 在一種方法中，降低或消除抗BBB-R抗體的效應(yīng)子功能，以便降低或消除ADCC活 性。在另一種方法中，進一步降低抗BBB-R抗體對BBB-R的親和力，以使得抗體與網(wǎng)織紅細 胞群的相互作用對所述群的損害小。第三種方法涉及減少血漿中存在的抗BBB-R抗體的 量，以減少網(wǎng)織紅細胞群暴露于潛在有害濃度的抗體。第四種方法尋求保護、穩(wěn)定和/或補 充網(wǎng)織紅細胞群，以使得避免、降低、或減輕歸因于抗BBB-R抗體施用的網(wǎng)織紅細胞群的任 何潛在消耗。
[0011] 如在本文中所描述的，效應(yīng)子功能降低或消除可以通過下列方式實現(xiàn)：⑴降低 或消除抗體的野生型哺乳動物糖基化，（例如，通過在不能發(fā)生這種糖基化的環(huán)境中產(chǎn)生抗 體，通過使一種或多種碳水化合物附著點突變以使得抗體不能被糖基化，或者通過以化學(xué) 方式或酶方式從抗體中在其已經(jīng)糖基化后移除一種或多種碳水化合物）；（ii)通過降低或 消除抗BBB-R抗體的Fc受體結(jié)合能力（例如，通過Fc區(qū)的突變、Fc區(qū)內(nèi)的缺失或Fc區(qū)的 消除）；或者（iii)通過利用已知具有最小或不具有效應(yīng)子功能的抗體同種型（即包括但 不限于IgG4)。
[0012] 如在本文中所描述的，通過降低或消除抗BBB-R抗體的Clq結(jié)合能力（例如，通過 Fc區(qū)的突變、Fc區(qū)內(nèi)的缺失或Fc區(qū)的消除，或者通過修飾抗BBB-R抗體的非Fc部分），或 者通過另外抑制補體系統(tǒng)的活化或活性（例如，通過共同施用一種或多種補體通路活化或 補體通路活性抑制劑），可以實現(xiàn)降低抗體補體活化。
[0013] 當(dāng)抗BBB-R抗體與網(wǎng)織紅細胞或其他細胞類型上的BBB-R的結(jié)合誘發(fā)其消耗時， 如與抗TfR抗體在本文中例示出的，減少抗體與網(wǎng)織紅細胞或其他細胞類型上的BBB-R的 結(jié)合應(yīng)進而降低在抗體施用時觀察到的網(wǎng)織紅細胞或其他細胞類型消耗的量。事實上，這 在本文中證明（參見，例如，圖6B)?？梢允褂迷诒疚闹兴枋龅暮腿缭趯嵤├兴镜娜?何方法來修飾抗BBB-R抗體對BBB-R的親和力。
[0014] 可以以多種方式實現(xiàn)減少血漿中存在的抗BBB-R抗體的量，以便減少網(wǎng)織紅細胞 群暴露于潛在有害濃度的抗體。一種方法是，簡單地降低用藥的抗體的量，潛在地同時還增 加用藥頻率，以使得降低血漿中的最大濃度，但是維持對于功效來說足夠的血清水平，同時 仍然低于細胞消耗副作用的閾值?？梢耘c用藥修飾組合的另一種方法是，選擇或改造具有 與TfR的pH-敏感性結(jié)合的抗TfR抗體，以使得其在pH 7. 4下以如在本文中所描述的所需 的低親和力結(jié)合至血漿中的細胞表面TfR，但是在內(nèi)在化至內(nèi)體區(qū)室時，在所述區(qū)室的相對 較低的pH (pH 5. 5-6.0)下，這種與TfR的結(jié)合迅速并且明顯降低。這種解離可以保護抗體 免于抗原介導(dǎo)的清除，或者增加遞送至CNS或穿過BBB回收的抗體的量。在任何一種情況 下，抗體的有效濃度相對于不包含這種pH靈敏度的抗TfR抗體增加，而不增加抗體的施用 劑量。
[0015] 可以使用藥物或物理方法實現(xiàn)保護、穩(wěn)定和/或補充網(wǎng)織紅細胞群。除了抗BBB-R 抗體之外，可以共同施用（同時或先后）減輕抗體對網(wǎng)織紅細胞群的負面副作用的至少一 種另外的治療劑。這種治療劑的實例包括，但不限于，促紅細胞生成素（EPO)、鐵補充物、維 生素C、葉酸、和維生素B12。還可以通過，例如，用可以來自具有相似血型的另一個體或可 以之前已經(jīng)從被施用抗BBB-R抗體的受試者中提取的相似細胞輸液，進行紅細胞（即網(wǎng)織 紅細胞）的物理替代。
[0016] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解，可以采用前述方法的任何組合以改造抗體（和/ 或其劑量方案），并且在下列各項之間達到最佳平衡：（i)將使抗體和任何綴合化合物向 CNS中的轉(zhuǎn)運最大化的對BBB-R的所需的低親和力；（ii)綴合化合物對其CNS抗原的親和 力（包括作為非限制性實例的抗TfR抗體中的第二或另外的抗原結(jié)合特異性），因為這與 需要在CNS中存在以具有治療效果的化合物的量相關(guān)；（iii)抗BBB-R抗體的清除率；以及 (iv)對網(wǎng)織紅細胞群的影響。
[0017] 還將會理解的是，抗TfR抗體施用的在本文中公認的網(wǎng)織紅細胞消耗作用可以用 于在其中網(wǎng)織紅細胞的過度增殖是問題的任何疾病或病癥的治療。例如，在先天性紅細胞 增多癥（congenital polycythemia)或腫瘤性紅細胞增多癥（neoplastic polycythemia) 中，歸因于例如網(wǎng)織紅細胞的過度增殖的升高的紅細胞計數(shù)導(dǎo)致血液變稠和伴隨的生理癥 狀。其中保留抗體的至少部分效應(yīng)子功能的本發(fā)明的抗TfR抗體的施用將允許未成熟網(wǎng)織 紅細胞群的選擇性移除，而不影響向CNS中的正常運鐵蛋白轉(zhuǎn)運。如在本領(lǐng)域中所熟知的， 可以調(diào)節(jié)這種抗體的用藥以使得可以最小化急性臨床癥狀（即以非常低的劑量或以寬范 圍的間隔用藥）。
[0018] 抗TfR/BACEl和抗TfR/A0都是用于治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease) 的有前途的和新型的候選治療劑。此外，基于受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運（RMT)的雙特異性靶向技術(shù) 為用于CNS疾病的大量潛在治療劑打開了大（。本發(fā)明提供改造BBB-滲透性治療的方法， 該方法極大提高治療劑的跨BBB的轉(zhuǎn)運和CNS分布而沒有網(wǎng)織紅細胞的消耗。
[0019] 因此，在第一實施方案中，本發(fā)明提供一種將化合物轉(zhuǎn)運穿過受試者中血腦屏障 的方法，所述方法包括：將以低親和力結(jié)合血腦屏障受體（BBB-R)的、與化合物偶聯(lián)的抗體 暴露于血腦屏障，以使所述抗體將與其偶聯(lián)的所述化合物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障，其中減少或 消除了在向所述受試者施用抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。在一個方面中，BBB-R 選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受 體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn) 運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面 中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R 是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制 TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0020] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0021] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0022] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0023] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0024] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0025] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0026] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，BBB是在哺乳動 物中。在另一個這樣的方面中，哺乳動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng) 疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默?。ˋD)，卒中， 癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼 綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。在另一個方面 中，BBB是在人中。
[0027] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfRA/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfRD/BACEl抗體和抗TfR E/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與化 合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和抗 TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析（scatchard analysis)，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用 BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使 用競爭ELISA，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0028] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶 聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽 和。在另一個這樣的方面中，以使紅細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然 促進化合物以治療水平穿過BBB遞送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗 體。
[0029] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0030] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0031] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種增加受試者的CNS對化合物的暴露的方 法，其中所述化合物與以低親和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，由此增加CNS對所述化合物的暴 露，并且其中減少或消除了在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細 胞水平的下降。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受 體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋 白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因 子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是 TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方 面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0032] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0033] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0034] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0035] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0036] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0037] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0038] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，將與抗體偶聯(lián)的 化合物施用于哺乳動物。在另一個這樣的方面中，哺乳動物是人。在另一個這樣的方面中， 哺乳動物患有神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海 默病（AD)，卒中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性 纖維化，安吉爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損 傷。
[0039] 在另一個方面中，相對于與不具有降低的對BBB-R的親和力的典型抗體偶聯(lián)的化 合物的CNS暴露，測量CNS對化合物的暴露的增加。在另一個方面中，CNS對化合物的暴露 的增加被計算為在施用后在CNS中發(fā)現(xiàn)的化合物的量相對于在血清中發(fā)現(xiàn)的量的比率。在 另一個這樣的方面中，CNS暴露的增加導(dǎo)致大于0.1%的比率。在另一個方面中，相對于在 不存在偶聯(lián)的抗體的情況下的化合物的CNS暴露，測量CNS對化合物的暴露的增加。在另 一個方面中，通過成像來測量CNS對化合物的暴露的增加。在另一個方面中，通過間接讀出 如一種或多種生理學(xué)癥狀的改變來測量CNS對化合物的暴露的增加。
[0040] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0041] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0042] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0043] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0044] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0045] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種降低被施用于受試者的化合物的清除率的 方法，其中所述化合物與以低親和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，以使所述化合物的清除率降 低，并且其中減少或消除了在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細 胞水平的下降。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受 體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋 白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因 子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是 TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方 面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0046] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0047] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0048] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0049]在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0050]在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0051] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0052] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，受試者是哺乳動 物。在另一個這樣的方面中，哺乳動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng)疾 病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默病（AD)，卒中，癡 呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼綜 合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。
[0053] 在另一個方面中，相對于與不具有降低的對BBB-R的親和力的典型抗體偶聯(lián)的化 合物的清除率，測量化合物的清除率的降低。在另一個方面中，相對于化合物在不存在偶聯(lián) 的抗體的情況下的清除率，測量化合物的清除率的降低。
[0054] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0055] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0056] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0057] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0058] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0059] -種增加被施用于受試者的化合物在CNS中滯留的方法，其中所述化合物與以低 親和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，以使所述化合物在CNS中的滯留增加，并且其中減少或消除 了在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。在一個方 面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受 體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (LRP1)、 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。在另一個這 樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。在另一個這樣的方面 中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗 體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0060] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0061] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0062] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0063] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0064] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0065] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0066] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，化合物被施用于 哺乳動物。在另一個這樣的方面中，哺乳動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有 神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默病（AD)，卒 中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉 爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。
[0067] 在另一個方面中，相對于與不具有降低的對BBB-R的親和力的典型抗體偶聯(lián)的化 合物的CNS滯留，測量化合物的CNS滯留的增加。在另一個方面中，化合物的CNS滯留的增 加被測量為在施用后在一個或多個時間點在CNS中發(fā)現(xiàn)的化合物的量相對于在血清中發(fā) 現(xiàn)的量的比率。在另一個這樣的方面中，在施用后在一個或多個時間點CNS滯留的增加導(dǎo) 致大于0. 1%的比率。在另一個方面中，相對于在不存在偶聯(lián)的抗體的情況下的化合物的 CNS滯留，測量化合物的CNS滯留的增加。在另一個方面中，通過成像，測量化合物的CNS滯 留的增加。在另一個方面中，通過間接讀出（readout)如一種或多種生理癥狀的改變來測 量化合物的CNS滯留的增加。
[0068] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0069] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0070] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0071] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 -分泌酶1 (BACE1)、A 、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0072] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0073] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種優(yōu)化在受試者中的CNS中有效的化合物的 藥物動力學(xué)和/或藥效學(xué)的方法，其中所述化合物與以低親和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，并 且這樣選擇所述抗體以致于在與所述化合物偶聯(lián)后所述抗體對所述BBB-R的親和力導(dǎo)致 與所述化合物綴合的所述抗體穿過BBB的一定量的轉(zhuǎn)運，其使所述化合物在CNS中的藥物 動力學(xué)和/或藥效學(xué)被優(yōu)化，其中減少或消除了在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體 時所述受試者中紅細胞水平的下降。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白 受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表 皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這 樣的方面中，BBB-R是TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活 性。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0074] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0075] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0076] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0077] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0078] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0079] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0080] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，BBB是在哺乳動 物中。在另一個這樣的方面中，哺乳動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng) 疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默?。ˋD)，卒中， 癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼 綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。在另一個方面 中，BBB是在人中。
[0081] 在一個方面中，優(yōu)化可以包括產(chǎn)生一系列抗體-化合物復(fù)合物，其中每個抗體具 有不同的對BBB-R的親和力，并且評估各自在CNS中的藥物動力學(xué)和/或藥效學(xué)。在另一 個方面中，優(yōu)化可以是相對于已知標(biāo)準(zhǔn)，如，但不限于，當(dāng)被直接引入到CNS中時或者當(dāng)在 不存在偶聯(lián)的抗BBB-R抗體的情況下被引入到受試者中時的化合物的藥物動力學(xué)和/或藥 效學(xué)。
[0082] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0083] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0084] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0085] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0086] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0087] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療哺乳動物的神經(jīng)疾病的方法，所述方 法包括：利用與BBB-R結(jié)合并與化合物偶聯(lián)的抗體治療所述哺乳動物，其中已經(jīng)選擇所述 抗體以對所述BBB-R具有低親和力，并由此提高所述抗體和偶聯(lián)的化合物的CNS攝取，并 且其中減少或消除了在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水 平的下降。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、 胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白 受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子 (HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。 在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方面中， BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0088] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。在另 一個方面中，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細胞消耗的步驟。
[0089] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體 的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基 化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖 基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制 備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣 的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另 一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以使得在所述位點處的野 生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通 過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除 效應(yīng)子功能。
[0090] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0091] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0092] 在另一個方面中，除了抗體和偶聯(lián)化合物之外施用另外的化合物。在一個這 樣的方面中，另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水平的降低的缺乏。在另一個這 樣的方面中，另外的化合物抑制或防止補體通路的活性的活化（參見，例如，Mollnes和 Kirschfink(2006)Molec. Immunol. 43 :107_121)。在另一個這樣的方面中，另外的化合物保 護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相關(guān)的消耗。在另一個這樣的方面中，另外的化合物支持網(wǎng)織紅細 胞的生長、發(fā)育、或重建。在另一個方面中，另外的化合物選自促紅細胞生成素（EP0)、鐵補 充物、維生素C、葉酸和維生素B12。在另一個方面中，另外的化合物是來自相同受試者的紅 細胞或網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，另外的化合物是來自其他受試者的紅細胞或網(wǎng)織紅 細胞。
[0093] 在另一個方面中，化合物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在 另一個方面中，化合物被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削 弱BBB-R與其一種或多種天然配體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特 異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR與運鐵蛋白的結(jié)合。在一個方面中，哺乳動物是人。在 另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng)疾病選自由 以下組成的組：阿爾茨海默?。ˋD)，卒中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化（MS)，肌萎縮 性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮克病，佩吉特 病，癌癥，和外傷性腦損傷。
[0094] 在一個方面中，治療導(dǎo)致疾病癥狀的減輕或者消除。在另一個方面中，治療導(dǎo)致神 經(jīng)疾病的改善。
[0095] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfRA/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0096] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0097] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0098] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0099] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0100] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種提高結(jié)合BBB-R的抗體在受試者中安全性 的方法，所述方法包括修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以使得所述抗體的施用減少或消 除在施用未修飾抗體時觀察到的所述受試者中紅細胞水平的下降。在一個方面中，BBB-R選 自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋 白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面中， BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R是 TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR 與運鐵蛋白結(jié)合。
[0101] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。
[0102] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，相對于對所述BBB-R不具有修飾的（即降低的）親和力的相同同種型的野生型抗體，測 量抗體的親和力的修飾。在另一個這樣的方面中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個 這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng) 子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。 在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基 化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的 方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳 水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不 發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在 位點297處的突變，以使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基 化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的 或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除效應(yīng)子功能。
[0103] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0104] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0105] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0106] 在另一個方面中，將所述抗體與治療性化合物偶聯(lián)。在另一個這樣的方面中，化合 物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在另一個方面中，化合物被標(biāo)記。 在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削弱BBB-R與其一種或多種天然配 體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR 與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，BBB是在哺乳動物中。在另一個這樣的方面中，哺乳 動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng) 疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默病（AD)，卒中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化 (MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮 克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。在另一個方面中，BBB是在人中。
[0107] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0108] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0109] 在另一個方面中，抗體選擇自一組抗體，所述選擇是基于所選擇的抗體的親和力。 在另一個方面中，抗體被改造以具有所需的親和力。在一個這樣的方面中，使用任何本領(lǐng)域 已知的蛋白質(zhì)改造方法來產(chǎn)生抗體，所述方法包括但不限于，噬菌體展示、酵母展示、隨機 誘變、和定點誘變。
[0110] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0111] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0112] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0113] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備用于以提高的安全性將化合物轉(zhuǎn)運穿 過BBB的抗體的方法，所述方法包括：選擇一種對血腦屏障受體（BBB-R)特異的抗體，所 述抗體具有所需的對所述BBB-R的低親和力，以及修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以使 得所述抗體的施用減少或消除在施用未修飾抗體時觀察到的所述受試者中紅細胞水平的 下降。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰 島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋白受 體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子 (HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。 在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR活性。在另一個這樣的方面中， BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0114] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。
[0115] 在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，相對于對所述BBB-R不具有修飾的（即降低的）親和力的相同同種型的野生型抗體，測 量抗體的親和力的修飾。在另一個這樣的方面中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個 這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng) 子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。 在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基 化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的 方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳 水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不 發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在 位點297處的突變，以使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基 化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的 或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除效應(yīng)子功能。
[0116] 在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0117] 在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0118] 在另一個方面中，調(diào)節(jié)抗體的施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞暴露的抗 體的濃度。在另一個方面中，修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感性結(jié)合。
[0119] 在另一個方面中，將所述抗體與治療性化合物偶聯(lián)。在另一個這樣的方面中，化合 物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在另一個方面中，化合物被標(biāo)記。 在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削弱BBB-R與其一種或多種天然配 體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR 與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，BBB是在哺乳動物中。在另一個這樣的方面中，哺乳 動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng) 疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默?。ˋD)，卒中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化 (MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮 克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。在另一個方面中，BBB是在人中。
[0120] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約InM至約lOOyM。在另一個 這樣的方面中，IC50為約5nM至約lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約50nM至約 lOOyM。在另一個這樣的方面中，IC50為約100nM至約lOOyM。在另一個方面中，抗體對 BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M。在另一個方面中，抗體對BBB-R的親和力為約30nM至 約30yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM 至約1 yM。在另一個這樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約50nM 至約lyM。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR 的親和力處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在 另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于 對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣 的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/ BACE1抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與 化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗 BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIAC0RE分析，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量 抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對BBB-R的親和力。
[0121] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfRD/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0122] 在另一個方面中，抗體選擇自一組抗體，所述選擇是基于所選擇的抗體的親和力。 在另一個方面中，抗體被改造以具有所需的親和力。在一個這樣的方面中，使用任何本領(lǐng)域 已知的蛋自質(zhì)改造方法來產(chǎn)生抗體，所述方法包括但不限于，噬菌體展示、酵母展示、隨機 誘變、和定點誘變。
[0123] 在另一個方面中，以治療劑量施用與化合物偶聯(lián)的抗體。在一個這樣的方面中，治 療劑量是這樣的劑量，其使抗體特異性結(jié)合的BBB-R飽和。在另一個這樣的方面中，以使紅 細胞與與化合物偶聯(lián)的抗體相互作用最小化同時仍然促進化合物以治療水平穿過BBB遞 送至CNS中的劑量和給藥頻率，施用與化合物偶聯(lián)的抗體。
[0124] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0125] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0126] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合血腦屏障受體（BBB-R)的抗體，其中 抗體對BBB-R的親和力為約5nM至約50 y M，并且其中已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性 質(zhì)，以降低對紅細胞的至少一種不希望的副作用。在一個方面中，BBB-R選自由以下組成的 組：運鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受 體相關(guān)蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(Glutl)和肝 素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。在另一個這樣的方面中，BBB-R是人BBB-R。 在一個這樣的方面中，BBB-R是TfR。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑 制TfR活性。在另一個這樣的方面中，BBB-R是TfR并且抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
[0127] 在另一個方面中，紅細胞是未成熟的紅細胞。在另一個這樣的方面中，未成熟的紅 細胞是網(wǎng)織紅細胞。在另一個方面中，網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。
[0128]在另一個方面中，已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所述受試者中減少 所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀的嚴重性或出現(xiàn)。在一個這樣 的方面中，進一步修飾，即降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。在另一個這樣的方面 中，相對于對所述BBB-R不具有修飾的（即降低的）親和力的相同同種型的野生型抗體，測 量抗體的親和力的修飾。在另一個這樣的方面中，修飾抗體Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。在一個 這樣的方面中，相對于相同同種型的野生型抗體的效應(yīng)子功能，已經(jīng)降低或消除所述效應(yīng) 子功能。在另一個這樣的方面中，通過抗體的糖基化的減少來降低或消除所述效應(yīng)子功能。 在另一個這樣的方面中，通過在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備抗體來減少抗體的糖基 化。在一個這樣的方面中，在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗體。在另一個這樣的 方面中，通過合成制備所述抗體。在另一個這樣的方面中，通過移除已經(jīng)在抗體上存在的碳 水化合物基團來減少所述抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，通過修飾抗體以使得不 發(fā)生野生型糖基化來減少抗體的糖基化。在另一個這樣的方面中，抗體的所述Fc區(qū)包含在 位點297處的突變，以使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基 化的另一個氨基酸替換。在另一個方面中，通過將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的 或消除的效應(yīng)子功能的同種型來降低或消除效應(yīng)子功能。
[0129]在另一個方面中，修飾Fc區(qū)以降低或消除效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，通 過所述Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，修飾是 削弱與一個或多個Fc受體的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、 249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、 322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、 438、和439。在另一個這樣的方面中，修飾是去除Fc區(qū)中的一些或全部。在另一個這樣的 方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所述抗體以使其不包含能夠 勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能。在一個這樣的方面中，抗體選自Fab 或單鏈抗體。
[0130]在另一個方面中，修飾抗體的Fc區(qū)和/或非Fc區(qū)以降低或消除借助抗體的補體 通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是削弱與Clq的結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變 選自下列位點：270、322、329、和321。在另一個這樣的方面中，修飾是去除？(：區(qū)中的一些 或全部。在另一個這樣的方面中，通過所述Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改造所 述抗體以使其不包含參與補體通路的Fc區(qū)，降低或消除補體誘發(fā)功能。在一個這樣的方面 中，抗體選自Fab或單鏈抗體。在另一個這樣的方面中，修飾抗體的非Fc區(qū)以降低或消除借 助抗體的補體通路的活化。在一個這樣的方面中，修飾是CH1區(qū)的削弱與C3的結(jié)合的點突 變。在一個這樣的方面中，點突變在位點132處（參見，例如，Vidarte等人，（2001) J. Biol. Chem. 276(41) ：38217-38223)〇
[0131]在另一個方面中，將所述抗體與治療性化合物偶聯(lián)。在另一個這樣的方面中，化合 物是神經(jīng)疾病藥物。在另一個方面中，化合物是顯影劑。在另一個方面中，化合物被標(biāo)記。 在另一個方面中，抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，抗體不削弱BBB-R與其一種或多種天然配 體的結(jié)合。在另一個這樣的方面中，抗體以這樣的方式特異性地結(jié)合TfR以致其不抑制TfR 與運鐵蛋白的結(jié)合。在另一個方面中，BBB是在哺乳動物中。在另一個這樣的方面中，哺乳 動物是人。在另一個這樣的方面中，哺乳動物患有神經(jīng)疾病。在另一個這樣的方面中，神經(jīng) 疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海默?。ˋD)，卒中，癡呆，肌營養(yǎng)不良（MD)，多發(fā)性硬化 (MS)，肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)，囊性纖維化，安吉爾曼綜合征，利德爾綜合征，帕金森病，皮 克病，佩吉特病，癌癥，和外傷性腦損傷。在另一個方面中，BBB是在人中。
[0132] 在另一個方面中，抗體具有的對BBB-R的IC50為約30nM至約30yM。在另一個這 樣的方面中，抗體，當(dāng)與化合物偶聯(lián)時，對BBB-R的親和力為約30nM至約lyM。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于對于抗 TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣的方面 中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的親和力處于對于抗TfR D/BACEl 抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀察到的那些親和力之間。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR A/BACEl抗體和抗TfRE/ BACE1抗體所觀察到的那些IC50之間。在另一個這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異 性地結(jié)合TfR并且其對TfR的IC50處于對于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體所觀 察到的那些IC50之間。在一個方面中，使用斯卡查德分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化 合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/ 化合物對BBB-R的親和力。在另一個方面中，使用競爭ELISA，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/ 化合物對BBB-R的親和力。
[0133] 在另一個方面中，抗體從與其特異性結(jié)合的BBB-R的解離半衰期為約30秒至約 30分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一個這樣的方 面中，解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒 至約5分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一個這樣的 方面中，解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為約兩分 鐘。在另一個這樣的方面中，解離半衰期為一分鐘以下。在另一個這樣的方面中，與化合物 偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對于抗TfR A/BACEl抗體和 抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離半衰期之間。在另一個 這樣的方面中，與化合物偶聯(lián)的抗體特異性地結(jié)合TfR并且其對TfR的解離半衰期處于對 于抗TfR D/BACEl抗體和抗TfRE/BACEl抗體從它們各自結(jié)合TfR開始所觀察到的那些解離 半衰期之間。在另一個方面中，使用BIACORE分析，測量抗BBB-R或者抗BBB-R/化合物對 BBB-R的解離半衰期。在另一個方面中，使用競爭結(jié)合測定，如競爭ELISA，測量抗BBB-R或 者抗BBB-R/化合物對BBB-R的解離半衰期。
[0134] 在另一個方面中，抗體選擇自一組抗體，所述選擇是基于所選擇的抗體的親和力。 在另一個方面中，抗體被改造以具有所需的親和力。在一個這樣的方面中，使用任何本領(lǐng)域 已知的蛋白質(zhì)改造方法來產(chǎn)生抗體，所述方法包括但不限于，噬菌體展示、酵母展示、隨機 誘變、和定點誘變。
[0135] 在另一個方面中，化合物與抗體共價偶聯(lián)。在一個這樣的方面中，化合物通過接頭 與抗體相連。在一個這樣的方面中，接頭是可裂解的。在另一個這樣的方面中，接頭是不可 裂解的。在另一個這樣的方面中，化合物直接偶聯(lián)至抗體。在一個這樣的方面中，抗體是 多特異性抗體并且所述化合物形成所述多特異性抗體的一部分。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位 點。在另一個這樣的方面中，腦抗原選自由以下組成的組：0 _分泌酶1 (BACE1)、A 0、表皮 生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脫脂載脂蛋白E4(Ap〇E4)、a -突 觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRRK2)、帕金 蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)、 P75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)、白介素6受體（IL6R)、TNF受體1 (TNFR1)、白介素 10 (IL10)、和胱天蛋白酶6。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和BACE1兩 者。在另一個這樣的方面中，多特異性抗體結(jié)合TfR和Af3兩者。在另一個這樣的方面中， 多特異性抗體被標(biāo)記。在另一個方面中，化合物可逆地偶聯(lián)到抗體以致化合物在BBB轉(zhuǎn)運 的同時或之后從抗體釋放。
[0136] 應(yīng)該理解的是，前述方面中的任何一個均可以單獨應(yīng)用，或者與前述實施方案組 合應(yīng)用。
[0137] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供以低親和力結(jié)合BBB-R并且不降低紅細胞水平 的抗體在制備用于治療神經(jīng)疾病的藥物中的用途。任何前述低親和力抗BBB-R抗體或本文 中其他地方所述的任何低親和力抗BBB-R抗體可以用于方法中。
[0138] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種以低親和力結(jié)合BBB-R并且不降低紅細胞 水平的抗體，所述抗體用于治療神經(jīng)疾病。任何前述低親和力抗BBB-R抗體或本文中其他 地方所述的任何低親和力抗BBB-R抗體可以用于方法中。
[0139] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供將治療性化合物、如神經(jīng)疾病藥物轉(zhuǎn)運穿過血 腦屏障的方法，所述方法包括：將與神經(jīng)疾病藥物偶聯(lián)的抗BBB-R抗體暴露于血腦屏障，以 致所述抗體將與其相連的神經(jīng)疾病藥物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障，其中所述抗體不降低紅細胞水 平。
[0140] 本發(fā)明另外提供治療哺乳動物的神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括利用結(jié)合血腦屏 障受體（BBB-R)和腦抗原兩者的多特異性抗體治療哺乳動物，其中選擇抗BBB-R抗體以使 其具有對BBB-R的低親和力并且因此提高抗腦抗原抗體的腦攝取，并且其中，所述抗體的 施用不降低紅細胞水平。
[0141] 本發(fā)明另外提供一種治療受試者中與升高的紅細胞水平相關(guān)的或由其導(dǎo)致的疾 病或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含至少部分效應(yīng)子功能的抗TfR抗 體。在一個方面中，施用步驟在經(jīng)校準(zhǔn)以使所述抗體施用的急性臨床癥狀最小化的劑量和 /或給藥頻率下進行。
[0142] 應(yīng)理解的是，本發(fā)明的任何前述方法和組合物可以彼此組合和/或與本說明書中 所述的本發(fā)明的其他方面組合。
[0143] 附圖簡述
[0144] 圖1A-1E顯示了評估抗運鐵蛋白受體（"TfR"）和抗TfR/ 0 -分泌酶（"BACE1"） 變體對TfR的親和力的實驗的結(jié)果，以及在小鼠中施用后的抗體和A 0 :_4(|的濃度，如在實施 例1中描述的。圖1A中的競爭性ELISA測定結(jié)果顯示，抗TfR/BACEl變體和抗TfR變體對 TfR具有不同的親和力。圖1B和1D分別顯示，在單次靜脈內(nèi)注射50mg/kg的對照IgG、抗 BACE1、或抗TfR/BACEl變體后野生型小鼠中的平均血清和腦抗體濃度（每組n = 6)。圖 1C和1E分別顯示，在這些相同處理的小鼠中的A 0 _的血漿和腦濃度，作為所注射的抗體 的活性的標(biāo)記。
[0145] 圖2A是骨髓中紅細胞（RBC)成熟的示意性描繪，顯示出從原成紅血細胞 (Pr〇-EB)、至嗜堿性成紅血細胞（Bas〇-EB)、至多色成紅血細胞（Poly-EB)、至正色成紅血 細胞（Ortho-EB)并且最終至網(wǎng)織紅細胞的進展過程。網(wǎng)織紅細胞從骨髓釋放至在其中 它們成熟為RBC的循環(huán)。在稍后的骨髓中成熟的階段期間，紅細胞前期細胞（erythroid precursor)合成含鐵蛋白質(zhì)血紅蛋白，這需要伴隨TfR表達的增加。在細胞成熟通過網(wǎng)織 紅細胞階段時，運鐵蛋白受體隨著血紅蛋白合成和細胞增殖的停止而流出，以使得成熟的 RBC 不表達 TfR?；?Iacpetta 等人，Biochim.Biophys. Acta 687:204-210(1982)的數(shù) 據(jù)，在圖表中，在圖的頂部表示在RBC成熟的各個細胞階段存在的TfR的相對數(shù)量。圖2B 和2C顯示了評估抗TfR和抗TfR/BACEl施用對小鼠中網(wǎng)織紅細胞的影響的實驗的結(jié)果，如 在實施例2A中描述的。圖2B顯示了測試靜脈內(nèi)施用的抗TfR D、抗TfRD/BACEl或?qū)φ誌gG 對在用藥后1小時的來自野生型小鼠全血的未成熟網(wǎng)織紅細胞部分的百分比的影響的實 驗的結(jié)果（每組n = 6)。圖2C顯示了測試靜脈內(nèi)施用的抗TfRA/BACEl、抗TfRD/BACEl或 對照IgG對在用藥后24小時或7天的在野生型小鼠全血中總網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的影響的實 驗的結(jié)果（每組n = 6)。所有數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM。圖2D和2E顯示了單次靜脈內(nèi)注 射 50mg/kg 的對照 IgG、或者注射 5mg/kg、25mg/kg 或 50mg/kg 的抗 TfRD/BACEl (圖 2D)或 者抗TfRA/BACEl (圖2E)后野生型小鼠中的平均腦Ah。濃度（每組n = 6)。圖2F-2H顯 示了評估與在5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg用藥水平的對照相比的抗TfRA/BACEl和抗TfR D/ BACE1的藥物動力學(xué)的實驗的結(jié)果。圖2F提供在指定時間點的腦抗體濃度的測量。圖2G 提供在指定時間點的血漿抗體濃度的測量。圖2H提供在指定時間點的血漿Af3水平的測 量。
[0146] 圖3A-3E顯示了評估消除效應(yīng)子功能（圖3A-3C)或消除補體功能（圖3D和3E) 對歸因于多種抗TfR抗體的網(wǎng)織紅細胞消耗的實驗的結(jié)果，如在實施例2B中描述的。與 對照IgG相比，在以指定劑量靜脈內(nèi)注射抗體24小時后，根據(jù)野生型小鼠（圖3A和3C)、 Fcy + (B 6. 129P2-FcerlgtmlRav N12)小鼠（圖 3B)、或 C3+小鼠（圖 3D)，示出全血中的 總網(wǎng)織紅細胞計數(shù)（每組n = 6)。圖3E顯示了評估補體系統(tǒng)的削弱對前面觀察到的歸因 于抗TfR的網(wǎng)織紅細胞消耗的影響的實驗的結(jié)果。對野生型或C3敲除的小鼠靜脈內(nèi)施用 50mg/kg的對照IgG或抗TfR D/對照IgG混合物（每組n = 6)。
[0147] 圖4A和4B顯示了評估在一系列抗體濃度下小鼠紅白血病母細胞中抗TfRA、抗 TfR A/BACEl、或?qū)φ誌gG對抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC)(圖4A)或補體依賴性 細胞毒性（CDC)(圖4B)的誘導(dǎo)的體外實驗的結(jié)果，如在實施例2B中描述的。
[0148] 圖5A-5C顯示了評估Fc結(jié)合或BACE1結(jié)合的消除是否影響歸因于單特異性或雙 特異性抗TfR抗體的網(wǎng)織紅細胞消耗的實驗的結(jié)果，如在實施例2C中描述的。對于靜脈內(nèi) 注射指定的指定F(ab'） 2或?qū)φ誌gG(圖5A和5B)或雙特異性抗體（圖5C)24小時后的野 生型小鼠（每組n = 6)，示出總網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。
[0149] 圖6A-6C顯示了評估降低與TfR的親和力對網(wǎng)織紅細胞消耗和腦TfR表達的影響 的實驗的結(jié)果，如在實施例3中描述的。圖6A和6B顯示了，與對照IgG相比，靜脈內(nèi)注射 指定的抗TfR/BACEl變體抗體24小時后野生型小鼠中的總網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。圖6C顯示， 根據(jù)以指定劑量靜脈內(nèi)注射對照IgG、抗TfR A/BACEl、或抗TfRD/BACE14天后的全部小鼠腦 裂解物，通過蛋白印跡（Western blot)量化腦TfR表達水平（每組n = 3)。將TfR表達的 量化標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白并且數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM。
[0150] 圖7A-7C顯示了評估TfR抗體治療是否影響血腦屏障透過性的實驗的結(jié)果，如在 實施例4中描述的。對野生型小鼠靜脈內(nèi)施用50mg/kg的對照IgG或25mg/kg的每種共同 注射的抗體組合。使用一般人類Fc ELISA(圖7A)或BACE1胞外結(jié)構(gòu)域ELISA(圖7B)測 量靜脈內(nèi)注射24小時后腦中的平均抗體吸收。圖7C顯示靜脈內(nèi)注射對照IgG或共同注射 抗體后小鼠腦中的A 0 濃度的量化（每組n = 6)。
[0151] 圖8A-8F顯示了評估多次劑量的抗TfRD/BACEl對經(jīng)治療的小鼠中的網(wǎng)織紅細胞 水平的影響的實驗的結(jié)果，如在實施例5中描述的。每周對野生型小鼠靜脈內(nèi)用藥一次 25mg/kg的對照IgG或抗TfR D/BACEl。圖8A和8B分別顯示了在兩次或四次劑量的抗體后 24小時、4天和7天時觀察到的血漿和腦抗體濃度。應(yīng)該指出的是，圖8A中的Y軸標(biāo)度是 以yM計，而圖8B中的Y軸標(biāo)度是以nM計。還測量了血漿（圖8C)和腦（圖8D)中相應(yīng)的 平均A 0 _濃度。圖8E顯示對照IgG或抗TfRD/BACE1的第二次和第四次劑量后24小時、 以及第四次劑量后7天的小鼠中的總網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。圖8F顯示一張圖表，其描繪根據(jù)4 周劑量的對照IgG或抗TfR D/BACEl后的全部小鼠腦裂解物、通過蛋白印跡（Western blot) 量化腦TfR表達水平的結(jié)果。將TfR表達的量化標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白并且數(shù)據(jù)顯示為平均值 土 SEM。
[0152] 圖9A-9B和10A-10D顯示了評估無效應(yīng)子抗TfR/BACEl抗體對小鼠中的血液和 骨髓中的紅細胞亞群的影響的實驗的結(jié)果。（圖9A)血液和（圖9B)骨髓兩者中的不同的 Terll9陽性紅細胞譜系群通過它們的TfR表達和細胞大?。ㄈ缤ㄟ^前向散射分布（forward scatter profile)確定的）使用流式細胞儀來區(qū)分（Paniga等人，PLoS One 6,9(2011))。 骨髓中的Terll9陽性細胞子集被定義為EryA =大的TfR陽性早期嗜堿性成紅血細胞， EryB =小的TfR陽性多色成紅血細胞，并且EryC = TfR陰性成熟紅細胞。圖9C和9D顯示 與對照IgG相比的用抗TfRD/BACEl用藥后血液中總Terll9陽性紅細胞群（網(wǎng)織紅細胞和 紅細胞；9C)和TfR陽性網(wǎng)織紅細胞（9D)的時間過程（n = 6/組）。圖10A至10D提供在 抗TfRD/BACEl或?qū)φ誌gG用藥之后骨髓中不同紅細胞亞群（EryA、EryB、EryC)的量化的圖 表（n = 6/ 組）。
[0153] 圖11A-11B和12A-12D顯示了分析抗TfR/BACEl抗體的親和力和效應(yīng)子功能對小 鼠中的血液和骨髓中的紅細胞群的影響的實驗的結(jié)果。圖11A-11B顯示在無效應(yīng)子抗TfR A/ BACE1 (Fc_)和抗TfRD/BACEl (Fc_)、完全效應(yīng)子功能抗TfRD/BACEl (Fc+)、或?qū)φ誌gG用藥之 后血液中的總Terll9陽性紅細胞群（圖11A)和TfR陽性網(wǎng)織紅細胞群（圖11B)的量化 (n = 6/ 組）。圖 12A-12D 提供在無效應(yīng)子抗 TfRA/BACEl (Fc_)和抗 TfRD/BACEl (Fc_)、完 全效應(yīng)子功能抗TfRD/BACEl (Fc+)、或?qū)φ誌gG用藥之后骨髓中的不同紅細胞亞群（圖12A 中的總Terll9陽性紅細胞譜系；圖12B中的EryA ;圖12C中的EryB ;和圖12D中的EryC) 的量化（n = 6/組）。
[0154] 圖13A-B和圖14A-B顯示了評估效應(yīng)子功能狀態(tài)對人成紅血細胞細胞系或原始人 骨髓單核細胞中的抗人TfR( "抗hTFR"）抗體的ADCC活性的影響的實驗的結(jié)果，如在實施 例7中描述的。
[0155] 圖15A-B顯示了獲得自首次用于實驗(nai_vc)類型的天然多樣性噬菌體展示文庫 的抗BACE1克隆YW412. 8和YW412. 8的親和力成熟形式的輕鏈和重鏈氨基酸序列。圖15A 顯示了可變輕鏈（VL)序列比對（SEQ ID NO. 1-6)。圖13B顯示了可變重鏈（VH)序列比對 (SEQ ID NO. 7-8)。在兩幅圖中，每個克隆的HVR序列由加框的區(qū)域指示，其中第一框指示 HVR-L1 (圖 15A)或 HVR-H1 (圖 15B)，第二框指示 HVR-L2 (圖 15A)或 HVR-H2 (圖 15B)，而第 三框指示 HVR-L3 (圖 15A)或 HVR-H3 (圖 15B)。
[0156] 圖16A-B顯示獲得自首次用于實驗類型的合成多樣性噬菌體展示文庫的抗BACE1 抗體克隆Fab 12和Fab 12的親和力成熟形式的輕鏈和重鏈氨基酸序列。圖16A顯示輕鏈 序列比對（SEQ ID NO. 9-12)。圖16B顯示重鏈序列比對（SEQ ID NO. 13)。在兩幅圖中， 每個克隆的HVR序列由加框的區(qū)域指示，其中第一框指示HVR-L1 (圖16A)或HVR-H1 (圖 16B)，第二框指示HVR-L2 (圖16A)或HVR-H2 (圖16B)，而第三框指示HVR-L3 (圖16A)或 HVR-H3(圖 16B)。
[0157] 圖17A-B顯示示例性抗A0抗體的重鏈（圖17A ;SEQ ID NO. 14)和輕鏈（圖17B; SEQ ID NO. 15)。
[0158] 發(fā)明實施方案詳述
[0159] I?定義
[0160] "血腦屏障"或者"BBB"是指外周循環(huán)和腦和脊髓（即CNS)之間的生理屏障，其由 腦微血管內(nèi)皮質(zhì)膜內(nèi)的緊密連接形成，產(chǎn)生限制分子（甚至非常小的分子如尿素（60道爾 頓））轉(zhuǎn)運到腦中的緊密屏障。腦內(nèi)的血腦屏障，脊髓內(nèi)的血脊髓屏障，和視網(wǎng)膜內(nèi)的血視 網(wǎng)膜屏障是CNS內(nèi)的相連的微血管屏障，并且在本文中被統(tǒng)稱為血腦屏障或者BBB。BBB還 包括血-CSF屏障（脈絡(luò)叢），其中屏障由室管膜細胞而不是微血管內(nèi)皮細胞組成。
[0161] "中樞神經(jīng)系統(tǒng)"或者"CNS"是指神經(jīng)組織的復(fù)合體，其控制身體功能，并且包括腦 和脊髓。
[0162] "血腦屏障受體"（本文中簡寫為"BBB-R"）是表達在腦內(nèi)皮細胞上的跨膜受體蛋 白，其能夠?qū)⒎肿愚D(zhuǎn)運穿過血腦屏障。BBB-R的實例包括但不限于：運鐵蛋白受體（TfR)， 胰島素受體，胰島素樣生長因子受體（IGF-R)，低密度脂蛋白受體，其包括但不限于低密度 脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8 (LRP8)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 l(Glutl)和肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。本文中的示例性BBB-R是運 鐵蛋白受體（TfR)。
[0163]"運鐵蛋白受體"（"TfR"）是跨膜糖蛋白（分子量約為180, 000)，其由參與脊椎動 物中的鐵攝取的兩個二硫鍵鍵合的亞基（各自的表觀分子量為約90, 000)組成。在一個實 施方案中，本文中的TfR是人TfR，其包含例如在Schneider等Nature 311 :675-678(1984) 中給出的氨基酸序列。
[0164] "神經(jīng)疾病"當(dāng)在本文中使用時是指影響CNS和/或具有在CNS中的病因 的疾病或病癥。示例性CNS疾病或病癥包括但不限于，神經(jīng)病，淀粉樣變性，癌癥，眼 病或病癥，病毒或微生物感染，發(fā)炎，缺血，神經(jīng)變性疾病，發(fā)作，行為障礙和溶酶體貯 積癥（lysosomal storage disease)。對于本申請來說，將理解CNS包括眼，其通常 通過血視網(wǎng)膜屏障與身體的其他部分隔離。神經(jīng)疾病的具體實例包括但不限于，神 經(jīng)變性疾病（包括但不限于，雷維小體病（Lewy body disease)，脊髓灰質(zhì)炎后綜合 征（postpoliomyelitis syndrome)，夏伊-德雷格綜合征（Shy-Draeger syndrome)， 撤欖體腦橋小腦萎縮（olivopontocerebellar atrophy)，帕金森?。≒arkinson' s disease)，多系統(tǒng)萎縮（multiple system atrophy)，紋狀體黑質(zhì)變性（striatonigral degeneration)，Tau病變（tauopathy)(包括但不限于，阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease)和核上性麻痹（supranuclearpalsy))，朊病毒病（priondisease)(包括 但不限于，牛海綿狀腦病（bovinespongiformencephalopathy)，癢病（scrapie)， 克-雅綜合征（Creutzfeldt-Jakobsyndrome)，庫魯?。╧uru)，格-施-沙病 (Gerstmann-Straussler-Scheinkerdisease)，慢性消耗性疾病(chronicwasting disease)，和致命性家族性失眠癥（fatalfamilialinsomnia))，延髓性麻痹（bulbar palsy)，運動神經(jīng)元病(motorneurondisease)，和heterodegenerative疾?。ò?但不限于卡納范病（Canavandisease)，亨廷頓?。℉untingto"sdisease)，神經(jīng)元 錯樣脂褐素沉積癥（neuronalceroid-lipofuscinosis)，亞歷山大?。ˋlexander's disease)，圖雷特綜合征（Tourette'ssyndrome)，門克斯扭結(jié)發(fā)綜合征（Menkes kinkyhairsyndrome)，科凱恩綜合征（Cockaynesyndrome)，哈勒沃登-施帕茨綜合 征（Halervorden-Spatzsyndrome)，拉福拉?。╨aforadisease)，雷特綜合征（Rett syndrome)，肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticulardegeneration)，萊施-奈恩綜合征 (Lesch-Nyhansyndrome)，和翁-隆綜合征（Unverricht-Lundborgsyndrome))，癡呆 (包括但不限于，皮克病（Pick'sdisease)，和脊髓小腦性共濟失調(diào)（spinocerebellar ataxia))，癌癥（例如CNS的癌癥，包括源自身體其他位置的癌癥的腦轉(zhuǎn)移癌）。
[0165] "神經(jīng)疾病藥物"是治療一種或多種神經(jīng)疾病的藥物或治療劑。本發(fā)明的神經(jīng) 疾病藥物包括，但不限于，抗體，肽，蛋白質(zhì)，一種或多種CNS靶標(biāo)的天然配體，一種或多種 CNS靶標(biāo)的天然配體的修飾形式，適體，抑制性核酸（S卩，小的抑制性RNA(siRNA)和短發(fā)夾 RNA(shRNA))，核酶，和小分子，或上述中任何一種的活性片段。本發(fā)明的示例性神經(jīng)疾病藥 物描述于此并且包括但不限于：抗體，適體，蛋白質(zhì)，肽，抑制性核酸和小分子和上述中任何 一種的活性片段，它們是它們本身或者特異性識別和/或作用于（即，抑制，活化，或檢測） CNS抗原或者靶標(biāo)分子如，但不限于，淀粉狀蛋白前體蛋白或其部分，淀粉狀蛋白0分 泌酶，y-分泌酶，tau，a-突觸核蛋白，帕金蛋白，亨廷頓蛋白，DR6,早老蛋白，ApoE，神經(jīng) 膠質(zhì)瘤或其他CNS癌癥標(biāo)記物，和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。神經(jīng)疾病藥物以及可以使用它們治療的 疾病的非限制性實例被提供在以下表1中：
[0166] 表1 :神經(jīng)疾病藥物以及可以使用它們治療的相應(yīng)疾病的非限制性實例
[0167]
【權(quán)利要求】
1. 一種將化合物轉(zhuǎn)運穿過受試者中血腦屏障的方法，所述方法包括：將以低親和力結(jié) 合血腦屏障受體（BBB-R)的、與化合物偶聯(lián)的抗體暴露于血腦屏障，以使所述抗體將與其 偶聯(lián)的所述化合物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障，其中減少或消除了在向所述受試者施用抗體時所述 受試者中紅細胞水平的下降。
2. -種增加受試者的CNS對化合物的暴露的方法，其中所述化合物與以低親和力結(jié)合 BBB-R的抗體偶聯(lián)，由此增加 CNS對所述化合物的暴露，并且其中減少或消除了在向所述受 試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。
3. -種降低被施用于受試者的化合物的清除率的方法，其中所述化合物與以低親和力 結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，以使所述化合物的清除率降低，并且其中減少或消除了在向所述 受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。
4. 一種增加被施用于受試者的化合物在CNS中滯留的方法，其中所述化合物與以低親 和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，以使所述化合物在CNS中的滯留增加，并且其中減少或消除了 在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。
5. -種優(yōu)化在受試者中的CNS中有效的化合物的藥物動力學(xué)和/或藥效學(xué)的方法，其 中所述化合物與以低親和力結(jié)合BBB-R的抗體偶聯(lián)，并且選擇所述抗體以致于在與所述化 合物偶聯(lián)后所述抗體對所述BBB-R的親和力導(dǎo)致與所述化合物綴合的所述抗體以使所述 化合物在CNS中的藥物動力學(xué)和/或藥效學(xué)被優(yōu)化的量穿過BBB轉(zhuǎn)運，其中減少或消除了 在向所述受試者施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。
6. -種治療哺乳動物的神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括：利用與BBB-R結(jié)合并與化合 物偶聯(lián)的抗體治療所述哺乳動物，其中已經(jīng)選擇所述抗體以對所述BBB-R具有低親和力， 并由此提高所述抗體和偶聯(lián)的化合物的CNS攝取，并且其中減少或消除了在向所述受試者 施用與化合物偶聯(lián)的抗體時所述受試者中紅細胞水平的下降。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述BBB-R選自由以下組成的組：運 鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相 關(guān)蛋白8 (LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I(LRPl)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白I(Glutl)和肝素結(jié) 合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述BBB-R是TfR。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述紅細胞是未成熟的紅細胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述未成熟的紅細胞是網(wǎng)織紅細胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中已經(jīng)修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以在所 述受試者或哺乳動物中減少所述抗體對網(wǎng)織紅細胞水平的影響和/或減少急性臨床癥狀 的嚴重性或出現(xiàn)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能、所述抗體的補體活化功能以及所述抗體對所述BBB-R的親和力。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能和所述抗體的補體活化功能，并且其中相對于相同同種型的野生型抗體，已經(jīng)降低 或消除所述效應(yīng)子功能或補體活化功能。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過選自以下的方法降低或消除所述效應(yīng)子功 能：減少所述抗體的糖基化，將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功 能的同種型，以及Fc區(qū)的修飾。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中通過選自以下的方法減少所述抗體的糖基化： 在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備所述抗體；移除已經(jīng)在所述抗體上存在的碳水化合物 基團；以及修飾所述抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗體， 或者其中通過合成制備所述抗體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗體的Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以 使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替 換。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中通過Fc區(qū)的至少一種修飾來降低或消除所述效 應(yīng)子功能。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中通過Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改 造所述抗體以使其不包含能夠勝任效應(yīng)子功能或補體活化功能的Fc區(qū)或非Fc區(qū)，降低或 消除所述效應(yīng)子功能或補體活化功能。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述修飾選自：削弱與一個或多個Fc受體的 結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、249、252、254、265、268、269、 270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、 338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438、和 439;削弱與（：19的結(jié) 合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：270、322、329、和321;去除？〇區(qū)中的一些或 全部，以及在CHl結(jié)構(gòu)域的位點132處的點突變。
22. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中調(diào)節(jié)施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞 暴露的抗體的濃度。
23. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感 性結(jié)合。
24. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中除了所述抗體之外施用另外的化合物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述另外的化合物導(dǎo)致或有助于網(wǎng)織紅細胞水 平的降低的缺乏。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述另外的化合物保護網(wǎng)織紅細胞免于抗體相 關(guān)的消耗或者支持網(wǎng)織紅細胞的生長、發(fā)育、或重建。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述另外的化合物選自促紅細胞生成素（EPO)、 鐵補充物、維生素 C、葉酸、和維生素 B12。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述另外的化合物是來自相同或其他受試者的 紅細胞或網(wǎng)織紅細胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中進一步降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項所述的方法，所述方法還包括監(jiān)測所述受試者的紅細 胞消耗的步驟。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述化合物是神經(jīng)疾病藥物或者顯 影劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求2-30中任一項所述的方法，其中相對于對所述BBB-R不具有降低的 親和力的相同同種型的野生型抗體，測量所述增加或降低。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述抗體不削弱所述BBB-R與其一 種或多種天然配體的結(jié)合。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述血腦屏障是在哺乳動物中的。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述哺乳動物患有神經(jīng)疾病。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述神經(jīng)疾病選自由以下組成的組：阿爾茨海 默病（AD)、卒中、癡呆、肌營養(yǎng)不良（MD)、多發(fā)性硬化（MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)、囊性 纖維化、安吉爾曼綜合征、利德爾綜合征、帕金森病、皮克病、佩吉特病、癌癥和外傷性腦損 傷。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述抗體對所述BBB-R的IC50為約 InM 至約 100 μ M。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述IC50為約5ηΜ至約100 μ Μ。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述IC50為約50η至約100 μ Μ。
41. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述IC50為約IOOn至約100 μ Μ。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述抗體對所述BBB-R的親和力為 約5η至約50 μ Μ。
43. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中與所述化合物偶聯(lián)的所述抗體對所 述BBB-R的親和力為約30ηΜ至約30 μ Μ。
44. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中與所述化合物偶聯(lián)的所述抗體對所 述BBB-R的親和力為約30ηΜ至約1 μ Μ。
45. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中與所述化合物偶聯(lián)的所述抗體對所 述BBB-R的解離半衰期為約30秒至約5分鐘，或約30秒至約2分鐘。
46. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
47. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中以治療劑量施用與所述化合物偶聯(lián) 的所述抗體。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述治療劑量是使BBB-R飽和的。
49. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述抗體是多特異性抗體并且所述 化合物任選地形成所述多特異性抗體的一部分。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述多特異性抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一 抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位點。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述腦抗原選自由以下組成的組：β -分泌酶 I (BACEl)、Αβ、表皮生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2 (HER2)、tau、脫脂載脂蛋 白Ε4(ΑροΕ4)、α -突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列 激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋 白前體蛋白（APP)、p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)和胱天蛋白酶6。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和BACEl兩者。
53. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和A β兩者。
54. -種提高結(jié)合BBB-R的抗體在受試者中安全性的方法，所述方法包括修飾所述抗 體的一種或多種性質(zhì)，以使得所述抗體的施用減少或消除在施用未修飾抗體時觀察到的所 述受試者中紅細胞水平的下降。
55. -種制備用于以提高的安全性將化合物轉(zhuǎn)運穿過BBB的抗體的方法，所述方法包 括：選擇一種對血腦屏障受體（BBB-R)特異的抗體，所述抗體具有所需的對所述BBB-R的低 親和力，修飾所述抗體的一種或多種性質(zhì)，以使得所述抗體的施用減少或消除在施用未修 飾抗體時觀察到的所述受試者中紅細胞水平的下降。
56. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，其中所述BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋 白受體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋 白8 (LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I(LRPl)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白I(Glutl)和肝素結(jié)合性 表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述BBB-R是運鐵蛋白受體（TfR)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述紅細胞是網(wǎng)織紅細胞。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中網(wǎng)織紅細胞水平的降低伴隨著急性臨床癥狀。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能、所述抗體的補體活化功能以及所述抗體對所述BBB-R的親和力。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能和所述抗體的補體活化功能，并且其中相對于相同同種型的野生型抗體，已經(jīng)降低 或消除所述效應(yīng)子功能或所述補體活化功能。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中通過選自以下的方法降低或消除所述效應(yīng)子功 能：減少所述抗體的糖基化，將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功 能的同種型，以及Fc區(qū)的修飾。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中通過選自以下的方法減少所述抗體的糖基化： 在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備所述抗體；移除已經(jīng)在所述抗體上存在的碳水化合物 基團；以及修飾所述抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗體， 或者其中通過合成制備所述抗體。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述抗體的Fc區(qū)包含在位點297處的突變，以 使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸替 換。
66. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中通過所述抗體的Fc區(qū)或非Fc區(qū)的至少一種修 飾來降低或消除所述效應(yīng)子功能或所述補體活化功能。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中通過Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過改 造所述抗體以使其不包含能夠勝任效應(yīng)子功能或補體活化功能的Fc區(qū)，降低或消除所述 效應(yīng)子功能或補體活化功能。
68. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述修飾選自：削弱與一個或多個Fc受體的 結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、249、252、254、265、268、269、 270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、338、 340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438、和 439;削弱與(：19的結(jié)合的 Fe區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：270、322、329、和321，去除？〇區(qū)中的一些或全部， 以及在CHl結(jié)構(gòu)域的位點132處的點突變。
69. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中調(diào)節(jié)施用的劑量和/或頻率以降低所述紅細胞 暴露的抗體的濃度。
70. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感 性結(jié)合。
71. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中進一步降低了所述抗體對所述BBB-R的親和力。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中相對于對所述BBB-R不具有降低的親和力的相 同同種型的野生型抗體，測量所述降低。
73. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，其中對所述BBB-R的所述親和力為約InM至約 100 μ Mo
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述抗體具有約InM至約100 μ M的IC50。
75. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述IC50為約5ηΜ至約100 μ Μ。
76. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述IC50為約50ηΜ至約100 μ Μ。
77. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述IC50為約IOOn至約100 μ Μ。
78. 根據(jù)權(quán)利要求54-71中任一項所述的方法，其中所述抗體對所述BBB-R的親和力為 約5η至約50 μ Μ。
79. 根據(jù)權(quán)利要求54-71中任一項所述的方法，其中所述抗體對所述BBB-R的解離半衰 期為約30秒至約5分鐘，或約30秒至約2分鐘。
80. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，其中基于選定抗體的親和力，從一組抗體中選 擇所述抗體。
81. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，其中所述抗體被改造以具有所述親和力。
82. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，所述方法包括將所述抗體與治療性化合物偶 聯(lián)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述治療性化合物是神經(jīng)疾病藥物。
84. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中與所述化合物偶聯(lián)的所述抗體對所述BBB-R的 親和力為約30η至約30 μ Μ。
85. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述抗體是多特異性抗體并且所述化合物任選 地形成所述多特異性抗體的一部分。
86. 根據(jù)權(quán)利要求54或55所述的方法，其中所述抗體是多特異性抗體，所述多特異性 抗體包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位點。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述腦抗原選自由以下組成的組：β -分泌酶 I (BACEl)、Αβ、表皮生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2 (HER2)、tau、脫脂載脂蛋 白Ε4(ΑροΕ4)、α -突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列 激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋 白前體蛋白（APP)、p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)和胱天蛋白酶6。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和BACEl兩者。
89. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和A β兩者。
90. 根據(jù)權(quán)利要求54-88中任一項所述的方法，其中所述抗體不削弱所述BBB-R與其一 種或多種天然配體的結(jié)合。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
92. -種結(jié)合BBB-R的抗體，其中所述抗體對所述BBB-R的親和力為約5nM至約50 μ M， 或者所述抗體對所述BBB-R的解離半衰期為約30秒至約2分鐘，并且其中已經(jīng)修飾所述抗 體的一種或多種性質(zhì)，以降低對紅細胞的至少一種不希望的副作用。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，其中所述BBB-R選自由以下組成的組：運鐵蛋白受 體（TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體（IGF受體）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 8 (LRP8)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I(LRPl)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白I(Glutl)和肝素結(jié)合性表 皮生長因子樣生長因子（HB-EGF)。
94. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的抗體，其中所述BBB-R是運鐵蛋白受體（TfR)。
95. 根據(jù)權(quán)利要求94所述的抗體，其中所述紅細胞是網(wǎng)織紅細胞。
96. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的抗體，其中所述對紅細胞的至少一種不希望的副作用選自 網(wǎng)織紅細胞水平的降低和急性臨床癥狀。
97. 根據(jù)權(quán)利要求96所述的抗體，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能、所述抗體的補體活化功能以及所述抗體對所述BBB-R的親和力。
98. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的抗體，其中所述一種或多種性質(zhì)選自所述抗體Fc區(qū)的效應(yīng) 子功能和所述抗體的補體活化功能，并且其中相對于相同同種型的野生型抗體，已經(jīng)降低 或消除所述效應(yīng)子功能或補體活化功能。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的抗體，其中通過選自以下的方法降低或消除所述效應(yīng)子功 能：減少所述抗體的糖基化，將所述抗體同種型修飾為天然具有降低的或消除的效應(yīng)子功 能的同種型，以及Fc區(qū)的修飾。
100. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的抗體，其中通過選自以下的方法減少所述抗體的糖基化： 在不允許野生型糖基化的環(huán)境中制備所述抗體；移除已經(jīng)在所述抗體上存在的碳水化合物 基團；以及修飾所述抗體以使得不發(fā)生野生型糖基化。
101. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的抗體，其中在非哺乳動物細胞制備系統(tǒng)中制備所述抗 體，或者其中通過合成制備所述抗體。
102. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的抗體，其中所述抗體的Fc區(qū)包含在位點297處的突變， 以使得在所述位點處的野生型天冬酰胺殘基被在所述位點處干擾糖基化的另一個氨基酸 替換。
103. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的抗體，其中通過Fc區(qū)或非Fc區(qū)的至少一利修飾來降低或 消除所述效應(yīng)子功能或補體活化功能。
104. 根據(jù)權(quán)利要求103所述的抗體，其中通過Fc區(qū)的全部或一部分的缺失，或者通過 改造所述抗體以使其不包含能夠勝任效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，降低或消除所述效應(yīng)子功能或 補體活化功能。
105. 根據(jù)權(quán)利要求103所述的抗體，其中所述修飾選自：削弱與一個或多個Fc受體的 結(jié)合的Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：238、239、248、249、252、254、265、268、269、 270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、338、 340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438、和 439;削弱與(：19的結(jié)合的 Fc區(qū)點突變，所述點突變選自下列位點：270、322、329、和321;去除？〇區(qū)中的一些或全部， 以及在CHl結(jié)構(gòu)域的位點132處的點突變。
106. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的抗體，其中修飾所述抗體以包含與所述BBB-R的pH-敏感 性結(jié)合。
107. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的抗體，其中進一步降低了所述抗體對所述BBB-R的親和 力。
108. 根據(jù)權(quán)利要求107所述的抗體，其中相對于對所述BBB-R不具有降低的親和力的 相同同種型的野生型抗體，測量所述降低。
109. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，其中所述親和力被測量為IC50。
110. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，其中基于選定抗體的親和力，從一組抗體中選擇所 述抗體。
111. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，其中所述抗體被改造以具有所述親和力。
112. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，所述抗體進一步與治療性化合物偶聯(lián)。
113. 根據(jù)權(quán)利要求112所述的抗體，其中所述治療性化合物是神經(jīng)疾病藥物。
114. 根據(jù)權(quán)利要求112所述的抗體，其中與所述化合物偶聯(lián)的所述抗體對所述BBB-R 的親和力為約30nM至約30 μ M。
115. 根據(jù)權(quán)利要求112所述的抗體，其中所述抗體是多特異性抗體并且所述化合物任 選地形成所述多特異性抗體的一部分。
116. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的抗體，其中所述抗體是多特異性抗體，所述多特異性抗體 包含結(jié)合所述BBB-R的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合腦抗原的第二抗原結(jié)合位點。
117. 根據(jù)權(quán)利要求116所述的抗體，其中所述腦抗原選自由以下組成的組：β -分泌酶 I (BACEl)、Αβ、表皮生長因子受體（EGFR)、人表皮生長因子受體2 (HER2)、tau、脫脂載脂蛋 白Ε4(ΑροΕ4)、α -突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白（PrP)、富含亮氨酸重復(fù)序列 激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉狀蛋 白前體蛋白（APP)、p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75NTR)和胱天蛋白酶6。
118. 根據(jù)權(quán)利要求117所述的抗體，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和BACEl兩者。
119. 根據(jù)權(quán)利要求117所述的抗體，其中所述多特異性抗體結(jié)合TfR和Αβ兩者。
120. 根據(jù)權(quán)利要求92-119中任一項所述的抗體，其中所述抗體不削弱所述BBB-R與其 一種或多種天然配體的結(jié)合。
121. 根據(jù)權(quán)利要求120所述的抗體，其中所述抗體不抑制TfR與運鐵蛋白結(jié)合。
122. 以低親和力結(jié)合BBB-R并且不影響紅細胞水平的抗體在制備用于治療神經(jīng)疾病 的藥物中的用途。
123. 根據(jù)權(quán)利要求92-121中任一項所述的抗體在制備用于治療神經(jīng)疾病的藥物中的 用途。
124. -種以低親和力結(jié)合BBB-R并且不影響紅細胞水平的抗體，所述抗體用于治療神 經(jīng)疾病。
125. 根據(jù)權(quán)利要求92-121中任一項所述的抗體，所述抗體用于治療神經(jīng)疾病。
126. -種治療受試者中與升高的紅細胞水平相關(guān)或由升高的紅細胞水平導(dǎo)致的疾病 或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含至少部分效應(yīng)子功能的抗TfR抗體。
127. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中所述施用步驟在經(jīng)校準(zhǔn)以使所述抗體施用的 急性臨床癥狀最小化的劑量和/或給藥頻率下進行。
【文檔編號】C07K16/28GK104520325SQ201380026745
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月21日
【發(fā)明者】瑞安·杰斐遜·沃茨, 喬伊·俞祖切羅, 杰西卡·庫奇, 馬克·丹尼斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司