細(xì)胞穿透肽和鑒定細(xì)胞穿透肽的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽，和基于疏水性和極性鑒定細(xì)胞穿透肽的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】細(xì)胞穿透肽和鑒定細(xì)胞穿透肽的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽和基于疏水性和極性鑒定細(xì)胞穿透肽的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞穿透膚（CPP)，例如antp基因（antennapedia)來(lái)源的penetratin(Derossi 等，J.Biol.Chem.，269, 10444-10450, 1994)和Tat肽（Vives等，了^〇1· Chem.，272, 16010-16017, 1997)，是廣泛用于將貨物分子，例如肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸遞 送入細(xì)胞的工具（Fischer等，Bioconjug.Chem.，12, 825-841，2001)。應(yīng)用領(lǐng)域從純 細(xì)胞生物學(xué)到生物醫(yī)學(xué)研究（Dietz和Bahr,Mol.Cell. ,Neurosci, 27, 85-131，2004)。 最初，細(xì)胞攝取被認(rèn)為通過(guò)直接透過(guò)質(zhì)膜而發(fā)生（Prochiantz,Curr.Opin.Cell Biol.，12, 400-406, 2000)。在過(guò)去多年里，已積累了證據(jù)表明，對(duì)于幾種CPP，細(xì) 胞內(nèi)吞作用至少顯著地促成細(xì)胞攝取（綜述參見(jiàn)Fotin-Mleczek等，（]111·!·.?]^；?!· Design, 11，3613-3628, 2005)?；诮鼇?lái)的這些結(jié)果，將一個(gè)肽描述為CPP因此并不隱含特 定的細(xì)胞輸入機(jī)制，而是指起著如下肽的作用，即當(dāng)所述肽與貨物共價(jià)或非共價(jià)綴合時(shí)，所 述肽增加貨物分子的細(xì)胞攝取。
[0003] 大多數(shù)細(xì)胞穿透肽具有許多疏水和/或正電荷殘基，但是它們巨大的序列多樣性 使得難于預(yù)測(cè)任何給定肽是否將是細(xì)胞穿透性的。Cruciani等，J.Chemometrics, 2004 ; 18:146-155,針對(duì)20種氨基酸之每一種，提出了一組描述詞（PP1 [極性]和PP2[疏水 性])。然而，盡管有這些描述詞，但是尚沒(méi)有提出或存在方法可以基于PPl和PP2合理地預(yù) 測(cè)肽的細(xì)胞穿透性。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽和基于疏水性和極性鑒定細(xì)胞穿透肽的方法。
[0006] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)如下方式從一組肽中鑒定細(xì)胞穿透肽的方 法：（1)確定所述肽的極性（稱(chēng)作"ΡΡΓ) ;(2)確定所述肽的疏水性（稱(chēng)作"PP2"）；（3)在 該組中鑒定肽，其中PP1〈 [ (PP2*X1) +X]，其中Xl是1. 5至10,X是0. 3至-1. 5 ;以及⑷在 體外和體內(nèi)試驗(yàn)中測(cè)試步驟3鑒定的肽以驗(yàn)證所述肽是細(xì)胞穿透性的。
[0007] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有選自SEQIDNO: 1-455的氨基酸序列的細(xì) 胞穿透肽、以及含有其的組合物和綴合物。特別地，本發(fā)明涉及這樣的本發(fā)明細(xì)胞穿透肽， 其與小分子、核酸、熒光結(jié)構(gòu)部分、蛋白質(zhì)、肽、或其他貨物綴合以遞送至細(xì)胞內(nèi)部（如細(xì)胞 質(zhì)或細(xì)胞核）用于各種治療應(yīng)用及其他應(yīng)用。
[0008] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核苷酸，其編碼具有選自SEQIDNO: 1-455 的氨基酸序列的肽。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含分離的核苷酸的載體，其中所述分 離的核苷酸編碼具有選自SEQIDNO: 1-455的氨基酸序列的肽。本發(fā)明還涉及制備和使用 所述肽、核苷酸和載體的方法。
[0009]附圖簡(jiǎn)述
[0010] 圖1描繪從天然序列提取的一組隨機(jī)肽的極性（PPl)和疏水性（PP2)，其中小點(diǎn)指 示隨機(jī)肽，較大點(diǎn)指示（根據(jù)文獻(xiàn)）這組隨機(jī)肽中的細(xì)胞穿透肽，三角形指示這組隨機(jī)肽中SEQIDN0:l-9的細(xì)胞穿透肽（由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞穿透性的），星形指示這組隨機(jī)肽 中SEQIDNO: 10-19的細(xì)胞穿透肽（由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞穿透性的）。對(duì)角線（標(biāo)為A 和B)定義每條線右邊的區(qū)域，（根據(jù)本發(fā)明）在該區(qū)域中的肽具有細(xì)胞穿透性的可能性增 力口。A線右邊的區(qū)域是當(dāng)Xl為1. 7且X為0. 3時(shí)定義的區(qū)域。B線右邊的區(qū)域是當(dāng)Xl為 1.7且X為-0.2時(shí)定義的區(qū)域。
[0011] 圖2A-2B顯示實(shí)施例1-9的肽（本發(fā)明鑒定的SEQIDNO: 1-9,其共價(jià)連接異硫氰 酸熒光素（FITC))以30μm濃度在H460細(xì)胞中2小時(shí)的細(xì)胞穿透結(jié)果。
[0012] 圖3A-3B顯示實(shí)施例10-19的肽（本發(fā)明鑒定的SEQIDNO: 10-19,其共價(jià)連接異 硫氰酸熒光素（FITC))以3μm濃度在H460細(xì)胞中2小時(shí)的細(xì)胞穿透結(jié)果。
[0013] 發(fā)明詳述
[0014] 本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽和基于疏水性和極性鑒定細(xì)胞穿透肽的方法。
[0015] 肽的極性或PPl是肽中所有氨基酸的平均極性，其中具體氨基酸的極性列于表1。 肽的疏水性或PP2是肽中所有氨基酸的平均疏水性，其中具體氨基酸的疏水性列于表1。
[0016]表1
[0017]

【權(quán)利要求】
1. 一種肽，其中所述肽的PP1為〈[(所述肽的PP2*X1)+X]，其中XI是1. 7至2. 3, X 是-0.6 至-0.85。
2. 權(quán)利要求1的肽，選自SEQ ID NO. 1-455。
3. 權(quán)利要求2的肽，選自SEQ ID NO. 1-9。 4?權(quán)利要求 2 的肽，選自 SEQ ID NO. 10、11、15、16、17 和 18。
5. 權(quán)利要求1至4之任一項(xiàng)的肽，其與小分子、核酸、肽或蛋白綴合。
6. 從一組肽中鑒定細(xì)胞穿透肽的方法，所述方法通過(guò)如下實(shí)施：（1)確定所述肽的 PP1 ;(2)確定所述肽的PP2 ;(3)在該組中鑒定肽，其中PP1〈[(PP2*X1)+X]，其中XI是1. 5 至10且X是0. 3至-1. 5 ;和（4)在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中測(cè)試步驟3鑒定的肽，以驗(yàn)證所述肽 是細(xì)胞穿透性的。
7. 治療癌癥、或病毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、炎性、免疫、或代謝疾病或病癥的方法，包括向有 需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)的肽。
8. 編碼權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)的肽的分離核苷酸。
9. 包含權(quán)利要求8的分離核苷酸的載體。
10. 權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)的肽的用途，用于治療或預(yù)防癌癥、病毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 炎性、免疫，代謝疾病或病癥。
11. 前面描述的本發(fā)明。
【文檔編號(hào)】C07K7/04GK104428310SQ201380033264
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月26日
【發(fā)明者】F·米利迪 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司