能用于過繼性細(xì)胞療法的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供具有下式的多肽：St-R1-S1-Q-S2-R2，其中St是柄序列，當(dāng)所述多肽在靶細(xì)胞表面表達(dá)時，其導(dǎo)致R和Q表位從細(xì)胞表面伸出；R1和R2是利妥昔單抗結(jié)合表位，其各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No.1，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15和16或其保留利妥昔單抗結(jié)合活性的變體；S1和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；且Q是具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的QBEnd10結(jié)合表位或保留QBEnd10結(jié)合活性的其變體。本發(fā)明還提供編碼這類多肽的核酸序列及其在過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的用途。
【專利說明】能用于過繼性細(xì)胞療法的多肽 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能用于過繼性細(xì)胞療法（ACT)的多肽。所述多肽包含能實(shí)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn) 導(dǎo)細(xì)胞的選擇的表位，和使表達(dá)所述多肽的細(xì)胞被消除的表位。本發(fā)明還提供編碼這類多 肽的核酸，包含這類核酸的細(xì)胞及其治療用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 過繼性細(xì)胞療法（ACT)已顯示在臨床應(yīng)用中針對惡性和感染性疾病的希望。例 如，已開發(fā)出埃巴病毒（Epstein-Barr virus)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（EBV-CTL)來治療 干細(xì)胞或器官移植后的移植后淋巴增殖性疾?。≒TLD) (Brewin等（2009) 114:4792-4803)。 已使用經(jīng)遺傳工程化以識別⑶19的T細(xì)胞來治療濾泡性淋巴瘤（Kochenderfer等（2010) Blood 116:4099-4102)。已利用使用遺傳修飾為表達(dá)抗腫瘤T細(xì)胞受體的自體淋巴細(xì)胞的 ACT 來治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤（Rosenberg 和 Dudley (2009) Curr. Opin. Immunol. 21:233-240)。
[0004] 根據(jù)報(bào)道，腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞成功用于治療黑素瘤和EBV相關(guān)惡性，這導(dǎo) 致為T效應(yīng)細(xì)胞重新定目標(biāo)，并由此擴(kuò)大其能治療的腫瘤范圍的努力。
[0005] 已經(jīng)工程化改造 T細(xì)胞，其包含具有新特異性的T細(xì)胞受體（TCR)。還開發(fā)了嵌合 抗原受體（CAR)，其包含通常源自抗體的抗原結(jié)合域，該抗原結(jié)合域與源自T細(xì)胞受體的信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)域（endodomain)偶聯(lián)。如此，CAR具有與T細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)器機(jī)制聯(lián)系的抗 體特異性。
[0006] 許多臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，其使用CAR修飾的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行B譜系惡性的 免疫治療（Kohn等（2011)Mol. Ther. 19:432-438)。經(jīng)抗⑶2 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞目前 正處在用于治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤（neuroblastoma)的臨床開發(fā)中（Pule等（2008)Nat. Med. 14:1264-1270)。在成人淋巴瘤的CAR臨床研究中也報(bào)道了顯示功效的數(shù)據(jù)。再 舉一個例子，用識別黑素瘤抗原的天然T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞已導(dǎo)致散布性黑素瘤 (disseminated melanoma)的明顯消退。
[0007] 自殺基因
[0008] 提高過繼性免疫治療的功效已經(jīng)與嚴(yán)重不良事件（adverse event)的報(bào)告聯(lián) 系起來。在輸注工程化的T細(xì)胞后，已報(bào)道有急性不良事件，如細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm)。另外，發(fā)生了慢性不良事件，并且其他通過動物模型預(yù)測。例如，由于在膽上皮上 預(yù)料不到的CAIX表達(dá)，再靶向碳酸酐酶IX(CAIX)(-種由腎癌表達(dá)的抗原）的T細(xì)胞在數(shù) 名患者中產(chǎn)生肝中毒。針對黑素瘤的天然T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)移研究由于皮膚和虹膜上的靶抗原 表達(dá)而在患者中導(dǎo)致白癜風(fēng)（vitiligo)和虹膜炎（iritis)。在天然TCR轉(zhuǎn)移后在小鼠中 報(bào)道了由于TCR交叉配對所致的移植物抗宿主病（GvHD)樣癥狀。報(bào)道了在使用納入共刺 激的一些CAR的過繼性轉(zhuǎn)移后在動物模型中的淋巴增殖性病癥。最后，載體插入性誘變的 風(fēng)險(xiǎn)始終存在。雖然急性毒性可通過小心給藥來解決，但慢性毒性可能是不依賴于細(xì)胞劑 量的。
[0009] 由于工程化的T細(xì)胞在施用后能擴(kuò)充并持續(xù)數(shù)年，期望在面臨毒性時納入安全性 機(jī)制以允許過繼性輸注的T細(xì)胞的選擇性缺失。
[0010] 自殺基因使得能夠在體內(nèi)選擇性缺失經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。有兩種自殺基因處于臨床測 試中：HSV-TK 和 iCasp9。
[0011] T細(xì)胞中的單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)表達(dá)賦予對更昔洛韋（Ganciclovir) 的易感性。HSV-TK使用局限于深度免疫抑制的臨床背景如單倍體相合骨髓移植 (haploidentical bone marrow transplantation)，因?yàn)樵摬《镜鞍踪|(zhì)是高度免疫原性的。 另外，它排除了將更昔洛韋用于巨細(xì)胞病毒治療。
[0012] 最近，描述了可誘導(dǎo)的胱天蛋白酶9(iCasp9)，其可通過施用小分子藥物 (AP20187)激活。iCasp9的使用依賴于臨床級AP20187的可用性。另外，在遺傳工程化細(xì) 胞產(chǎn)品外的實(shí)驗(yàn)小分子的使用可能導(dǎo)致管理問題。
[0013] 因此，需要改進(jìn)的自殺基因，其克服了與免疫原性和與已知自殺基因有關(guān)的誘導(dǎo) 藥物的可用性有關(guān)的問題。
[0014] 標(biāo)志基因
[0015] 為了最大化過繼性細(xì)胞療法的效率，期望具有用于監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和選擇經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì) 胞的機(jī)制。然后可將純化的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體給予患者。
[0016] 一些T細(xì)胞工程化策略不導(dǎo)致容易檢出的表面蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在這些情況 中，難以進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)測量和外周血中細(xì)胞的追蹤。另外，在一些背景中，需要僅施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的T 細(xì)胞，例如在GvHD基因治療方案中。此時，需要允許臨床級分選的標(biāo)志物。
[0017] 已描述了幾種標(biāo)志基因。第一種是新霉素抗性基因，其現(xiàn)在具有歷史性興趣，因?yàn)?該異種（xenogeneic)蛋白質(zhì)僅允許通過抗生素選擇的緩慢分選。還提出了低親和力神經(jīng) 生長因子受體。盡管是非免疫原性的，但其表明預(yù)料不到的生物學(xué)效果。
[0018] 最近，已經(jīng)將截短的⑶34用作標(biāo)志物。這具有如下的優(yōu)點(diǎn)，即⑶34 Miltenyi CliniMACS選擇系統(tǒng)可容易地用于臨床級分選。然而，已報(bào)道⑶34轉(zhuǎn)基因的納入可導(dǎo)致經(jīng) 轉(zhuǎn)導(dǎo) T 細(xì)胞的異常歸巢（homing) (Lange 等（2007) Stem Cells Dev. 16:297-304)。
[0019] 還有，甚至截短的⑶34也具有較長的編碼序列，將該蛋白質(zhì)作為標(biāo)志基因納入可 能加重載體包裝容量和轉(zhuǎn)錄效率的負(fù)擔(dān)。
[0020] 因此，需要改進(jìn)的標(biāo)志基因，其克服了與已知標(biāo)志基因有關(guān)的免疫原性、預(yù)料不到 的生物學(xué)活性和長編碼序列相關(guān)的問題。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖I :QBEND10與全長CD34(CD34)的結(jié)合，表位經(jīng)由接頭（QL8)、不經(jīng)接頭（Q8)融 合至CD8柄（stalk)，或直接融合至CD8 a跨膜域（Q)。使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共表達(dá)eGFP。 結(jié)論是QBEND10的有效結(jié)合需要間隔區(qū)，但柔性接頭不然。
[0023] 圖2 :使用Miltenyi⑶34選擇試劑盒將用低滴度上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞富集至接 近純。
[0024] 圖3 :對利妥昔單抗結(jié)合物的不同嘗試，結(jié)合通過FACS顯示，如下：(a)全長⑶20。 剩余部分均附接CD8柄。（b) CD20的主要胞外環(huán)，在二硫鍵任一側(cè)包含5個殘基；（c)來自 二硫鍵半胱氨酸的CD20的主要胞外環(huán)；（d)來自Perosa (2007, J. Immunol 179:7967-7974) 的環(huán)狀模擬位（mimetope) ;(e)來自Perosa(2007,如上文）的線性模擬位。選擇構(gòu)建 體（d)，因?yàn)槠渌麡?gòu)建體不能結(jié)合、結(jié)合較差或產(chǎn)生兩階段結(jié)合模式（bi-phasic binding pattern)〇
[0025] 圖4 :(a)顯示RQR8結(jié)構(gòu)的草圖；(b)將QBEND10結(jié)合與全長CD34的結(jié)合比較 (左）；將利妥昔單抗對RQR8的結(jié)合與全長CD20的結(jié)合比較（右）。注意共表達(dá)eGFP。（c) 在活細(xì)胞上暴露于補(bǔ)體和利妥昔單抗門孔后的殺傷效率顯示實(shí)際上所有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的 消除。
[0026] 圖5 : (a)通過FACS檢測的在人T細(xì)胞上第三代抗GD2 CAR的表達(dá)，和（b)在針 對GD2+靶細(xì)胞系的鉻釋放測定法中未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞（NT)、抗CD19 T細(xì)胞和抗GD2 T細(xì)胞 (HuK)的功能。（c)通過四聚體染色檢測的、識別在EBV特異性CTL上表達(dá)的HA-I次要組 織相容性抗原的天然TCRa 0。⑷由這些經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV-CTL對HA-I陽性HLA-A2+PHA母 細(xì)胞（冊）的殺傷，且不存在對HA-I陰性（RR)HLA-A2+母細(xì)胞的殺傷。
[0027] 圖6 :GvHD模型。Balb/c接受體小鼠被輻射并接受來自C57BL/6小鼠的IO7個T 消除的骨髓細(xì)胞。對照小鼠不接受另外的細(xì)胞；測試小鼠接受3xl06個磁性分選的用RQR8 轉(zhuǎn)導(dǎo)的C57BL/6脾細(xì)胞。（a)BMT后在第29天對針對⑶4和ThyL 1染色的脾細(xì)胞的FACS。 殘余接受體淋巴細(xì)胞（Thyl. 1+)存在于對照小鼠而非指示GvHD的接受體小鼠中。（b)可以 看到，同樣是在第29天與經(jīng)QBEndlO轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞一起染色的脾細(xì)胞被植入接受體小鼠 內(nèi)。（c)對照小鼠和（d)接受體小鼠的腸組織學(xué)，后者中顯示清楚的腸 GvHD。
[0028] 圖7 :在GvHD小鼠模型中經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的脾細(xì)胞的BLI。（a)我們已將RQR8與我們的紅 移的（red-shifted)、密碼子優(yōu)化的螢火蟲螢光素酶以符合讀碼框的方式克隆，由自身切割 性2A序列分隔開（RQR8-2A-FLUC)。（b)將Black 6脾細(xì)胞用上述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、分選并以DLI 施用。7天后在（b)活體動物和（c)解剖的小腸上實(shí)施生物發(fā)光成像。
[0029] 圖8 :重組Ritux-鼠 IgG2a抗體（Ritux_mG2a)對未轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞、用僅 QBEndlO表位的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞和用僅RQR8構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞的結(jié) 合。（eGFP共表達(dá)）
[0030] 圖9 :共表達(dá)RQR8和以下任一項(xiàng)的構(gòu)建體：（a)抗⑶2 CAR或抗HAl天然TCR
[0031] 圖10 :提議的構(gòu)建體，它們具有（a)在CD8柄上的QbendlO表位（Q8作為對照）， (b)僅RQR8,或與以下任一項(xiàng)共表達(dá)的Q8 :(c)iCasp9或（d)HSV-TK。還顯示了工程化為共 表達(dá)螢火蟲螢光素酶（FLuc)的構(gòu)建體。
[0032] 圖11 =QBEndlO結(jié)合的更精細(xì)的表位定位。
[0033] 圖12 :基于模擬位結(jié)合構(gòu)建體的利妥昔單抗結(jié)合表位。
[0034] 圖13 :重新工程化的構(gòu)建體。
[0035] 圖14 :使用重新工程化的構(gòu)建體的⑶C測定法。
[0036] 圖15 :GvHD模型評估。
[0037] 圖16 :顯示晶體結(jié)構(gòu)和適宜距離的示意圖。
[0038] 發(fā)明概述
[0039] 本發(fā)明提供一種緊湊的多肽，其包含標(biāo)志模塊和自殺模塊兩者。所述多肽可以與 治療性轉(zhuǎn)基因，如編碼TCR或CAR的基因共表達(dá)。
[0040] 所述標(biāo)志模塊包含CD34的最小表位，其允許使用例如Miltenyi CD34 cliniMACS 系統(tǒng)有效選擇經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
[0041] 所述自殺模塊包含基于來自CD20的表位的最小表位。使用溶胞抗體如利妥昔單 抗可選擇性殺傷表達(dá)包含該序列的多肽的細(xì)胞。
[0042] 組合的標(biāo)志物和自殺多肽在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)，例如在其編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病 毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后。
[0043] 由于載體包裝限制和CD34和CD20兩者的復(fù)雜化生物學(xué)作用，除了治療性轉(zhuǎn)基因 (如編碼TCR或CAR的轉(zhuǎn)基因）以外還共表達(dá)⑶20和⑶34是在技術(shù)上有挑戰(zhàn)性的。通過提 供包含來自這些蛋白質(zhì)的結(jié)合表位的多肽，本發(fā)明人提供了高度緊湊的標(biāo)志/自殺多肽， 其編碼序列足夠小以易于包裝并與T細(xì)胞工程化轉(zhuǎn)基因共表達(dá)，但其保留就標(biāo)志物選擇和 經(jīng)由自殺模塊的選擇性刪除而言的功能性。通過提供所述結(jié)合表位，組合的標(biāo)志/自殺多 肽避免與全長⑶20和⑶34分子相關(guān)的生物學(xué)作用。
[0044] 因此，在第一方面，本發(fā)明通過具有下式的多肽：
[0045] St-Rl-Sl-Q-S2-R2
[0046] 其中
[0047] St是柄序列，當(dāng)所述多肽在靶細(xì)胞表面表達(dá)時，其導(dǎo)致R和Q表位從所述細(xì)胞表面 伸出；
[0048] Rl和R2是利妥昔單抗結(jié)合表位，它們各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No. 1，6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15和16或其保留利妥昔單抗結(jié)合活性的變體；
[0049] Sl和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；和
[0050] Q是具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的QBEndlO結(jié)合表位或保留QBEndlO結(jié) 合活性的其變體。
[0051] Rl和R2可以各自具有如SEQ ID No. 7所示的序列。
[0052] Rl和R2之間的距離太長以致所述多肽不能同時結(jié)合利妥昔單抗的兩個抗原結(jié)合 位點(diǎn)。
[0053] 間隔序列Sl和S2可以具有至少約10個氨基酸的聯(lián)合長度。
[0054] Rl和R2之間的距離可以超過76.571
[0055] 所述柄序列可以是源自⑶8alpha的。
[0056] 所述柄序列可以包含如SEQ ID No. 3中顯示的氨基酸序列。
[0057] 所述多肽可以包含顯示為SEQ ID No. 4的序列或其變體，該變體與顯示為SEQ ID No.4的序列具有至少80%同一性且其（i)結(jié)合QBEND10;(ii)結(jié)合利妥昔單抗，和（iii) 當(dāng)在細(xì)胞表面上表達(dá)時，在利妥昔單抗存在的情況下誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。
[0058] 在第二個方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，其包含與目的蛋白質(zhì)（POI)融合的根 據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽。
[0059] 所述POI可以是嵌合抗原受體（CAR)或T細(xì)胞受體（TCR)。
[0060] 所述融合蛋白可以包含在所述多肽與所述目的蛋白質(zhì)之間的自身切割肽。
[0061] 在第三方面，本發(fā)明提供一種核酸序列，其能編碼根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽或 根據(jù)本發(fā)明第二方面的融合蛋白。
[0062] 在第四方面，本發(fā)明提供一種包含根據(jù)本發(fā)明第三方面的核酸序列的載體。
[0063] 所述載體還可以包含目的轉(zhuǎn)基因，其可以編碼嵌合抗原受體或T細(xì)胞受體。
[0064] 在第五方面，本發(fā)明提供表達(dá)根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽的細(xì)胞。
[0065] 所述細(xì)胞可在細(xì)胞表面上共表達(dá)所述多肽和POI。
[0066] 還提供一種包含根據(jù)本發(fā)明第三方面的核酸序列的細(xì)胞。
[0067] 所述細(xì)胞可以是T細(xì)胞。
[0068] 在第六方面，本發(fā)明提供一種用于制備根據(jù)本發(fā)明第五方面的細(xì)胞的方法，其包 括用根據(jù)本發(fā)明第四方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。
[0069] 在第七方面，本發(fā)明提供一種用于研究基因治療方法的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其包括 在用根據(jù)本發(fā)明第四方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上檢測QBEndlO結(jié)合表位的表達(dá) 的步驟。
[0070] 在第八方面，本發(fā)明提供用于選擇表達(dá)POI的細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：
[0071] (i)在用根據(jù)本發(fā)明第四方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上檢測QBEndlO結(jié)合 表位的表達(dá)；并
[0072] (ii)選出鑒定為表達(dá)所述QBEndlO結(jié)合表位的細(xì)胞。
[0073] 在第九方面，本發(fā)明提供一種用于制備富集表達(dá)POI的細(xì)胞的純化的細(xì)胞群體的 方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明第八方面的方法從細(xì)胞群體中選出表達(dá)POI的細(xì)胞的步驟。
[0074] 所述方法可包括以下步驟：
[0075] ⑴用根據(jù)本發(fā)明第四方面的載體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從患者分離的細(xì)胞群體；并
[0076] (ii)通過根據(jù)本發(fā)明第八方面的方法從經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體中選出表達(dá)POI 的細(xì)胞。
[0077] 在第十方面，本發(fā)明提供富集表達(dá)根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽的細(xì)胞，由此富集 有表達(dá)POI的細(xì)胞的細(xì)胞群體。
[0078] 在第十一方面，本發(fā)明提供一種用于體內(nèi)追蹤經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法，其包括在所述 細(xì)胞表面上檢測根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽的表達(dá)的步驟。
[0079] 在第十二方面，本發(fā)明提供一種用于消除根據(jù)本發(fā)明第五方面的細(xì)胞的方法，其 包括將所述細(xì)胞暴露于利妥昔單抗的步驟。
[0080] 在第十三方面，本發(fā)明提供一種用于治療受試者中疾病的方法，其包括施用根據(jù) 本發(fā)明第五方面的細(xì)胞，或根據(jù)本發(fā)明第十方面的細(xì)胞群體的步驟。
[0081] 所述方法可以包括以下步驟：
[0082] (i)用根據(jù)本發(fā)明第四方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從受試者分離的細(xì)胞的樣品；并 [0083] (ii)將所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞返回至患者。
[0084] 所述方法可用于治療癌癥。
[0085] 在第十四方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第五方面的細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明第十方面的 細(xì)胞群體，其用于通過過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的療法。
[0086] 發(fā)明詳述
[0087] 本發(fā)明提供一種包含標(biāo)志表位和自殺表位的多肽。
[0088] 標(biāo)志基因
[0089] 標(biāo)志基因是一種通常不由靶細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，其允許鑒定成功的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0090] 在本發(fā)明的多肽中，使用源自⑶34的標(biāo)志物。⑶34是細(xì)胞表面糖蛋白且作為細(xì) 胞-細(xì)胞粘著因子發(fā)揮功能。它還介導(dǎo)干細(xì)胞對骨髓細(xì)胞外基質(zhì)或直接對基質(zhì)細(xì)胞的附 著。
[0091] ⑶34不由終末分化的造血譜系表達(dá)，因此它是用于經(jīng)修飾T細(xì)胞的理想標(biāo)志物。
[0092] 可以容易地鑒定并使用Miltenyi CliniMACS磁性細(xì)胞選擇系統(tǒng)（一種普遍使用 的用于臨床干細(xì)胞分離的試劑）分離表達(dá)⑶34的細(xì)胞。CliniMACS⑶34選擇系統(tǒng)利用 QBEndlO單克隆抗體來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞選擇。
[0093] 本發(fā)明人已從⑶34抗原內(nèi)匹配QBEndlO結(jié)合表位（見實(shí)施例）并確定其具有如 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0094] ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID No. 2)〇
[0095] 本發(fā)明的多肽包含QBEndlO結(jié)合表位，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列 或保留QBEndlO結(jié)合活性的其變體。
[0096] 如本文中使用的，術(shù)語"具有"與術(shù)語"包含/包括"同義。
[0097] 變體QBEndlO結(jié)合表位基于如SEQ ID No. 2所示的序列，但包含一個或多個氨基 酸突變，如氨基酸插入、取代或缺失，只要該表位保留QBEndlO結(jié)合活性。具體地，所示序列 可在一個或兩個末端截短例如一或兩個氨基酸。
[0098] 可基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)進(jìn)行有意的氨 基酸取代，只要表位的QBEndlO結(jié)合活性得以保留。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸 和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而有不帶電荷的極性頭基團(tuán)且具有相 似的疏水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0099] 可以例如按照下表進(jìn)行保守性取代。處于第二列同一區(qū)組且第三列同一行中的氨 基酸可以彼此取代：
[0100]
【權(quán)利要求】
1. 一種具有下式的多肽： St-Rl-Sl-Q-S2-R2 其中 St是柄序列，當(dāng)所述多肽在靶細(xì)胞表面表達(dá)時，該柄序列導(dǎo)致R和Q表位從所述細(xì)胞表 面伸出； Rl和R2是利妥昔單抗結(jié)合表位，它們各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No. 1， 6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15和16或其保留利妥昔單抗結(jié)合活性的變體； Sl和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；且 Q是具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的QBEndlO結(jié)合表位或保留QBEndlO結(jié)合活 性的其變體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中Rl和R2之間的距離過長使得所述多肽不能同時結(jié)合 利妥昔單抗的兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，其中所述間隔序列Sl和S2具有至少約10個氨基酸的聯(lián)合 長度。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中Rl和R2之間的距離超過76.57Ju
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述柄序列能從CDSalpha衍生。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，其中所述柄序列包含如SEQ ID No. 3顯示的氨基酸序列。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其包含如SEQ ID No. 4顯示的序列或其變體，該 變體與以SEQ ID No. 4顯示的序列具有至少80%同一性，且該變體（i)結(jié)合QBEND10 ;(ii) 結(jié)合利妥昔單抗，和（iii)當(dāng)在細(xì)胞表面上表達(dá)時，在利妥昔單抗存在的情況下誘導(dǎo)補(bǔ)體 介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。
8. -種融合蛋白，其包含與目的蛋白質(zhì)（POI)融合的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多 肽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的融合蛋白，其中所述POI是嵌合抗原受體（CAR)或T細(xì)胞受體 (TCR)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的融合蛋白，其包含在所述多肽與所述目的蛋白質(zhì)之間的自身 切割肽。
11. 一種核酸序列，其能編碼根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求8至10 中任一項(xiàng)的融合蛋白。
12. -種包含根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列的載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的載體，其還包含目的轉(zhuǎn)基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的載體，其中所述目的轉(zhuǎn)基因編碼嵌合抗原受體或T細(xì)胞受體，從 而當(dāng)使用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時，所述靶細(xì)胞共表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽 和嵌合抗原受體或T細(xì)胞受體。
15. -種表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽的細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其在所述細(xì)胞表面上共表達(dá)所述多肽和POI。
17. -種包含根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列的細(xì)胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其為T細(xì)胞。
19. 一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要 求12至14中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。
20. -種用于研究基因治療方法的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其包括在用根據(jù)權(quán)利要求12至14 中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面上檢測QBEndlO結(jié)合表位表達(dá)的步驟。
21. -種用于選擇表達(dá)POI的細(xì)胞的方法，其包括以下步驟： (i) 在用根據(jù)權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面上檢測QBEndlO結(jié)合表位的表 達(dá)；并 (ii) 選出鑒定為表達(dá)所述QBEndlO結(jié)合表位的細(xì)胞。
22. -種用于制備富集表達(dá)POI的細(xì)胞的純化細(xì)胞群體的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利 要求21的方法從細(xì)胞群體中選出表達(dá)POI的細(xì)胞的步驟。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其包括以下步驟： (i) 用根據(jù)權(quán)利要求13的載體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從患者分離的細(xì)胞群體；并 (ii) 通過根據(jù)權(quán)利要求22的方法從經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體中選出表達(dá)POI的細(xì)胞。
24. -種細(xì)胞群體，其富集表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽的細(xì)胞，因此富集 表達(dá)POI的細(xì)胞。
25. -種用于體內(nèi)追蹤經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的方法，其包括檢測根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng) 的多肽在所述細(xì)胞表面的表達(dá)的步驟。
26. -種用于消除根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法，其包括將所述細(xì)胞暴 露于利妥昔單抗的步驟。
27. -種用于治療受試者中的疾病的方法，其包括對所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求15 至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求24的細(xì)胞群體的步驟。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其包括以下步驟： (i) 用根據(jù)權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從受試者分離的細(xì)胞樣品；并 (ii) 將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞返回至所述患者。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其用于治療癌癥。
30. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求24的細(xì)胞群體，其用于過 繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
【文檔編號】C07K14/705GK104379599SQ201380029374
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月13日
【發(fā)明者】M.普利, B.菲利普 申請人:Ucl商務(wù)股份有限公司