P2x7受體拮抗劑和激動劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對P2X7的生物材料并且更特別是涉及多肽，編碼此種多肽的核酸；制備此種多肽的方法；表達或能夠表達此種多肽的宿主細(xì)胞；用于預(yù)防、治療或診斷目的的包含此種多肽的組合物并且尤其是藥物組合物。尤其是，本發(fā)明的生物材料抑制P2X7受體的生物學(xué)活性，諸如被ATP活化。
【專利說明】P2X7受體拮抗劑和激動劑 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及與P2X7受體相關(guān)的生物材料并且更特別是涉及多肽，編碼此種多肽 的核酸；制備此種多肽的方法；表達或能夠表達此種多肽的宿主細(xì)胞；用于預(yù)防、治療或診 斷目的的包含此種多肽的組合物并且尤其是藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 嘌呤核苷酸被公認(rèn)為細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。P2X受體是ATP-門控（gated)陽離子 通道，其介導(dǎo)例如在腦和脊髓的不同區(qū)域中的快速刺激性傳遞。P2X7亞型具有在延長的對 ATP的暴露過程中改變其離子選擇性的獨特性質(zhì)，其導(dǎo)致通道孔的漸進式擴張和形成對大 如900Da的分子的滲透性。P2X7受體最初在造血源細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞，和某些淋巴細(xì)胞）中描述，并且介導(dǎo)Ca2+和Na+離子的流入，以及促炎癥細(xì)胞因子 的釋放。P2X7受體可以通過其調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-10 (神經(jīng)變性，慢性炎癥，和慢性疼痛中 的關(guān)鍵介質(zhì)）的加工和釋放能力影響神經(jīng)細(xì)胞死亡。P2X7受體的活化提供炎性刺激，并且 P2X7受體-缺陷小鼠具有基本上減弱的炎性反應(yīng)，包括神經(jīng)病性和慢性炎性疼痛的模式。 此外，P2X7受體活性，通過調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子的釋放，可以參與抑郁癥（depression) 的病理生理學(xué)。P2X7受體可以因此代表神經(jīng)和免疫系統(tǒng)之間的關(guān)鍵通信連接（Skaper等 人2010FASEBJ. 24:337-345)。P2X7受體向免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞的定位，加上其從這些 細(xì)胞釋放重要炎性介質(zhì)的能力提示P2X7受體拮抗劑在廣泛疾病的治療中的潛在作用，所 述疾病包括疼痛和神經(jīng)變性疾病，同時提供用于治療劑開發(fā)的靶點。
[0003] 在凋亡細(xì)胞死亡為重要疾病機制的癌癥中，P2X7以其在凋亡中的直接作用發(fā)揮 重要作用，如與正常組織相比在皮膚癌和子宮上皮癌中所顯示的?？赡躊2X7將在未來用作 生物標(biāo)志物以區(qū)分正常和癌癥子宮上皮組織。
[0004] 已經(jīng)將嚙齒類動物糖尿病模型中視網(wǎng)膜的早期凋亡細(xì)胞死亡與在眼的那個部分 的P2X7活化關(guān)聯(lián)起來，提示與糖尿病微血管損傷的可能關(guān)聯(lián)。
[0005] 已經(jīng)報道，在基于家庭的定量遺傳關(guān)聯(lián)研宄中，P2X7受體多態(tài)性可以與高血壓 (hypertension)相關(guān)，P2X7的第一內(nèi)含子中的單核苷酸多態(tài)性rs591874與夜間舒張壓強 烈相關(guān)。P2X7受體表達在心血管系統(tǒng)細(xì)胞中并且影響該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的藥物可以提供高血 壓和預(yù)防血栓形成事件方面的新療法。
[0006] 在健康腎中P2X7受體的表達非常少（如果有的話）。相反，P2X7的表達在患病 的腎組織中增加并且兩個腎疾病嚙齒動物模型的腎小球的免疫組化顯示，在足細(xì)胞、內(nèi)皮 和腎小球膜細(xì)胞中有顯著表達。已經(jīng)描述了P2X7受體對多囊性腎?。╬olycystickidney disease)和腎纖維化的可能作用。
[0007] 因為ATP在神經(jīng)傳遞和神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，所以嘌呤受體亞家族（包括 P2X7)已經(jīng)參與各種病理狀態(tài)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)疾病的該病理生理學(xué)包括腦外傷，局 部缺血（ischemia)，神經(jīng)變性和神經(jīng)精神性疾病。當(dāng)損傷發(fā)生時，大量ATP被釋放到細(xì)胞 外環(huán)境，其對于引發(fā)針對外傷的細(xì)胞應(yīng)答是重要的。在此情況下，P2X4和P2X7的表達水平 改變，其可能刺激靜止的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向損傷位點迀移和趨化。P2X7在控制小神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞迀移和死亡方面發(fā)揮重要作用。
[0008] 腦缺血可以產(chǎn)生CNS問題和使CNS問題加重，所述CNS問題包括卒中（stroke)并 且在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上表達的P2X7受體可能參與由于葡萄糖/氧喪失而產(chǎn)生的皮層損傷。
[0009] 神經(jīng)炎癥在很多神經(jīng)變性疾病諸如阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease)和帕 金森?。≒arkinson'sdisease)的發(fā)病中發(fā)揮主要作用。盡管精確機制尚不清楚，但小 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)可以增強炎癥，導(dǎo)致突觸功能障礙并最終導(dǎo)致神經(jīng) 細(xì)胞死亡。P2X7受體的表達和功能在阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease)患者死亡后 的腦中和不同神經(jīng)變性疾病動物模型中顯著上調(diào)。這支持P2X7R通路在神經(jīng)變性進程中的 作用。已經(jīng)顯示，使用亮藍(lán)G(可以穿過血腦屏障的P2X7R拮抗劑）阻斷P2X7R導(dǎo)致各種動 物模型中神經(jīng)病理學(xué)的改善。突觸的改變和增加的對神經(jīng)死亡的易感性是已知的對亨廷頓 病（Huntington'sdisease) (HD)癥狀學(xué)的促成因素。降低的代謝長期以來與HD相關(guān)。最 近的研宄結(jié)果證明了由減少ATP產(chǎn)生的藥物導(dǎo)致的HD的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans)和果幡（Drosophila)模型中降低的神經(jīng)凋亡。已經(jīng)報道，細(xì)胞外ATP通過刺激 P2X7受體誘導(dǎo)神經(jīng)死亡并且因此，P2X7-介導(dǎo)的鈣滲透性的改變可以促進HD突觸功能障 礙和增加的神經(jīng)凋亡。使用HD小鼠和細(xì)胞模型，證明了HD神經(jīng)元的體部和末端中增加 的P2X7-受體水平和改變的P2X7-介導(dǎo)的鈣滲透性，并且向HD小鼠體內(nèi)施用P2X7-拮抗劑 BrilliantBlue-G(BBG)阻止了神經(jīng)凋亡并且減弱了體重?fù)p失和運動協(xié)調(diào)缺陷。
[0010] 總之，這些結(jié)果提升了P2X7R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為用于治療各種神經(jīng)變性疾病（包 括AD和HD)的治療靶點的可能性。
[0011] 多發(fā)性硬化（Multiplesclerosis) (MS)是免疫原性的、復(fù)發(fā)的慢性炎性疾病。對 于生物制劑，存在用作MS治療劑的巨大可能。第一代細(xì)胞因子（IFN-Y-la，IFN-y-lb)和 抗體（針對⑶52,⑶49d，⑶25,⑶20)在臨床中既獲得了有希望的結(jié)果也獲得了令人失望的 結(jié)果，但顯然仍然存在對通過新作用機制靶向淋巴細(xì)胞來緩解炎癥或靶向慢性活化的小 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的治療劑的高度醫(yī)療需求。
[0012] 盡管被很好證實，但離子通道代表了用于治療MS的正在開發(fā)的靶點類型。針對 離子通道的藥物開發(fā)受阻，因為小分子抑制劑通常缺少特異性并且影響靶點的相關(guān)物并甚 至影響無關(guān)蛋白。
[0013] P2X7受體表達在骨髓細(xì)胞以及CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上，并且已經(jīng)顯示P2X7活化增 加神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和T-細(xì)胞活化。這些性質(zhì)提示在自身免疫?。ò∕S)的發(fā)展中的作用。 顯示MS動物模型中P2X7缺陷（實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis) (EAE))導(dǎo)致代償性變化，其導(dǎo)致增加的T-細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且 P2X7裸鼠的腦中檢測到活化的T-細(xì)胞而無臨床體征。大大降低的疾病發(fā)生率提示，在這些 小鼠中起始事件缺失并且指出星形膠質(zhì)細(xì)胞的P2X7在EAE疾病發(fā)展中的作用。
[0014] Matute等人（J.Neuroscience2007 :27 (35) :9525-9533)已經(jīng)顯示，在體外和體 內(nèi)增強的ATP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致通過P2X7受體-介導(dǎo)的Ca2+毒性的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，并且 P2X7受體介導(dǎo)組織損傷，其引起與公認(rèn)的MS模型相關(guān)的神經(jīng)性缺損。相應(yīng)地，在MS中損 傷形成之前，軸突束中P2X7受體表達增加，提示該特征構(gòu)成與此種疾病中新形成的損傷相 關(guān)的風(fēng)險因子。因此，阻斷ATPP2X7受體具有有效的神經(jīng)保護性性質(zhì)，提示該機制可能用 于停止MS中組織損傷的進程。
[0015] 已經(jīng)描述了P2X7特異性多克隆和單克隆抗體（Adriouch等人，2005〃Probing theexpressionandfunctionoftheP2X7purinoceptorwithantibodiesraisedby geneticimmunization〃CellImmunol236 :72_77;Seman等人 2003.NAD-inducedTcell death：ADP-ribosylationofcellsurfaceproteinsbyART2activatesthecytolytic P2X7purinoceptor.Immunity19 :571_582)。結(jié)果表明這些抗體是進一步表征P2X7的結(jié) 構(gòu)和功能的有用工具。美國專利申請?zhí)?010/0173799描述結(jié)合P2X7的納米抗體。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明提供具有與現(xiàn)有技術(shù)氨基酸序列和抗體相比，除了其它有利性質(zhì)（諸如， 例如，改善的制備容易度，良好的穩(wěn)定性，和/或降低的商品成本）之外具有改善的預(yù) 防，治療和/或藥學(xué)性質(zhì)的多肽。
[0018] 基于廣泛的篩選，表征和組合策略，本發(fā)明人出人意料地觀察到，包含識別類似 表位的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽具有不同的交叉反應(yīng)性和調(diào)節(jié)活性。此外，本發(fā)明 提供包含兩個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多價多肽，與現(xiàn)有技術(shù)中描述的P2X7中 和分子相比，其顯示改善的調(diào)節(jié)P2X7活性的性質(zhì)。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，與其單價的 結(jié)合P2X7的結(jié)構(gòu)單元自身或現(xiàn)有技術(shù)單克隆抗體（mAb)L4的P2X7調(diào)節(jié)能力相比，包含兩 個結(jié)合P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的雙價多肽顯示P2X7-調(diào)節(jié)功效的顯著增加。此 夕卜，雙價的，雙特異性結(jié)合P2X7的結(jié)構(gòu)單元顯示改善的檢測靈敏度。為此，本發(fā)明此外 還提供很多高度有利的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合 P2X7和/或能夠顯著調(diào)節(jié)，抑制或中和P2X7。完全出乎意料，本發(fā)明人鑒定了P2X7受體 活性的激動劑。這些結(jié)合P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和包含所述免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域的多肽形成本發(fā)明的進一步的方面。
[0019] 此外，本發(fā)明的多肽呈現(xiàn)出體內(nèi)模型中炎癥的顯著降低。在實驗性腎炎的 嚙齒類動物模型中，我們明確證明了用P2X7拮抗劑對抗體-介導(dǎo)的腎小球性腎炎 (glomerulonephritis)的成功治療（參見實施例3)。
[0020] 如本文中進一步描述的，優(yōu)選本發(fā)明的氨基酸序列是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 ("ISV's"）。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是這樣的氨基酸序列，其：
[0021] -包含免疫球蛋白折疊或在合適條件下（諸如生理條件下）能夠形成免疫球蛋白 折疊（即，通過折疊），即，從而形成免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域（諸如，例如，VH，VL或VHH 結(jié)構(gòu)域）；和
[0022] -形成（或在此種合適條件下能夠形成）包含功能性抗原結(jié)合活性的免疫球蛋 白可變結(jié)構(gòu)域（在這個意義上，其不需要與另一個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域相互作用（諸如 VH-VL相互作用）以形成功能性抗原結(jié)合位點）。
[0023] 作為ISV's的本發(fā)明的氨基酸序列在本文中也被稱為"本發(fā)明的ISV's"。從本 文中的進一步描述，適用于本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的一些優(yōu)選的實例將變得清 楚的，并且例如包括VHH's和/或（其它）納米抗體（優(yōu)選的），諸如人源化VHH's或駱駝 源化（camelized)VH's,諸如駱蛇源化人VH，dAb's和（單）結(jié)構(gòu)域抗體。
[0024] 因此，本發(fā)明的ISV，多肽和組合物可以用于診斷，預(yù)防和治療本發(fā)明的疾病和 病癥（在本文中也為"本發(fā)明的疾病和病癥"）并且包括，但不限于以下疾病，諸如炎性腸 病（imflammatoryboweldisease) (IBD)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis)，骨 關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis),癌癥，糖尿?。╠iabetes),腎炎（nephritis),神經(jīng)病性疼痛 (neuropathicpain),癲癇（epilepsy),神經(jīng)變性疾病諸如AD和HD,MS和心血管疾病，包 括卒中（stroke)和高血壓（hypertension),局部缺血（ischemia),以及本文中描述的其 它病癥和疾病。尤其是，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于診斷，預(yù)防和治療疾病，所述疾 病包括P2X7介導(dǎo)的病癥，包括凋亡。
[0025] 通常，所述"本發(fā)明的疾病和病癥"可以被定義為可以通過向需要其的受試者 (即，具有疾病或病癥或其至少一種癥狀和/或處于引起或發(fā)展疾病或病癥的風(fēng)險）適當(dāng) 施用本發(fā)明的多肽或組合物（并且尤其是其藥學(xué)活性量）和/或針對P2X7并且尤其是人 P2X7(SEQIDN0:l-3)及其同種型或P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型 參與的生物學(xué)通路或機制起作用的已知活性物質(zhì)（并且尤其是其藥學(xué)活性量）分別診斷， 預(yù)防和/或治療的疾病和病癥。
[0026] 尤其是，本發(fā)明的ISVs和多肽可以用于診斷，預(yù)防和治療本發(fā)明的疾病和病癥， 所述疾病和病癥的特征為由ATP門控（gating)介導(dǎo)的過多的和/或不需要的P2X7(并且 尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型）。基于本文中所公開的，本發(fā)明的此種疾病 和病癥的實例對于技術(shù)人員同樣是清楚的。
[0027] 因此，不限于此，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以例如用于診斷， 預(yù)防和/或治療目前以可以調(diào)節(jié)P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型-介 導(dǎo)的門控的活性物質(zhì)被診斷，預(yù)防或治療的所有疾病和病癥，諸如上文中在疾病中提及的 那些和引用的現(xiàn)有技術(shù)。還設(shè)想，本發(fā)明的多肽可以用于診斷，預(yù)防和/或治療以此種活 性物質(zhì)的治療目前正在被開發(fā)，已經(jīng)被建議，或未來將被建議或開發(fā)所針對的所有疾病和 病癥。此外，設(shè)想由于如本文中進一步描述的其有利性質(zhì)，本發(fā)明的多肽可以用于診斷， 預(yù)防和治療這些已知活性物質(zhì)正在用于或?qū)⒈唤ㄗh或開發(fā)所針對的其它疾病和病癥；和/ 或設(shè)想本發(fā)明的多肽可以提供治療本文中描述的疾病和病癥的新方法和方案。
[0028] 從本文中的進一步公開，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽的其它應(yīng)用和 用途對于熟練技術(shù)人員將變得清楚的。
[0029] 通常，本發(fā)明的一個目的是提供可以用于診斷，預(yù)防和/或治療本發(fā)明的疾病和 /或病癥的藥學(xué)活性劑，以及包含所述藥學(xué)活性劑的組合物；和提供診斷，預(yù)防和/或治 療此種疾病和病癥的方法，所述方法包括施用和/或使用此種藥劑和組合物。
[0030] 尤其是，本發(fā)明的目的是提供這樣的藥學(xué)活性劑，組合物和/或方法，所述藥學(xué) 活性劑，組合物和/或方法與目前使用的和/或本領(lǐng)域已知的藥劑，組合物和/或方法相 比，具有某些優(yōu)點。從下文的進一步描述，這些優(yōu)點將變得清楚。
[0031] 更特別的是，本發(fā)明的目的是提供治療性蛋白，所述蛋白可以用作藥學(xué)活性劑， 以及包含所述藥學(xué)活性劑的組合物，其用于診斷，預(yù)防和/或治療本發(fā)明的疾病和/或病 癥和本文中提到的進一步的疾病和病癥；并且提供診斷，預(yù)防和/或治療此種疾病和病癥 的方法，所述方法包括施用和/或使用此種治療性蛋白和組合物。
[0032] 因此，本發(fā)明的特定目的是提供免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域針對P2X7,尤其是針對來自溫血動物的P2X7,更特別是針對來自哺乳動物諸如例 如，小鼠的P2X7,并且特別是針對人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型（isoform);并且 提供蛋白和多肽，所述蛋白和多肽包含至少一個此種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由 至少一個此種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成。
[0033] 尤其是，本發(fā)明的特定目的是提供這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和這樣的蛋 白和/或多肽，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和蛋白和/或多肽適于溫血動物，并且尤其 是哺乳動物，并且更特別是人類中的預(yù)防，治療和/或診斷用途。
[0034] 更特別是，本發(fā)明的特定目的是提供這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和這樣的 蛋白和/或多肽，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和蛋白和/或多肽可以用于預(yù)防，治療， 緩解和/或診斷溫血動物，尤其是哺乳動物，并且更特別是人類中一種或多種與P2X7相 關(guān)和/或由P2X7介導(dǎo)的疾病，病癥或病狀（諸如本文中提及的疾病，病癥和病狀）。
[0035] 另外，本發(fā)明的特定目的是提供這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和這樣的蛋白和 /或多肽，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和蛋白和/或多肽可以用于制備預(yù)防和/或治療溫 血動物，尤其是哺乳動物，并且更特別是人類中的一種或多種與P2X7相關(guān)和/或由P2X7 介導(dǎo)的疾病，病癥或病狀（諸如本文中提及的疾病，病癥和病狀）的藥物或獸藥組合物。
[0036] 在本發(fā)明中，通常，這些目的通過使用本文中描述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 蛋白，多肽和組合物實現(xiàn)。
[0037] 通常，本發(fā)明提供針對（如本文中定義的）和/或可以特異結(jié)合（如本文中定義 的）P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；以 及包含至少一個此種氨基酸序列或免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的化合物和構(gòu)建體，并且尤 其是蛋白和多肽。
[0038] 更特別是，本發(fā)明提供免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽，所述免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域和多肽能夠以親和力（適當(dāng)測量和/或表達為KD_值（實際的或表觀的），KA_值（實 際的或表觀的），km-速率和/或kf-速率結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO: 1-3) 或其同種型，以及提供化合物和構(gòu)建體，并且尤其是蛋白和多肽，所述化合物和構(gòu)建體， 并且尤其是蛋白和多肽包含至少一個此種氨基酸序列或免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
[0039] 同樣，能夠結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:1-3)或其同種型的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽能夠以生物效力表征，所述生物效力被適當(dāng)測量和/或表達為IC5Q 值，如在本文中進一步描述和定義的，例如，諸如通過Alphascreen1''測量和/或表達的； 以及化合物和構(gòu)建體，并且尤其是蛋白和多肽，所述化合物和構(gòu)建體，并且尤其是蛋白和 多肽包含至少一個此種氨基酸序列或免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
[0040] 在特別的方面，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽是這樣的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽，它們以Alphascreen測定中100nM或更低，諸如50nM或更低， 更優(yōu)選30nM或更低，甚至更優(yōu)選20nM或更低，最優(yōu)選10nM或更低，諸如5nM的IC50結(jié) 合人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型。
[0041] 將理解，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽對（人）P2X7的結(jié)合可以 導(dǎo)致本文中描述的抑制細(xì)胞外ATP對P2X7的活性或從（人）P2X7移去ATP。還將理解，本 發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽對（人）P2X7的結(jié)合可以導(dǎo)致抑制諸如本文中 描述的門控。
[0042] 可以根據(jù)涉及的特定疾病或病癥，使用本身已知的合適的任意體外測定，基于細(xì) 胞的測定，體內(nèi)測定和/或動物模型，或其任意組合，測試本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域和多肽，和包含所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽的組合物的功效。合適的測定和 動物模型對于熟練技術(shù)人員將清楚的，并且例如包括用于下文實驗部分和本文中引用的 現(xiàn)有技術(shù)的測定和動物模型。
[0043] 從本文中的進一步描述和實施例，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽對 P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的結(jié)合，替代或其它體內(nèi)和/或體 外效力的一些優(yōu)選的技術(shù)值將變得清楚的。
[0044] 為了結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:1-3)或其同種型，本發(fā)明的氨基 酸序列將通常在其氨基酸序列內(nèi)含有一個或多個氨基酸殘基或一個或多個氨基酸殘基片 段（即，各個"片段"包含彼此相鄰或彼此緊挨的兩個或多個氨基酸殘基，即，在氨基酸序 列的一級和三級結(jié)構(gòu)中），通過所述一個或多個氨基酸殘基或一個或多個氨基酸殘基片段， 本發(fā)明的氨基酸序列能夠結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型，所 述氨基酸殘基或氨基酸殘基片段從而形成結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3) 或其同種型的"位點"（在本文中也稱為"抗原結(jié)合位點"）。
[0045] 通常，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列（或包含所述氨基酸序列的化合物，構(gòu)建體或多 肽）要施用于受試者時（例如用于本文中描述的治療和/或診斷目的），優(yōu)選其為在所述 受試者中不天然存在的氨基酸序列；或，當(dāng)其在所述受試者中天然存在時，其為基本上分 離的形式（如本文中定義的）。
[0046] 對于熟練技術(shù)人員還將清楚的是，對于藥物用途，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域（以及包含所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的化合物，構(gòu)建體和多肽）優(yōu)選針對P2X7 并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型；然而對于獸藥目的，本發(fā)明的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽優(yōu)選針對來自要治療的物種的P2X7,或至少與來自要治療的物種 的P2X7交叉反應(yīng)。
[0047] 同樣，根據(jù)本發(fā)明，針對來自第一溫血動物物種的P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域和多肽可以顯示或可以不顯示與一個或多個其它溫血動物物種的P2X7的交叉反應(yīng) 性。例如，針對人P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以顯示或可以不顯示與來自一個或多個其它靈長類物種（諸如，不限 于，來自獼猴（Macaca)屬的猴（諸如，并且尤其是，食蟹猴（cynomolgusmonkeys)(Macaca fascicularis)和 / 或稱猴（rhesusmonkeys)(Macacamulatta))和沸沸（baboon)(Papio ursinus))的P2X7和/或與來自一個或多個常用于疾病動物模型的動物物種（例如小鼠， 大鼠，兔，豬或狗），和尤其是用于與P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種 型相關(guān)的疾病和病癥的動物模型（諸如本文中提到的物種和動物模型）的動物物種的P2X7 的交叉反應(yīng)性。在這方面，對于熟練技術(shù)人員將清楚的是，此種交叉反應(yīng)性，當(dāng)存在時， 從藥物開發(fā)觀點的角度可以具有優(yōu)勢，因為其允許針對P2X7并且尤其是人P2X7(SEQID NO:1-3)或其同種型的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽在此種疾病模型中被測試。
[0048] 更通常地，與來自多種哺乳動物物種的P2X7交叉反應(yīng)的本發(fā)明的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域和多肽通常將在獸藥應(yīng)用的用途中是有利的，因為它將允許相同氨基酸序列 或多肽跨多個物種被使用。因此，還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是針對來自一個動物物種的 P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽（諸如針對人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽）可以用于治療另一個動物物種，只要免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域和/或多肽的使用在要治療的物種中提供所需效果。
[0049] 本發(fā)明在其最廣泛的意義中，同樣不特別限制于或受限于本發(fā)明的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域和多肽所針對的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的特定 抗原決定簇，表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞單位或構(gòu)象（在適用的情況下）。例如，所述免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以針對或可以不針對ATP/P2X7相互作用位點，并且如本文 中進一步定義的。
[0050] 如本文中進一步描述的，本發(fā)明的多肽可以含有兩個或多個本發(fā)明的針對P2X7 并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。通常，此種 多肽將以與本發(fā)明的單個氨基酸序列相比增加的親合力（avidity)結(jié)合P2X7并且尤其是 人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型。此種多肽可以例如包含兩個本發(fā)明的針對P2X7并且 尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的相同抗原決定簇，表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞 單位或構(gòu)象（在適用的情況下）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（其可以是或可以不是相互作 用位點）；或包含至少一個本發(fā)明的針對P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同 種型的第一抗原決定簇，表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞單位或構(gòu)象（在適用的情況下）的"第 一"氨基酸序列（其可以是或可以不是相互作用位點）；和至少一個本發(fā)明的針對不同于第 一個的第二抗原決定簇，表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞單位或構(gòu)象（在適用的情況下）的"第 二"氨基酸序列（并且其同樣可以是或可以不是相互作用位點）。優(yōu)選地，在本發(fā)明的此種 "雙互補位（biparatopic)"多肽中，至少一個本發(fā)明的氨基酸序列針對相互作用位點（如 本文中定義的），盡管本發(fā)明在其最廣的意義上不限于此。例如，本發(fā)明的多肽可以例如 以雙互補位的方式配制以諸如將針對如在實驗部分表征的不同表位的單價結(jié)構(gòu)單元組合。
[0051] 同樣，當(dāng)所述靶點是結(jié)合對（例如，受體_配體結(jié)合對）的部分時，所述免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以是這樣的，它們與同源的結(jié)合伙伴（例如用于結(jié)合P2X7的 ATP)競爭，和/或是這樣的，它們（完全或部分）中和結(jié)合伙伴對靶點的結(jié)合。
[0052] 還預(yù)期的是，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽將通常結(jié)合P2X7并且尤 其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的所有天然存在的或合成的類似物，變體，突變 體，等位基因，部分和片段；或至少結(jié)合含有一個或多個與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域和多肽結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的抗原決定簇或表 位基本上相同的抗原決定簇或表位的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種 型的那些類似物，變體，突變體，等位基因，部分和片段。同樣，在此種情況下，本發(fā)明 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽能夠以與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合（野 生型）P2X7的親和力和特異性相同或不同（即高于或低于）的親和力和/或特異性結(jié)合此 種類似物，變體，突變體，等位基因，部分和片段。
[0053] 因為P2X7受體可能以多聚體形式，例如，三聚體，并特別是同源三聚體形式行 使功能，因此在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽i)僅結(jié)合單 體形式的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型，ii)僅結(jié)合多聚體/三聚 體形式的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型，或iii)既結(jié)合單體形式 又結(jié)合多聚體形式。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽阻止（同源）三聚體人P2X7復(fù) 合體的形成。
[0054]同樣，如對于熟練技術(shù)人員將清楚的，含有兩個或多個針對P2X7并且尤其是人 P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽，例如，本發(fā) 明的"雙互補位"多肽，能夠以比相應(yīng)單體氨基酸序列更高的親合力結(jié)合P2X7并且尤其是 人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型。例如，并且無限制，含有兩個或多個針對P2X7并 且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的不同表位的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的 蛋白或多肽可以（并且通常將）比各個不同單體更高的親合力結(jié)合，并且含有兩個或多個 針對P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的 蛋白或多肽可以（并且通常將）也以更高親合力結(jié)合P2X7的多聚體（例如，（同源）三聚 體）并且尤其是結(jié)合人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型的多聚體（例如，（同源）三聚 體）。
[0055] 通常，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽將至少結(jié)合P2X7并且尤其是人 P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的從生物學(xué)和/或治療觀點的角度最相關(guān)的那些形式 (包括單體的，多聚體的，相關(guān)的或不同的構(gòu)型），如對于熟練技術(shù)人員將清楚的。
[0056] 還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，使用本發(fā)明免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽的部分，片 段，類似物，突變體，變體，等位基因和/或衍生物，和/或使用包含一個或多個此種部 分，片段，類似物，突變體，變體，等位基因和/或衍生物或基本上由一個或多個此種部 分，片段，類似物，突變體，變體，等位基因和/或衍生物組成的蛋白或多肽，只要這些 適于本文中設(shè)想的用途。此種部分，片段，類似物，突變體，變體，等位基因和/或衍生 物將通常含有用于結(jié)合針對P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNO:l-3)或其同種型的（至 少部分）功能性抗原結(jié)合位點；并且更優(yōu)選地將能夠特異結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ IDNO:1-3)或其同種型，并且甚至更優(yōu)選能夠以如本文中定義的（例如，在實驗部分） 與如本文中進一步描述的結(jié)合，門控（gating),脫落（shedding)和/或其它測量相關(guān)的 EC50值，平均值結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)或其同種型，并 且此種部分，片段，類似物，突變體，變體，等位基因和/或衍生物可以更具效力，更穩(wěn) 定，更可溶并且可以具有相同表位。從本文中進一步描述，此種部分，片段，類似物，突 變體，變體，等位基因，衍生物，蛋白和/或多肽的一些非限制實例將變得清楚的。本發(fā) 明的另外的片段或多肽還可以通過適當(dāng)組合（即，通過連接或基因融合）一個或多個（更 小的）本文中描述的部分或片段提供。
[0057] 本發(fā)明優(yōu)選的多互補位（multiparatopic)(諸如雙互補位）多肽包含兩個或多個 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中，在 至少一個所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中，所述⑶R序列與至少一個具有SEQIDNO's: 6-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R序列具有至少70%氨基酸同一性，優(yōu)選地至少 80%氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%氨基酸同一性，諸如95%氨基酸同一性或更多，或 甚至基本上100%氨基酸同一性（表B-3)。
[0058] 在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多互補位（諸如雙互補位）多肽包含兩個或多個免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中至少一個 所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷P2X7對至少一個具有SEQIDNO's:6-19的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和/或?qū)2X7的結(jié)合被至少一個具有SEQIDNO's:6-19的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
[0059] 在本發(fā)明優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多互補位（諸如雙互補位）多肽包含兩個或多個 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中第 一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNO's:6-19并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選 自SEQIDNO's:6-19,其中所述第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和第二免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域可以相同或不同。
[0060] 在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多互補位（諸如雙互補位）多肽的兩個或多個針對P2X7 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域各自屬于不同的表位箱（bin)或家族。因此，本發(fā)明涉及包含 兩個或多個針對P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩個或多個針對P2X7的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中所述兩個或多個針對P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域各自屬于不同表位箱。屬于不同表位箱的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選不彼此交叉競 爭結(jié)合靶點，P2X7。因此，本發(fā)明涉及包含兩個或多個針對P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域或基本上由兩個或多個針對P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中所述第 一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域不交叉阻斷P2X7對第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和/ 或其中所述第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)與P2X7的結(jié)合不被第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 交叉阻斷。
[0061] 優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽選自SEQIDNOs:118-124的任一個。
[0062] 本發(fā)明的多價的，諸如多互補位，多肽可以通常通過適當(dāng)連接（任選地通過合適 的接頭）或組合兩個或多個（單價）免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（或通過適當(dāng)連接或組合編 碼此種（單價）免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以提供編碼所需多價構(gòu)建體的核 酸，并隨后適當(dāng)表達所述多價構(gòu)建體）提供（并且尤其是，有目的地針對特定生物學(xué)作 用設(shè)計）。因此，顯然本發(fā)明不僅提供本文中描述的多價的，優(yōu)選多互補位多肽，而且提 供-通過提供本文中描述的單價多肽-給熟練技術(shù)人員一系列可以用作"結(jié)構(gòu)單元"的 不同"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)合單元"，從而通過使用本文中描述的合適的"結(jié)構(gòu)單元"提供一 系列不同的多價的，優(yōu)選多互補位（并且尤其是雙互補位）多肽（其可以具有不同結(jié)合親 和力，親合力（avidity),特異性，效力和/或功效）。
[0063] 本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以通過Fc-尾偶聯(lián)，如本領(lǐng)域中已知的，例 如，在實施例1. 3中詳述的。例如，可以將ISV的編碼序列與IgGl-Fc("Nb-Fc")的編碼序 列符合閱讀框地（inframe)融合，克隆入表達載體并表達（參見例如，Scheuplein等人 2010〃ArecombinantheavychainantibodyapproachblocksART2mediateddeletion ofaniNKTcellpopulationthatuponactivationinhibitsautoimmunediabetes〃J. Autoimmun34 :145-54)。可以將個體Nb-Fc's混合，形成同源二聚體和/或異源二聚體。 備選地，兩種Nb-Fc's-優(yōu)選地兩種不同Nb-Fc's-可以被克隆入一個表達載體并被表達。
[0064] 本發(fā)明的各種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或單價多肽（和/或編碼所述各種免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或單價多肽的核苷酸序列和/或核酸）及其作為在多價和/或 多互補位多肽（或編碼所述多價和/或多互補位多肽的核苷酸序列/核酸）的制備中或用 于制備多價和/或多互補位多肽（或編碼所述多價和/或多互補位多肽的核苷酸序列/核 酸）的"結(jié)構(gòu)單元"的用途形成本發(fā)明的一個方面。
[0065] 本發(fā)明的單價多肽可以基本上由選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，序列）和 重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，VH_序列）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明的單價 多肽可以基本上由選自源自常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和源自重鏈抗體的重鏈 可變結(jié)構(gòu)域序列的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明的單價多肽可以基本上由選自結(jié) 構(gòu)域抗體（或適于用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），單結(jié)構(gòu)域抗體（或適于用作單結(jié)構(gòu)域抗體 的氨基酸），"dAb"(或適于用作dAb的氨基酸）或納米抗體（包括但不限于Vhh)的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的單價多肽基本上由部分或完全人源化納 米抗體，諸如部分或完全人源化VHH組成。
[0066] 如上文描述的，本發(fā)明還涉及本文中描述的單價多肽在制備本發(fā)明多價的，優(yōu)選 多互補位多肽的用途。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單價多肽作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合單元在 制備本發(fā)明的多價多肽中的用途。
[0067] 本發(fā)明還涉及包含以下或基本上由以下組成的多肽（在本文中也稱為"本發(fā)明的 多肽"）：本發(fā)明的一個或多個單價多肽或一個或多個多價，優(yōu)選多互補位，多肽，并且任 選地還包含一個或多個任選地通過一個或多個肽接頭連接的其它基團，殘基，部分或結(jié)合 單元。如對于熟練技術(shù)人員從本文中進一步公開的內(nèi)容將變得清楚的，此種進一步的基 團，殘基，部分，結(jié)合單元或氨基酸序列可以不或可以向本發(fā)明的單價或多價，優(yōu)選多互 補位，多肽提供進一步的功能性并且可以改變或可以不改變本發(fā)明的單價或多價多肽的 性質(zhì)。
[0068] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸或核苷酸序列。此種核酸將也被稱為"本 發(fā)明的核酸"并且可以例如是基因構(gòu)建體形式，如本文中進一步描述的。因此，本發(fā)明還 涉及基因構(gòu)建體形式的核酸或核苷酸序列。
[0069] 可以將編碼本發(fā)明的單價多肽的核酸連接以獲得編碼本發(fā)明的多價，優(yōu)選多互 補位多肽的核酸。因此，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明單價多肽的核酸或核苷酸序列用于制備 編碼本發(fā)明的多價，優(yōu)選多互補位多肽的基因構(gòu)建體的用途。
[0070] 本發(fā)明還涉及宿主或宿主細(xì)胞，所述宿主或宿主細(xì)胞表達（或在合適的環(huán)境下能 夠表達）本發(fā)明的多肽；和/或含有本發(fā)明的核酸。從本文中進一步的說明，此種宿主或宿 主細(xì)胞的一些優(yōu)選的但非限制性實例將變得清楚的。
[0071] 本發(fā)明還涉及組合物，所述組合物含有或包含至少一種本發(fā)明的多肽和/或至少 一種本發(fā)明的核酸，和任選地本身已知的此種組合物的一個或多個進一步組分（即，根據(jù) 組合物的意欲用途）。此種組合物可以例如是藥物組合物（如本文中描述的）或獸藥組合 物。從本文中進一步的說明，此種組合物的一些優(yōu)選但非限制性實例將變得清楚的。
[0072] 本發(fā)明還涉及制備本文中描述的多肽，核酸，宿主細(xì)胞，和組合物的方法。
[0073] 尤其是，本發(fā)明涉及：
[0074] (I)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域能夠以小于50nM的 Kd結(jié)合P2X7,優(yōu)選人P2X7(SEQIDNO: 1-3)。
[0075] (II)根據(jù)（I)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);其中FR1至FR4是指構(gòu) 架區(qū)1至4并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)（FRs);并且
[0076] _其中⑶R1選自由以下組成的組：
[0077]-SEQIDNOs:34-47，
[0078]-與SEQIDNOs:34-47具有至少80%氨基酸同一性的多肽，和
[0079]-與SEQIDNOs:34_47具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；和
[0080] -其中⑶R2選自由以下組成的組：
[0081] -SEQIDNOs：62-75 ；
[0082] -與SEQIDNOs:62-75具有至少80%氨基酸同一性的多肽；和
[0083] -與SEQIDNOs:62-75具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；和
[0084] -其中⑶R3選自由以下組成的組：
[0085] -SEQIDNOs：9〇-103 ；
[0086] -與至少一個SEQIDNOs:90-103的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%氨基 酸同一性的多肽；和
[0087] -與SEQIDNOs:90-103具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽。
[0088] (III)根據(jù)（II)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述構(gòu)架區(qū)（FRs)與SEQ 10勵8:6-19的？1^具有大于80%的序列同一性。
[0089] (IV)根據(jù)（I)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域包含式1的氨基酸序列：
[0090] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);
[0091] 其中FR1至FR4是指構(gòu)架區(qū)1至4并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)；其 中CDR1 是SEQIDNO:34,其中CDR2 是SEQIDNO:62 ;并且其中CDR3 是SEQIDNO:90。
[0092] (V)根據(jù)權(quán)利要求（I)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域包含式1的氨基酸序列：
[0093] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);
[0094] 其中FR1至FR4是指構(gòu)架區(qū)1至4并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)；其 中CDR1 是SEQIDNO:35,其中CDR2 是SEQIDNO:63 ;并且其中CDR3 是SEQIDNO:91。
[0095] (VI)根據(jù)（I)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域包含式1的氨基酸序列：
[0096] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);
[0097] 其中FR1至FR4是指構(gòu)架區(qū)1至4并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)；其 中CDR1 是SEQIDNO:40,其中CDR2 是SEQIDNO:68 ;并且其中CDR3 是SEQIDNO:96。
[0098] (VII)多肽，所述多肽包含根據(jù)（I)-(VI)任一項的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
[0099] (VIII)根據(jù)（VII)所述的多肽，其中所述多肽選自由與SEQIDNOs:6_19具有 大于80%序列同一性的氨基酸序列的多肽組成的組。
[0100] (IX)根據(jù)（VII)或（VIII)所述的多肽，其中所述多肽選自由與SEQIDNOs:6-19 具有大于80%序列同一性的氨基酸序列的多肽組成的組。
[0101] (X)根據(jù)（VII)-(IX)任一項所述的多肽，所述多肽另外包含結(jié)合人血清白蛋白的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如例如，Alb8(SEQIDN0:126)或Albll(SEQIDN0:125)。
[0102] (XI)根據(jù)（I)-(VI)任一項所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或根據(jù)（VII)-(X)任 一項所述的多肽，其中Alphascreen測定中的IC50為30nM或更低。
[0103] (XII)根據(jù)（I)-(VI)任一項所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或根據(jù)（VII)-(X)任 一項所述的多肽，其中Alphascreen測定中IC50為3nM或更低。
[0104] (XIII)核酸序列，所述核酸序列編碼i)根據(jù)（I)-(VI)，（XI)，或（XII)任一項所 述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，或ii)根據(jù)（VII)-(X)任一項所述的多肽。
[0105] (XIV)藥物組合物，所述藥物組合物包含i)根據(jù)（I)-(VI)，（XI)，或（XII)任一項 所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，或ii)根據(jù)（VII)-(X)任一項所述的多肽；和任選地藥 用賦形劑。
[0106] (XV)根據(jù)（I)-(VI)，（XI)，或（XII)任一項所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，或 根據(jù)（VII)-(X)任一項所述的多肽，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽用于治療P2X7 相關(guān)疾病，包括但不限于MS,IBD,神經(jīng)病性疼痛（neuropathicpain),癲癇（epilepsy), 卒中（stroke),糖尿?。╠iabetes),高血壓（hypertension)和癌癥。
[0107] (XVI)生產(chǎn)根據(jù)（I)-(VI)，（XI)，或（XII)任一項所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，或根據(jù)（VII)-(X)任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟：
[0108] a)在合適的宿主細(xì)胞或宿主生物或在另一個合適的表達系統(tǒng)中表達根據(jù)（XIII) 的核酸或核苷酸序列；任選地接著：
[0109] b)分離和/或純化所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或所述多肽。
[0110] (XVII)篩選針對P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNOs:1-3)的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括至少以下步驟：
[0111] a)提供免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組（set)、集合（collection)或文庫；和
[0112] b)從所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組（set)、集合（collection)或文庫篩選能 夠結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDNOs: 1-3)和/或?qū)2X7并且尤其是人P2X7(SEQ IDNOs: 1-3)具有親和力的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；和
[0113] c)分離能夠結(jié)合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)和/或?qū)2X7并且 尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)具有親和力的氨基酸序列。
[0114] (XVIII)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域能夠以小于 50nM的Kd結(jié)合P2X7,其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯬2X7的結(jié)合抑制P2X7的 活性。
[0115] 從本文中的進一步描述，本發(fā)明的其它方面，實施方案，優(yōu)勢和應(yīng)用將變得清楚 的。貫穿本說明書文本始終，一些文件被引用。本文中引用的各個文件（包括所有專利， 專利申請，科學(xué)出版物，制造商說明書，使用說明等），不論在前或在后，在此通過引用 以其整體并入。本文中沒有任何之處將被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能通過先發(fā)明而早于這些公 開內(nèi)容。
[0116] 附圖簡述
[0117] 圖1.免疫方案和樣品制備并且對于美洲駝（llamas)405和418。
[0118] (A，B)免疫方案的原理圖和P2X7cDNA表達載體。以DNA-引發(fā)（prime)〉蛋白加 強03〇〇8〇策略（1(〇(*4〇1七6等人，2007 ?45￡8 1.21，3490 - 3498)免疫美洲駝。4次沖 擊式DNA免疫之后，用mP2X7和hP2X7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞和吸附在珠子上的重組mP2X7 加強免疫動物。將mP2X7和hP2X7的cDNA構(gòu)建體混合物吸附在1ym金顆粒上。美洲駝 接受12次注射，每次1ygDNA/mg金/免疫，以穩(wěn)定表達mP2X7 (2x107,用ImMATP預(yù)處 理15min)或hP2X7(3x107)的HEK細(xì)胞加強，和固定在AminoLink瓊脂糖珠子（Pierce) (5yg/50y1珠子）的HAN043和HAN044免疫沉淀的小鼠P2X7最后加強。從在免疫的各個 階段結(jié)束時收集的血樣產(chǎn)生噬菌體文庫（PBL1-6)。
[0119] (C)FACS分析用于以Alexa647-綴合的mAbsHAN044(抗-mP2X7) (M6ller等人 2007PurinergicSignallingDOI10. 1007/sll302-007-9084-9)和L4(抗-hP2X7)(Buell等人1998Blood, 92pp3521-3528)免疫的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞上的P2X7表達水平。以 相同抗體染色的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照（灰色直方圖）。
[0120] (D)珠子結(jié)合的用于免疫的重組mP2X7的SDS-PAGE分析（IP，泳道4)。使用固定 在瓊脂糖珠子（氨基-連接，Pierce)上的mAbHAN044 (基質(zhì)，泳道5,對照IP僅有珠子）， 從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有mP2X7的HEK細(xì)胞的裂解產(chǎn)物（裂解產(chǎn)物，泳道1)免疫沉淀mP2X7 (80kd， 紅色箭頭）。
[0121] 圖2.為P2X7結(jié)合選擇的Nbs的FACS分析。
[0122] 將來自第一次（A)和第二次（B)選擇的帶有Nbs的粗周質(zhì)裂解產(chǎn)物與FITC-綴合 的抗-myc抗體預(yù)孵育并且加入未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞和HEK_hP2X7細(xì)胞的混合物。清洗細(xì)胞 并且通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCalibur)收集數(shù)據(jù)。陽性克隆顯示雙峰染色（描繪來自wt細(xì) 胞的P2X7陽性細(xì)胞），而陰性克隆顯示單峰?；疑狈綀D顯示未染色對照細(xì)胞。
[0123] 圖3.抗-hP2X7Nbs的特異性的FACS分析。
[0124] 將HEK細(xì)胞用mP2X7,rP2X7,或hP2X7之一和GFP的表達構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h 后，通過溫和的胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞并與標(biāo)示在頂部的Nb-Fc融合蛋白或mAbL4孵育。 用Alexa647-綴合的抗-小鼠IgG檢測結(jié)合的抗體。用于對照，將未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞（wt) 進行相同的染色步驟。
[0125] 圖4?抗_hP2X7Nbs的交叉阻斷分析。
[0126] 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有hP2X7的5x105HEK細(xì)胞與3yg各個未綴合的抗體在95yl完 全DMEM中在室溫孵育15min。不清洗，將1y1 (?250ng)的AlexaFluor647-綴合的 Icll3-Fc，3c23-Fc或mAbL4加入并且在4°C繼續(xù)孵育20min。清洗細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù) (FACSCalibur，BD)分析。MFI，平均熒光強度。用于染色的Nb-Fc或mAb的Alexa647-綴 合物在圖下方標(biāo)示，用于阻斷的Nb-Fc和mAb在右上標(biāo)示。（載體=無阻斷Abs的培養(yǎng) 基）。
[0127] 圖5.hP2X7-特異的NbsIcll3-Fc和3c23-Fc的組合對原代白細(xì)胞上P2X7的改 善的染色。
[0128] (A)將來自單一供體的100y1血液等分試樣與各3yg的Icll3-Fc和3c23-Fc(〃 封閉的〃）的組合預(yù)孵育。將平行等分試樣僅與3yg的1067-Fc(〃未封閉的〃）孵育。在室溫 30-min的孵育后，加入綴合抗體的混合物（mastermix) :lcll3_FcAlexa647(?250ng); 3c23-FcAlexa647(?250ng);和抗-CD4PacificBlue。將細(xì)胞在冰上孵育 30min用于 抗體染色。通過用2mllxBD裂解液的lOmin室溫孵育將紅細(xì)胞裂解。將細(xì)胞用3ml完全 RPMI5%FCS清洗一次并通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCant〇II，BD)分析。基于低前向散射（low forwardscatter) (FSC)相對側(cè)向散射（SSC)(箭頭）將淋巴細(xì)胞門控。黑色數(shù)字表示細(xì)胞 在各自象限中的百分?jǐn)?shù)。左和右MFI值分別表示CD€和CD4 +淋巴細(xì)胞的平均熒光強度。
[0129] (B)來自三個不同供體的PBL的FACS分析如在（A)中，以另外的抗-⑶8Alexa488 染色mAb進行。粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，和淋巴細(xì)胞的門控基于所指出的FSC和SSC。⑶4+T細(xì) 胞，⑶8+T細(xì)胞和⑶47⑶8_淋巴細(xì)胞的門控基于⑶4和⑶8的細(xì)胞表面染色。P2X7的表達 以連鎖表示顯示。與未染色的阻斷和非阻斷Nb-Fc的預(yù)孵育分別由（+)和（-)在圖下方表 不〇
[0130] 圖6.Nbslc81和3c23阻斷轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞中ATP-誘導(dǎo)的CD62L的脫落。
[0131] (A)將HEK細(xì)胞僅用CD62L的cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，或用CD62L和hP2X7的構(gòu)建體共 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，收獲細(xì)胞并且通過將細(xì)胞與4mMATP在完全DMEM培養(yǎng)基中在37°C孵 育60min誘導(dǎo)⑶62L的脫落。
[0132] (B)在ATP劑量應(yīng)答測定中，將P2X7和⑶62L共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與0. 25, 1，2或4mM ATP在37°C孵育60min。將細(xì)胞等分試樣與2yg的Nb-Fc融合蛋白Ic81-Fc或3c23-Fc 或與對照Nb-Fc(抗-hCD38 1067-Fc)在室溫預(yù)孵育15min，之后與2mM或4mMATP孵育 60-min。將細(xì)胞用150y1的完全培養(yǎng)基清洗并在4°C染色30min以檢測⑶62L(MEL-14PE) 和P2X7(L4AF647)表達。進一步清洗后，通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCalibur，BD)分析細(xì)胞。
[0133] 圖7.Nbs3c23和lc81阻斷轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞中ATP-誘導(dǎo)的CD62L脫落。
[0134] 將HEK細(xì)胞與GFP，CD62L和hP2X7的cDNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h，收獲細(xì)胞 并與以1 :3稀釋梯級滴定的指出的Nbs在80y1DMEM培養(yǎng)基中于RT預(yù)孵育15min。最高 和最低Nb濃度為2.8yg/ml和4ng/ml。添加ATP至4mM的終濃度。將細(xì)胞在37°C孵育 60min并隨后在流式細(xì)胞術(shù)之前對⑶62L染色。在門控GFP+細(xì)胞之后計算⑶62L細(xì)胞表面 染色的平均熒光強度（MFI)。在半數(shù)最大⑶62LMFI(以紅色虛線標(biāo)記）計算IC5(I值（參 見表3)。
[0135] 圖8.納米抗體lc81和3c23阻止由RPMI8226細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲 氨酸外化（externalization)。
[0136] (A)通過如圖5中以Alexa647-綴合的Icll3-Fc和3c23-Fc的混合物染色2xl05 細(xì)胞檢測RPMI8226細(xì)胞上P2X7表達?；疑狈綀D=與過量未綴合Icll3-Fc和3c23-Fc 預(yù)孵育的細(xì)胞，空心直方圖=與過量對照1067-Fc預(yù)孵育的細(xì)胞。
[0137] (B)將細(xì)胞與所示濃度的ATP在37°C孵育60min，之后用APC-綴合的膜聯(lián)蛋白V 對PS染色。
[0138] (C) ?將RPMI8226 細(xì)胞與0.5yg的 1067-Fc,Icll3-Fc,Ic81-Fc，3c23-Fc或mAb L4在室溫預(yù)孵育15min，之后加入ATP至0 (對照）或4mM的終濃度。進一步將細(xì)胞在37°C 孵育60min并用膜聯(lián)蛋白V染色緩沖液清洗一次，之后用APC-綴合的膜聯(lián)蛋白V染色。通 過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCantoII，BD)分析細(xì)胞。
[0139] 圖9.Nbslc81和3c23阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
[0140] 將RPMI8226細(xì)胞（150y1培養(yǎng)基中的5x10s個細(xì)胞）與900ng的各個Fc融合蛋 白或mAbL4在室溫預(yù)孵育lOmin。加入150y1ATP的4mM儲液至ATP終濃度為2mM(l:2 稀釋）和抗體終濃度為3yg/ml。將細(xì)胞在37°C孵育60min或24h，在膜聯(lián)蛋白V染色緩 沖液中清洗一次并以APC-綴合的膜聯(lián)蛋白V對磷脂酰絲氨酸進行暴露染色和以碘化丙錠 對細(xì)胞死亡染色。通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCantoII，BD)進行數(shù)據(jù)收集。
[0141] 圖10.Nbslc81和3c23阻斷由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的PS外化和CD62L脫 落。
[0142] 將來自3個供體的lOOyl全血等分試樣與0.5yg的 1067-Fc,Icll3-Fc,Ic81-Fc, 3c23-Fc或 1yg的mAbL4 在RT預(yù)孵育 30-min,之后加入 100yl培養(yǎng)基（未處理的對照）或完全培養(yǎng)基中的8mMATP儲液。將細(xì)胞在37°C孵育 30min，用膜聯(lián)蛋白V染色緩沖液清洗一次，并用抗-⑶62LFITC，膜聯(lián)蛋白V-APC，抗-⑶4 APC/Cy7,和抗-CD8PacificBlue的混合物在RT染色60min。通過在2mllxBD裂解液中 的lOmin孵育裂解紅細(xì)胞。將細(xì)胞用1. 5ml膜聯(lián)蛋白V染色緩沖液清洗一次并通過流式細(xì) 胞術(shù)（FACSCantoII,BD)分析。如圖5中基于低FSC和SSC順序門控⑶4+和⑶8 +T細(xì)胞， 并對⑶4和⑶8染色。血樣來自與圖5中分析的那些相同的供體。
[0143] 圖11.由全身注射的HLE-Nbs導(dǎo)致的P2X7體內(nèi)阻斷/增強的動力學(xué)分析
[0144] (A)在靜脈內(nèi)注射半衰期延長的Nbs(對P2X7和白蛋白雙特異性的）13A7-13A7-A lb8 (20yg)，14D5-14D5-Alb8 (100yg)，或?qū)φ誑b(100yg)之后 2h和 24h制備脾細(xì)胞和 肝細(xì)胞。將細(xì)胞用針對⑶3,⑶4,⑶25,和NK1.1的抗體共染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。以 Flowjo軟件計算Tregs(CD4+細(xì)胞的百分比）和iNKT細(xì)胞（CD3+細(xì)胞的百分比）的頻率。 **P〈0. 01，***P〈0. 001 (雙尾Student'st-檢驗）。
[0145] (B)通過用抗-⑶27共染色接著用25yMNAD+，或溶劑（sol)在活體外處理細(xì)胞， 監(jiān)測⑶27的脫落（脾：對⑶4+細(xì)胞門控；肝：對⑶3+細(xì)胞門控）。
[0146] (C)在注射半衰期延長的Nbs13A7-13A7-Alb8, 8G11-8G11-Alb8,或?qū)φ?Nb(200yg靜脈注射）之后2h制備細(xì)胞并如在（a，b)中染色。與膜聯(lián)蛋白V共染色接著用 250yMATP，25yMNAD+，或溶劑（sol)在活體外處理細(xì)胞，監(jiān)測磷脂酰絲氨酸的外化（脾： 對CD4+細(xì)胞門控；肝：對CD3+細(xì)胞門控）。
[0147] 圖12.全身施用Nb13A7緩解，施用Nb14D5加強抗體-誘導(dǎo)的腎小球性腎炎 (glomerulonephritis)中的疾病參數(shù)。
[0148] 抗體-誘導(dǎo)的腎炎模型中治療的時間過程。將6周齡C57BL6小鼠組（n= 6)靜 脈注射以半衰期延長的Nbs13A7-13A7-Alb8, 14D5-14D5-Alb8,或?qū)φ誑b(50yg) 2h，之后 注射抗-足細(xì)胞（AP)或免疫前（PI)血清。小鼠每3天接受另外的Nbs注射（25yg)。最 后一次Nb注射后三天，處死小鼠并且將腎和血清進行進一步分析。
[0149] (A)尿中的白蛋白通過ELISA定量，肌酸酐水平通過自動測量確定。
[0150] (B)處死當(dāng)天，血液尿素氮，血清甘油三酯和血清膽固醇水平通過自動測量確定； 血清中的IL-6和尿中MCP-1由ELISA定量。以MannWhitneyU檢驗評價顯著性。
[0151] (C)將脾細(xì)胞在缺少（PBS)或存在NAD+的情況下孵育30min并隨后對⑶4,⑶25， 和CD27染色，之后FACS分析。對CD4+CD25+Tregs進行門控。用P2X7激動性Nb14D5處理 的小鼠的Tregs含有更低比例的⑶27+T細(xì)胞，其所有都對NAD+-誘導(dǎo)的⑶27損失敏感； 來自用P2X7拮抗性Nb13A7處理的小鼠的Tregs抵抗NAD+-誘導(dǎo)的CD27脫落。
[0152] (D)將腎切片用PAS染色（頂部）。腎小管蛋白管型由星號標(biāo)出。
[0153] (E)將腎切片用DNA-染色染料draq5 (針對T細(xì)胞標(biāo)志物⑶3的熒光染料-綴合 的mAb)，和針對nephrin(在腎臟濾過屏障處的足細(xì)胞膜蛋白）的熒光染料-綴合的mAb 染色（底部）。足細(xì)胞核由星號標(biāo)出。與用Nb13A7或?qū)φ誑b處理的小鼠相比，來自用Nb 14D5處理的小鼠的腎切片顯示⑶3+T細(xì)胞更強的球旁浸潤和對n印hrin的擾亂的染色。
[0154] (F)在免疫熒光顯微術(shù)之前，將腎切片用draq5和針對n印hrin的熒光染料綴合 的mAbs，補體因子3(C3)，和IgG染色。來自用AP血清處理的小鼠（但不來自用PI血清 處理的小鼠）的切片顯示IgG和3的腎小球沉積。IgG沉積的模式在用Nb13A7處理的小 鼠中有規(guī)律，但在用對照Nb處理的小鼠中被部分打亂并且在用Nb14D5處理的小鼠中被 強烈打亂。
[0155] 圖13.Nbs13A7和14D5的Nb-Fc融合蛋白檢測來自淋巴節(jié)，脾和肝的淋巴細(xì)胞 上的P2X7
[0156] 將來自野生型和P2X7-/-小鼠的淋巴節(jié)，脾或肝的淋巴細(xì)胞與熒光染料-綴合 的小鼠P2X7-特異的13A7-Fc，14D5-FC或人P2X7-特異的3c23-Fc(陰性對照）和與針對 ⑶4,⑶25,和NK1. 1的抗體共染色，之后進行流式細(xì)胞術(shù)。
[0157] 圖14.Nb3c23阻止人RPMI8226淋巴瘤細(xì)胞中ATP-誘導(dǎo)的鈣流入
[0158] 將RPMI8226細(xì)胞加載以Ca2+指示劑Fluo-4。進行實時流式細(xì)胞術(shù)分析（BD FACSCanto)。在存在（溶劑）或缺少人P2X7-特異的Nb3c23-3c23或小鼠P2X7-特 異的Nb13A7-13A7(陰性對照）的情況下將細(xì)胞清洗并重懸于補充有Ca2+和Mg2+的 PBS(Invitrogen)并通過流式細(xì)胞術(shù)（BDFACS-Canto)分析。紅外線燈用于維持37°C的恒 定樣品溫度。平衡lOOsec之后，加入ATP至終濃度為2mM并持續(xù)孵育lOOsec，之后加入離 子霉素至終濃度為5yM。
[0159] 圖15.Nb3c23阻斷ATP-誘導(dǎo)的IL-1 0從人血細(xì)胞的釋放。
[0160] 在缺少或存在Nb3c23-3c23的情況下將來自四個供體的肝素化全血等分試樣與 LPS(1yg/ml)孵育2h，之后加入ATP至終濃度為5mM并進一步在37°C孵育lh。通過離心 樣品制備血漿并且血漿中IL-10水平由ELISA(R&DSystems)確定。*#P〈0. 001 (單因素 AN0VA)〇
[0161] 圖16.Nb3c23阻斷ATP-誘導(dǎo)的IL-1 0從人血細(xì)胞的釋放的劑量應(yīng)答分析。
[0162] 在缺少或存在所示濃度的Nb3c23, 3c23-3c23,和3c23Fc的情況下將肝素化全血 等分試樣與LPS(1yg/ml)孵育2h，之后加入ATP至終濃度為2mM并且在37°C進一步孵育 lh。通過離心細(xì)胞制備血漿并且通過ELISA(R&DSystems)確定血漿中IL-10水平。小鼠 P2X7-特異的Nb13A7用作陰性對照。
[0163] 圖17.Nb13A7阻斷，Nb14D5加強穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有小鼠P2X7的HEK細(xì)胞中ATP-誘導(dǎo) 的鈣流入
[0164] 加載有Ca2+指示劑Fluo-4的小鼠-P2X7轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞在以1yg/mlNb的濃度 存在小鼠P2X7-特異的Nb14D5-14D5，Nb13A7-13A7 或人P2X7-特異的Nb3c23-3c23(陰 性對照）的情況下進行實時流式細(xì)胞術(shù)分析。平衡60sec之后，將細(xì)胞暴露于細(xì)胞外ATP 至終濃度為250yM或ImM并且，兩分鐘之后，暴露于5yM濃度的Ca2+離子載體離子霉 素。紅外線燈用于維持37°C的恒定樣品溫度。
[0165] 圖18.Nb13A7反轉(zhuǎn)，Nb14D5誘導(dǎo)和加強穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有小鼠P2X7的HEK細(xì)胞中 ATP-介導(dǎo)的鈣流入
[0166] 加載有Ca2+指示劑Fluo-4的小鼠-P2X7轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的實時流式細(xì)胞術(shù)分 析。平衡6〇sec之后，將細(xì)胞與所示濃度的ATP孵育兩分鐘，之后用小鼠P2X7-特異的Nb 14D5-14D5，Nb13A7-13A7 或人P2X7-特異的Nb3c23-3c23 處理至終濃度為 2yg/mlNb。 紅外線燈用于維持37°C的恒定樣品溫度.
[0167] 圖19.Nb13A7阻斷，Nb14D5加強小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中ATP-誘導(dǎo)的鈣流入
[0168] 將小鼠腹膜巨噬細(xì)胞加載以Ca2+指示劑Fluo-4。進行實時流式細(xì)胞術(shù)分析（BD FACSCanto)。清洗細(xì)胞并在缺少（溶劑）或存在P2X7-加強Nb14D5或P2X7-拮抗性Nb 13A7(1yg/500y1)的情況下重懸于補充以Ca2+和Mg2+的PBS(Invitrogen)。紅外線燈用 于維持37°C的恒定樣品溫度。平衡12〇sec之后，將細(xì)胞暴露于所示濃度的細(xì)胞外ATP并 且兩分鐘之后暴露于Ca2+離子載體離子霉素至終濃度為1yM。
[0169] 圖20.Nb13A7阻斷，Nb14D5加強由腹膜巨噬細(xì)胞對IL-1 0的加工和分泌
[0170] 將來自野生型或P2X7-/-小鼠的肝素化血在存在單價 Nbs(1yg/200y1) 14D5, 13A7,或溶劑的情況下與LPS(1yg/ml)孵育2h，之后加入ATP至 所示終濃度并在37°C進一步孵育30min。
[0171] a)離心樣品并通過ELISA(Biolegend)分析血衆(zhòng)中IL-113水平。
[0172] b)裂解紅細(xì)胞并且將血液白細(xì)胞以兩個步驟染色，第一步驟用對⑶11b，Ly_6C， 和Ly-6G特異的熒光染料-綴合的mAbs。隨后將細(xì)胞固定（2%PFA)并通透化（含有0. 3% 皂苷和 0? 1 %BSA的PBS)，之后進一步對前-IL-1 0 (pro-IL-1 0 )染色（e-Bioscience)。 進行流式細(xì)胞術(shù)分析（BDFACSCanto)并且對⑶llb+Ly-6Chi單核細(xì)胞進行門控。
[0173] 圖21.Nb13A7阻斷，Nbl4D5加強由Yac-1鼠淋巴瘤細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞外ATP或NAD+ 導(dǎo)致的⑶62L脫落
[0174] 通過流式細(xì)胞術(shù)接著在存在13A7 (a)，14D5 (b)，或?qū)φ誑b的情況下在37°C以ATP 或NAD+處理細(xì)胞20min，監(jiān)測小鼠Yac-1淋巴瘤細(xì)胞上⑶62L的細(xì)胞表面表達。使用的ATP 和NAD+濃度高于（a)和低于（b)在這些細(xì)胞中活化P2X7的閾值（分別為在（a)中100yM 和 20yM和在（b)中 30yM和 1. 5yM)。
[0175] 圖22.Nb13A7阻斷，Nbl4D5加強由原代小鼠T細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞外ATP或NAD+導(dǎo)致 的⑶62L脫落
[0176] 在存在14D5, 13A7,或?qū)φ誑b的情況下用200yMATP或50yMNAD+在37°C處理 20min的脾細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)分析，之后對CD3和CD62L染色。在溶劑（sol)中在4°C在 缺少ATP或NAD的情況下孵育對照細(xì)胞。
[0177] 發(fā)明詳述
[0178] 免疫球蛋白序列，諸如抗體和由此衍生的抗原結(jié)合片段（例如免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域）用于特異地靶向研宄和治療應(yīng)用中其各自的抗原。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域諸如例如，VHHs的產(chǎn)生可以包括免疫實驗動物諸如美洲駝，從免疫組織構(gòu)建噬菌體 文庫，選擇噬菌體展示抗原結(jié)合免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和篩選所述結(jié)構(gòu)域，并為了所 需特異性改造其構(gòu)建體（W0 94/04678)。備選地，類似的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域諸如 例如dAbs可以通過直接從天然或合成的文庫選擇噬菌體展示的抗原結(jié)合免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域和隨后篩選所述結(jié)構(gòu)域和為了所需的特異性改造其構(gòu)建體而產(chǎn)生（Ward等 人，Nature, 1989,341 :544-6;Holt等人，TrendsBiotechnol.，2003, 21(11) :484-490 ;以 及例如W0 06/030220,W0 06/003388和DomantisLtd.的其它公開的專利申請）。遺憾的 是，與其它策略相比，單克隆和/或大量改造的抗體的使用還帶有高的制造成本并且可以 導(dǎo)致欠佳的腫瘤穿透。
[0179] 本發(fā)明涉及特定多肽，也被稱為〃本發(fā)明的多肽〃或〃本發(fā)明的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域〃或〃本發(fā)明的ISV"，所述多肽包含以下或，更優(yōu)選，基本上由以下組成：（i)基 本上由一個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的第一結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域針對P2X7并且尤其是針對人P2X7 ; (ii)任選地基本上由免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 組成或包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的第二結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域針對P2X7并且尤其是針對人P2X7;和（iii)任選地包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基 本上由免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的第三結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域針對血清白蛋白并且尤其是針對人血清白蛋白（并且甚至更優(yōu)選其中所述免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域是Alb8或Albll(如本文中定義的））。此外，本發(fā)明還涉及編碼此種多肽 的核酸；制備此種多肽的方法；表達或能夠表達此種多肽的宿主細(xì)胞；包含此種多肽，核酸 和/或宿主細(xì)胞的組合物并且尤其是藥物組合物；和此種多肽，核酸，宿主細(xì)胞和/或組 合物用于預(yù)防，治療或診斷目的的用途。從本文中的進一步描述，本發(fā)明的其它方面，實 施方案，優(yōu)勢和應(yīng)用將變得清楚的。
[0180] 在此研宄中，開發(fā)各種抗-P2X7納米抗體并表征其在診斷和治療炎性疾?。ò?腎炎）中的可能。
[0181]
[0182] 除非另有說明或定義，使用的所有術(shù)語具有其在本領(lǐng)域中的通常意義，其對于 熟練技術(shù)人員將是清楚的。例如對標(biāo)準(zhǔn)手冊，諸如Sambrook等人（MolecularCloning:A LaboratoryManual(第2版）第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)，F(xiàn). Ausubel等人(Currentprotocolsinmolecularbiology,GreenPublishing和 WileyInterscience,NewYork, 1987),Lewin(GenesII,Johnffiley&Sons,NewYork,N. Y. , 1985),Old等人（PrinciplesofGeneManipulation：AnIntroductiontoGenetic Engineering(第 2 版)UniversityofCaliforniaPress,Berkeley,CA, 1981)；Roitt 等人（Immunology(第 6 版）Mosby/Elsevier,Edinburgh, 2〇01),Roitt等人（Roitt's EssentialImmunology(第 10 版）BlackwellPublishing,UK, 2001),和Janeway等人 (Immunobiology(第 6 版）GarlandSciencePublishing/Churchi11Livingstone,New York, 2005)，以及對一般【背景技術(shù)】的參考被引用在本文中。
[0183] 除非另有說明，未具體詳細(xì)描述的所有方法，步驟，技術(shù)和操作能夠以本身 已知的方式進行或已經(jīng)以本身已知的方式進行，如對于熟練技術(shù)人員將清楚的。例如 同樣對本文中提到標(biāo)準(zhǔn)手冊和一般【背景技術(shù)】及其中引用的進一步參考文獻；以及對例 如以下綜述進行參考：Presta(Adv.DrugDeliv.Rev. 58 (5-6) :640-56, 2006)，Levin和 Weiss(Mol.Biosyst. 2(1) :49_57,2006)，Irving等人（J.Immunol.Methods248(1-2): 31-45,2001)，Schmitz等人（Placenta21Suppl.A:S106_12,2000)，Gonzales等人 (TumourBiol. 26(1) :31-43, 2005)，其描述了蛋白質(zhì)工程技術(shù)，諸如親和力成熟和改善蛋 白諸如免疫球蛋白的特異性及其它所需性質(zhì)的其它技術(shù)。
[0184] 本文中使用的術(shù)語"序列"（例如以術(shù)語如"免疫球蛋白序列"，"抗體序列"，"可 變結(jié)構(gòu)域序列"，"Vhh序列"或"蛋白序列"），應(yīng)該通常被理解為包括相關(guān)氨基酸序列以及 編碼所述相關(guān)氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更有限的解釋。
[0185] 氨基酸殘基將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)三字母或單字母氨基酸密碼子表示。對W0 08/020079第 48頁的表A_2進彳丁參考。
[0186] 當(dāng)其從通常在所述來源或培養(yǎng)基中與其相關(guān)的至少一種其它組分，諸如另一種 核酸，另一種蛋白/多肽，另一種生物組分或大分子或至少一種污染物，雜質(zhì)或微量組 分被分離時，核酸或氨基酸被認(rèn)為是"（以）（基本上）分離的（形式）"_例如，與獲自其 的反應(yīng)媒介或培養(yǎng)基相比。尤其是，當(dāng)其被至少2-倍，尤其是至少10-倍，更特別是至 少100-倍，和高達1000-倍或更多倍純化時，核酸或氨基酸被認(rèn)為"（基本上）被分離"。 "（基本上）分離的形式"的核酸或氨基酸優(yōu)選基本上均質(zhì)的，如使用合適的技術(shù)，諸如合 適的色譜技術(shù)，諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的。
[0187] 當(dāng)核苷酸序列或氨基酸序列被表示分別"包含"另一條核苷酸序列或氨基酸序列， 或表示"基本上由"另一條核苷酸序列或氨基酸序列"組成"時，這可以意為后一核苷酸序 列或氨基酸序列分別被并入第一條提到的核苷酸序列或氨基酸序列，但更通常的是，這通 常意為所述第一條提到的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列內(nèi)分別包含核苷酸或氨基酸 殘基片段，所述核苷酸或氨基酸殘基片段分別具有與后一序列相同的核苷酸序列或氨基 酸序列，不論第一條提到的序列實際上怎樣被產(chǎn)生或獲得（其可以例如通過本文中描述的 任意合適的方法產(chǎn)生或獲得）。通過非限制性實例，當(dāng)本發(fā)明的多肽被表示包含免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域時，這可以意為所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列被并入本發(fā)明的多肽 序列，但更通常的是，這通常意為本發(fā)明的多肽在其序列內(nèi)含有免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 的序列，不論本發(fā)明的所述多肽被怎樣產(chǎn)生或獲得。同樣，當(dāng)核酸或核苷酸序列被表示包 含另一條核苷酸序列時，第一條提到的核酸或核苷酸序列優(yōu)選為這樣的序列，當(dāng)其表達為 表達產(chǎn)物（例如，多肽）時，由后一核苷酸序列編碼的氨基酸序列形成所述表達產(chǎn)物的部 分（換句話說，后一核苷酸序列與第一條提到的更大的核酸或核苷酸序列在相同的閱讀框 內(nèi)）。
[0188] 通過"基本上由…組成"意為用于本發(fā)明方法的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與本發(fā) 明的多肽完全相同或?qū)?yīng)于具有添加在所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基末端、羧基末 端、或氨基末端和羧基末端的有限數(shù)量的氨基酸殘基，諸如1-20個氨基酸殘基，例如1-10 個氨基酸殘基和優(yōu)選1-6個氨基酸殘基，諸如1，2, 3, 4, 5或6個氨基酸殘基的本發(fā)明的多 肽。
[0189] 為了比較兩條或多條核苷酸序列，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之間的"序 列同一性"百分比可以通過將[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相應(yīng)位置的核苷酸 相同的核苷酸數(shù)量]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸總數(shù)]并乘以[100% ]計算，其中 第二核苷酸序列中核苷酸的每個缺失、插入、置換或添加-與第一核苷酸序列相比較-被認(rèn) 為是在單個核苷酸（位置）的差異。備選地，兩條或多條核苷酸序列之間的序列同一性程 度可以使用已知的序列比對的計算機算法諸如NCBIBlastV2.0,使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置計算。用 于確定序列同一性程度的一些其它技術(shù)，計算機算法和設(shè)置例如描述在WO04/037999,EP 0967284，EP1085089，W0 00/55318，W0 00/78972，W0 98/49185 和GB2357768 中。通常， 為了根據(jù)上文中概述的計算方法確定兩條核苷酸序列之間的"序列同一性"百分比，將具 有最多數(shù)量核苷酸的核苷酸序列采用為"第一"核苷酸序列，并且另一條核苷酸序列將被 采用為"第二"核苷酸序列。
[0190] 為了比較兩條或多條氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的"序 列同一性"百分比（在本文中也稱為"氨基酸同一性"）可以通過將[第一氨基酸序列與第 二氨基酸序列中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量]除以[第一氨基酸序 列中的氨基酸殘基總數(shù)]并乘以[100%]計算，其中第二氨基酸序列中氨基酸殘基的每個 缺失，插入，置換或添加-與第一氨基酸序列相比-被認(rèn)為是在單個氨基酸殘基（位置） 處的差異，即為如本文中定義的"氨基酸差異"。備選地，兩條氨基酸序列之間序列同一性 的程度可以使用諸如上文提到的那些已知計算機算法計算用于確定核苷酸序列的序列同 一性程度，同樣適用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。通常，為了根據(jù)上文中概述的計算方法確定兩條氨基酸序 列之間的"序列同一性"百分比，具有最多氨基酸殘基數(shù)的氨基酸序列將被用作"第一"氨 基酸序列，并且另一氨基酸序列將被用作"第二"氨基酸序列。
[0191] 同樣，在確定兩條氨基酸序列間的序列同一性程度中，熟練技術(shù)人員可以考慮所 謂的"保守"氨基酸置換，其可以通常被描述為氨基酸置換，其中氨基酸殘基被類似化學(xué)結(jié) 構(gòu)的另一種氨基酸殘基替代并且，所述另一種氨基酸殘基對多肽的功能，活性或其它生物 學(xué)性質(zhì)具有很少或基本上不具有影響。此種保守氨基酸置換是本領(lǐng)域公知的，例如從 W〇 04/037999，GB335768，TO98/49185，TO00/46383 和TO01/09300;并且可以基于來自WO 04/037999以及WO98/49185的有關(guān)教導(dǎo)和來自其中引用的進一步參考文獻選擇此種置換 的（優(yōu)選的）類型和/或組合。
[0192] 此種保守置換優(yōu)選地是這樣的置換，其中以下組（a) - (e)中的一個氨基酸被相同 組內(nèi)的另一個氨基酸殘基置換：(a)小的脂肪族，非極性或微極性殘基：Ala,Ser，Thr，Pro 和Gly; (b)極性，帶負(fù)電的殘基及其（不帶電）酰胺：Asp,Asn,Glu和Gin; (c)極性，帶 正電的殘基：His,Arg和Lys; (d)大的脂肪族，非極性殘基：Met,Leu,lie,Val和Cys;和 (e)芳香族殘基：Phe，Tyr和Trp。特別優(yōu)選的保守置換如下：Ala置換為Gly或置換為Ser;Arg置換為Lys;Asn置換為Gin或置換為His;Asp置換為Glu;Cys置換為Ser;Gln置換為 Asn;Glu置換為Asp;Gly置換為Ala或置換為Pro;His置換為Asn或置換為Gin;Ile置換 為Leu或置換為Val;Leu置換為lie或置換為Val;Lys置換為Arg,置換為Gin或置換為 Glu;Met置換為Leu,置換為Tyr或置換為lie;Phe置換為Met,置換為Leu或置換為Tyr; Ser置換為Thr;Thr置換為Ser;Trp置換為Tyr;Tyr置換為Trp;和/或Phe置換為Val， 置換為lie或置換為Leu。
[0193] 用于本文中描述的多肽的任意氨基酸置換還可以基于不同物種的同源 蛋白之間的氨基酸變化頻率的分析（由Schulz等人（"PrinciplesofProtein Structure"，Springer-Verlag, 1978)開發(fā)），基于結(jié)構(gòu)形成潛力的分析（由Chou 和Fasman(Biochemistry13:211，1974 ;Adv.Enzymol. ,47:45-149, 1978)開發(fā)），和 基于蛋白的疏水模式的分析（由Eisenberg等人（Proc.Natl.AcadSci.USA81 : 140-144, 1984)，Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol. 157 :105-132, 1981)，和Goldman等人 (Ann.Rev.Biophys.Chem. 15 :321-353, 1986)開發(fā)），其所有都通過參考以其整體并入本 文。納米抗體的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)的信息在本文說明書中和上文引用的一般【背景技術(shù)】 給出。同樣，為此，來自美洲蛇的VHH結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)例如由Desmyter等人（Nature StructuralBiology, 3:803, 1996)，Spinelli等人（NaturalStructuralBiology, 3: 752-757, 1996)和Decanniere等人（Structure, 7(4) :361, 1999)給出。在常規(guī)VH結(jié)構(gòu)域 中形成VH/\界面和在這些位置可能的駱駝源化置換的一些氨基酸殘基的進一步信息可以 在上文引用的現(xiàn)有技術(shù)中找到。
[0194] 如果它們在其整個長度具有100%序列同一性（如本文中定義的），則氨基酸序列 和核酸序列被表示為"完全相同"；
[0195] 當(dāng)比較兩條氨基酸序列時，術(shù)語"氨基酸差異"是指與第二序列相比單個氨基酸 殘基在第一序列上的插入，缺失或置換；其被理解為兩條氨基酸序列可以含有一個，兩個 或多個此種氨基酸差異。更特別的，在本發(fā)明的氨基酸序列和/或多肽中，術(shù)語"氨基酸 差異"是指分別與a),d)或g)的CDR序列相比，c)，f)或i)中指定的CDR序列的位置上單 個氨基酸殘基的插入，缺失或置換；其被理解為分別與a)，d)或g)的CDR序列（在前）相 比，c)，f)和i)的⑶R序列可以含有一個，兩個或最大三個此種氨基酸差異。
[0196] 所述"氨基酸差異"可以是任意一個、兩個或最大三個置換，缺失或插入，或其任 意組合，其改善本發(fā)明多肽的性質(zhì)或至少不從所需性質(zhì)或從本發(fā)明多肽的所需性質(zhì)的平 衡或組合減損太多。在這方面，與包含一個或多個CDR序列而無一個、兩個或最大三個置 換，缺失或插入的多肽相比，產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽應(yīng)該至少以相同、不相上下、或更高的親 和力結(jié)合P2X7,所述親和力由表面等離振子共振測量。
[0197] 在這方面，根據(jù)c)，f)和/或i)的氨基酸序列可以是分別通過使用一個或多個 本身已知的親和力成熟技術(shù)（在前）的親和力成熟源自根據(jù)a),d)和/或g)的氨基酸序 列的氨基酸序列。
[0198] 例如，并且根據(jù)用于表達本發(fā)明多肽的宿主生物，此種缺失和/或置換能夠以此 種方式設(shè)計：一個或多個用于翻譯后修飾的位點（諸如一個或多個糖基化位點）被去除， 如將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。
[0199] 可以交替使用的術(shù)語〃表位〃和〃抗原決定簇〃是指大分子，諸如多肽或蛋白的 部分，所述部分可以被抗原結(jié)合分子，諸如本發(fā)明的免疫球蛋白，常規(guī)抗體，免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽識別，并且更特別地被所述分子的抗原結(jié)合位點結(jié)合。表位限定 用于免疫球蛋白的最小結(jié)合位點，并且因此代表免疫球蛋白的特異性的靶點。
[0200] 抗原結(jié)合分子（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白，常規(guī)抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 和/或多肽）識別所述表位的部分被稱為"互補位（paratope)"。
[0201] 可以〃結(jié)合〃或〃特異結(jié)合〃某表位，抗原或蛋白（或其至少一個部分，片段或 表位），對于某表位，抗原或蛋白（或其至少一個部分，片段或表位）"具有親和力"和/ 或"具有特異性"的多肽（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 多肽，或通?？乖Y(jié)合分子或其片段）被表示為"抗"或"針對"所述表位，抗原或蛋白 或就此種表位，抗原或蛋白而言是〃結(jié)合〃分子，或被表示為"抗表位，"抗抗原 或"抗蛋白（例如"抗"_P2X7)。
[0202] 術(shù)語"特異性"具有在W0 08/020079的第53-56頁上的第n)段中給出的意義；并 且如在其中提及的，指特定抗原結(jié)合分子或抗原結(jié)合蛋白（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域和/或多肽）分子能夠結(jié)合的抗原或抗原決定簇的不同類型數(shù)?？梢曰谟H和力 和/或親合力確定抗原結(jié)合蛋白的特異性，如在W0 08/020079的第53-56頁（通過引用并 入本文）中描述的，其還描述了用于測量抗原結(jié)合分子（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域和/或多肽）和相關(guān)抗原之間結(jié)合的一些優(yōu)選的技術(shù)。典型地，抗原結(jié)合蛋白（諸 如本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽）將以1〇_ 5至10 _12摩爾/升或更低，和 優(yōu)選1(T7至1(T12摩爾/升或更低并且更優(yōu)選1(T8至1(T12摩爾/升的解離常數(shù)（KD)(即， 以105至10 12升/摩爾或更高，和優(yōu)選10 7至10 12升/摩爾或更高和更優(yōu)選10 8至10 12升/ 摩爾的締合常數(shù)（Ka))結(jié)合其抗原。任何大于104mol/升的Kd值（或任何低于1〇H9Ka 值）升/mol通常被認(rèn)為表示非特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價多肽將以小于500nM， 優(yōu)選小于200nM,更優(yōu)選小于10nM,諸如例如10和5nM之間或更少的親和力結(jié)合所需抗 原。抗原結(jié)合蛋白對抗原或抗原決定簇的特異結(jié)合能夠以本身已知的任何合適方式確定， 包括，例如，Scatchard分析和/或競爭性結(jié)合測定，諸如放射性免疫測定（RIA)，酶免疫 測定（EIA)和夾心競爭測定，和本領(lǐng)域中本身已知的其不同變化；以及本文中提到的其它 技術(shù)。如對于熟練技術(shù)人員將清楚的，和如W0 08/020079第53-56頁中描述的，所述解離 常數(shù)可以是實際的或表觀的解離常數(shù)。確定解離常數(shù)的方法對于熟練技術(shù)人員將清楚的， 并且例如包括WO08/020079的53-56頁中提到的技術(shù)。
[0203] 當(dāng)其以比免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽結(jié)合第二靶點或抗原的親和力高 至少10倍，諸如至少100倍，和優(yōu)選至少1000倍，和高達10000倍或更好的親和力（如 上文描述的，并且適當(dāng)表達為KD值，KA值，K速率和/或K"速率）結(jié)合第一抗原時，所 述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽被表示為與第二靶點或抗原相比"特異于"第一靶 點或抗原。例如，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽能夠以比所述免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域和/或多肽結(jié)合第二靶點或抗原的KD至少10倍小，諸如至少100倍小，和優(yōu)選 至少1000倍小，諸如10. 000倍小或比那更小的KD值結(jié)合第一靶點或抗原。優(yōu)選地，當(dāng)與 第二靶點或抗原相比，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽"特異于"第一靶點或抗原時， 其針對（如本文中定義的）所述第一靶點或抗原，而不針對所述第二靶點或抗原。
[0204] 術(shù)語"（交叉）-阻斷（block) ""（交叉）-阻斷（blocked) ""（交叉）-阻斷 (blocking) "，"競爭結(jié)合"，"（交叉）-競爭（compete) "，"（交叉）-競爭（competing) " 和"（交叉）-競爭（competition)"在本文中交叉使用，意為免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑干擾其它免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，多肽或結(jié)合劑對給定靶點的結(jié)合的能力。免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，多肽或其它結(jié)合劑能夠干擾另一個對靶點的結(jié)合的程度，和因此其是否可以被表示為 根據(jù)本發(fā)明的交叉阻斷，可以使用競爭結(jié)合測定來確定。一個特別合適的定量交叉阻斷測 定使用Biacore儀器，其可以使用表面等離振子共振技術(shù)測量相互作用程度。另一種合適 的定量交叉阻斷測定使用基于ELISA的方法以測量免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑之間就其對靶點的結(jié)合而言的競爭。
[0205] 以下一般描述用于確定免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其 它結(jié)合劑是否交叉阻斷或是否能夠根據(jù)本發(fā)明交叉-阻斷的合適的Biacore測定。將理解 能夠以本文中描述的任意免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合 劑使用所述測定。Biacore儀器（例如Biacore3000)按照制造商的建議操作。因此在一 個交叉-阻斷測定中，使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)，將靶蛋白（例如，P2X7)偶聯(lián)于CM5Biacore 芯片產(chǎn)生用靶包被的表面。典型地200-800共振單位的靶將被偶聯(lián)于芯片（產(chǎn)生可容易測 量水平的結(jié)合但容易由使用的測試試劑的濃度導(dǎo)致飽和的量）。將要被評價其彼此交叉阻 斷的能力的兩種結(jié)合劑（被稱為A*和B*)以一比一的結(jié)合位點摩爾比在合適的緩沖液中 混合從而產(chǎn)生測試混合物。當(dāng)基于結(jié)合位點計算濃度時，結(jié)合劑的分子量被假定為結(jié)合劑 的總分子量除以在那個結(jié)合劑上的靶結(jié)合位點數(shù)量。測試混合物中各結(jié)合劑的濃度應(yīng)該足 夠高以容易地使Biacore芯片上捕獲的靶分子上對那個結(jié)合劑的結(jié)合位點飽和?；旌衔镏?的結(jié)合劑為相同的摩爾濃度（基于結(jié)合）并且該濃度將典型地在1. 〇〇和1. 5微摩之間（基 于結(jié)合位點）。還制備只含有A*和只含有的分開的溶液。這些溶液中的A*和應(yīng)該 在相同緩沖液中并且與測試混合物中濃度相同。將測試混合物通過靶包被的Biacore芯片 并記錄結(jié)合總量。隨后將芯片以此種方式處理：取出結(jié)合的結(jié)合劑而不損壞芯片結(jié)合的靶。 典型地，這通過以30mMHC1處理芯片60秒完成。隨后將僅A*的溶液通過靶包被的表面并 且記錄結(jié)合量。再次處理芯片以去除所有結(jié)合的結(jié)合劑而不損壞芯片結(jié)合的靶。隨后將單 獨B*溶液通過祀包被的表面并記錄結(jié)合量。接著計算A*和B*混合物的最大理論結(jié)合， 并且是各結(jié)合劑當(dāng)單獨通過靶表面時的結(jié)合的總和。如果實際記錄的混合物結(jié)合小于該理 論最大值，則兩種結(jié)合劑被表示為彼此交叉阻斷。因此，通常，根據(jù)本發(fā)明的交叉-阻斷 免疫球蛋白，抗體免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑是將在上述Biacore交叉 阻斷測定的測定過程中結(jié)合靶的那個并且在存在第二免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑的情況下，記錄的結(jié)合在最大理論結(jié)合的80%和0. 1%之間 (例如，80%至4%)，具體在最大理論結(jié)合的75%和0.1 %之間（例如，75%至4%)，并 且更具體在組合中兩種免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或結(jié)合劑的最 大理論結(jié)合（正如上文定義的）的70%和0.1 %之間（例如，70%至4%)。上文描述的 Biacore測定是用于確定免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合 劑是否根據(jù)本發(fā)明交叉阻斷的基本測定。偶爾特定免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑可以不結(jié)合通過胺化學(xué)偶聯(lián)于CM5Biacore芯片的靶（這通常 在靶上相關(guān)結(jié)合位點由于偶聯(lián)于芯片被掩蓋或破壞時發(fā)生）。在此種情況下，可以使用靶的 標(biāo)記版本，例如N-末端His-標(biāo)記的版本確定交叉-阻斷。在該特定形式中，抗-His抗 體將被偶聯(lián)于Biacore芯片并隨后His-標(biāo)記的靶將通過芯片表面并被抗-His抗體捕獲。 交叉阻斷分析將基本上如上文描述的進行，除了在每次芯片再生循環(huán)之后，新的His-標(biāo) 記的靶將被加載回抗-His抗體包被的表面。除了給定的使用N-末端His-標(biāo)記的靶的實 例之外，可以備選地使用C-末端His-標(biāo)記的靶。此外，本領(lǐng)域已知的各種其它標(biāo)簽和標(biāo) 簽結(jié)合蛋白組合可以用于此種交叉-阻斷分析（例如HA標(biāo)簽與抗-HA抗體；FLAG標(biāo)簽與 抗-FLAG抗體；生物素標(biāo)簽與鏈霉親和素）。
[0206] 以下一般描述用于確定針對靶（例如，P2X7)的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑是否如本文中定義的交叉阻斷或能夠交叉-阻斷的ELISA 測定。將理解能夠以本文中描述的任意免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多 肽或其它結(jié)合劑使用所述測定。所述測定的一般原理是要具有針對包被在ELISA板孔上的 靶的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或結(jié)合劑。將過量的第二，可能 交叉阻斷，抗-靶免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽加入溶液（即，未 結(jié)合于ELISA板）。隨后將有限量的靶加入孔。包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域或多肽和溶液中的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽競爭結(jié) 合有限量的靶分子。清洗板以去除尚未被包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域或多肽結(jié)合的過量靶并且還去除第二，溶液相免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域或多肽以及在第二，溶液相免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽和 靶之間形成的任意復(fù)合體。隨后使用適于檢測靶的試劑測量結(jié)合的靶的量。溶液中能夠交 叉阻斷包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的免疫球蛋白，抗體， 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽將能夠引起相對在缺少第二、溶液相，免疫球蛋白，抗體， 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的情況下包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域或多肽能夠結(jié)合的靶分子數(shù)，包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或 多肽能夠結(jié)合的靶分子數(shù)的減少。在第一免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或 多肽，例如Ab-X，被選擇為固定化的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽 的情況下，其被包被在ELISA板孔上，其后，將板用合適的封閉溶液封閉以最小化接著加 入的試劑的非特異結(jié)合。隨后將過量的第二免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 或多肽，B卩，Ab-Y，加入ELISA板，從而在包被ELISA的過程中，每孔中Ab-Y靶結(jié)合位點的 摩爾/孔至少10倍高于使用的Ab-X靶結(jié)合位點的摩爾/孔。隨后將靶加入，從而加入的靶 的摩爾/孔至少25-倍低于用于包被各個孔的Ab-X靶結(jié)合位點的摩爾數(shù)。合適的孵育時 期之后，清洗ELISA板并且加入用于檢測靶的試劑以測量由包被的抗-靶免疫球蛋白，抗 體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽特異結(jié)合的靶的量（在Ab-X的情況下）。用于測定的 背景信號被定義為在具有包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽（在 該情況下Ab-X)，第二溶液相免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽（在該情況下Ab-Y)，僅靶緩 沖液（即，無靶）和靶檢測試劑的孔中獲得的信號。用于測定的陽性對照信號被定義為在 具有包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽（在該情況下Ab-X)，僅第 二溶液相免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽緩沖液（即無第二溶液相免 疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽），靶和靶檢測試劑的孔中獲得的信號。 ELISA測定能夠以這樣的方式運行以致使陽性對照信號至少6倍于背景信號。為了避免由 于選擇哪種免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽用作包被免疫球蛋白，抗 體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽和哪種用作第二（競爭劑）免疫球蛋白，抗體，免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽導(dǎo)致的任何人為現(xiàn)象（例如Ab-X和Ab-Y之間對靶顯著不同的 親和力），交叉阻斷測定能夠以兩種方式進行：1)方式1是其中Ab-X是包被在ELISA板上 的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽并且Ab-Y是溶液中的競爭免疫球 蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽以及2)方式2是其中Ab-Y是包被在ELISA 板上的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽并且Ab-X是溶液中的競爭免 疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽。如果與在缺少溶液相抗-靶免疫球蛋 白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽（即，陽性對照孔）的情況下獲得的靶檢測信 號相比，在方式1或方式2中，溶液相抗-靶免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 或多肽能夠引起靶檢測信號{:即由包被的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或 多肽結(jié)合的靶的量）的60%和100%之間，具體在70%和100%之間，和更具體在80%和 100%之間的減少，則Ab-X和Ab-Y被定義為交叉-阻斷。
[0207] "表位分箱（binning) "是指使用競爭結(jié)合測定或交叉-阻斷測定以鑒定不能夠或 能夠同時結(jié)合靶（例如，P2X7)的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽， 或其它結(jié)合劑對從而鑒定結(jié)合靶上相同，或重疊表位的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域，多肽或其它結(jié)合劑。
[0208] 用于本說明書的"表位箱"因此是具有相同或重疊結(jié)合特異性的免疫球蛋白，抗 體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽，或其它結(jié)合劑家族。如上文描述的，將免疫球蛋 白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽，或其它結(jié)合劑分選入表位箱是基于免疫球蛋 白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽，或其它結(jié)合劑對抗原結(jié)合的交叉-競爭（交 叉阻斷）。交叉-競爭（交叉阻斷）測定分析免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，多肽或其它結(jié)合劑對抗原和免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽，或 其它結(jié)合劑一起的具有類似的配對屬性（profile)的基團的同時結(jié)合（配對）。具有類似 的屬性（即，屬于相同表位箱）的免疫球蛋白，抗體，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，多肽或 其它結(jié)合劑能夠結(jié)合相同、密切相關(guān)和/或重疊的表位。
[0209] 如果其對（如本文中定義的）這些不同抗原或抗原決定簇都特異，則氨基酸序 列被表示對兩種不同抗原或抗原決定簇（諸如例如來自哺乳動物的不同物種的血清白蛋 白，諸如例如人血清白蛋白和食蟹猴（cyno)血清白蛋白，諸如例如來自不同哺乳動物的 P2X7) "交叉反應(yīng)"。
[0210] 注意的是，本文中使用的'能夠特異結(jié)合'和'特異結(jié)合'同義使用并且是指特異 結(jié)合分別指出的實體的能力。
[0211] 本文中使用的術(shù)語〃P2X7〃是指形成（同源_)三聚體細(xì)胞外ATP-門控陽離子通道 〃P2X7受體〃的蛋白，特別是由SEQIDNOs:1-5,以及其所有同種型，特別是SEQIDNOs: 1-3及其同種型表示的蛋白。（人）同種型包括所有拼接變體，例如，P2X7(b)-P2X7(k)，以 及在人P2X7受體中鑒定的所有單核苷酸多態(tài)性，并且包括具有改變的N末端和跨膜結(jié)構(gòu) 域1的形式（所有都為本領(lǐng)域已知的，參見例如Cheewatrakoolpong等人（2005)Biochem. Biophys.Res.Commun. 332, 17 - 27 和Feng等人（2006)J.Biol.Chem. 281，17228 - 17237)。 P2X7受體的門控誘導(dǎo)炎癥小體和細(xì)胞表面金屬蛋白酶的活化。
[0212] 本文中使用的術(shù)語本發(fā)明多肽的"效力"，是其特異效果發(fā)生所需量的本發(fā)明的多 肽的功能。其被簡單測量為該多肽的IC5(I的倒數(shù)。它是指本發(fā)明所述多肽中和P2X7活性 的能力；諸如調(diào)節(jié)，抑制和/或預(yù)防P2X7活性，調(diào)節(jié)，抑制和/或預(yù)防由P2X7活性誘導(dǎo) 的組織損傷炎癥的引發(fā)。
[0213] 所述效力可以由本領(lǐng)域中已知的或本文中描述的任意合適測定測量，諸如例如 在實施例部分描述的。
[0214] 相比之下，本發(fā)明多肽的"功效"測量在飽和多肽濃度下效果本身的最大強度。功 效表明可從本發(fā)明的多肽獲得的最大響應(yīng)。其是指多肽產(chǎn)生所需（治療）效果的能力。
[0215] 在本發(fā)明的情況下，"調(diào)節(jié)（modulating) "或"調(diào)節(jié)（tomodulate) "通常意為降 低或抑制以及增加，加強或增強P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)及其同種型的活 性，如使用合適的體外，細(xì)胞或體內(nèi)測定（諸如本文中提到的那些）測量的。尤其，與在 相同條件下但不存在本發(fā)明多肽的相同測定中，P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3) 及其同種型的活性相比，以至少1%，優(yōu)選至少5%，諸如至少10%或至少25%，例如以 至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多降低或抑制以及增加或增 強P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)及其同種型的活性（如使用合適的體外，細(xì) 胞或體內(nèi)測定（諸如本文中提到的那些）測量）。
[0216] 調(diào)節(jié)可以例如包括降低或抑制細(xì)胞外ATP對P2X7受體的結(jié)合或降低或抑制在 P2X7受體的Arg125處NAD-依賴性ADP-核糖基化。調(diào)節(jié)可以例如包括降低或抑制由 P2X7受體導(dǎo)致的門控。P2X7受體的門控誘導(dǎo)炎癥小體的活化，細(xì)胞表面金屬蛋白酶的活 化，TACE導(dǎo)致的外-結(jié)構(gòu)域脫落，磷脂酰絲氨酸（PS)的外化和/或凋亡。
[0217] 備選地，調(diào)節(jié)可以包括增加，加強或增強由P2X7受體導(dǎo)致的門控。
[0218] 本發(fā)明多肽的"半衰期"可以通常如W0 08/020079中第57頁〇)段中描述的和在 本文中提到的來定義，是指例如由于由天然機制導(dǎo)致的多肽降解和/或多肽清除或隔離導(dǎo) 致的多肽在體內(nèi)的血清濃度被降低50%所用的時間。本發(fā)明多肽的體內(nèi)半衰期能夠以任意 本身已知的方式確定，諸如通過藥代動力學(xué)分析。合適的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是清 楚的，并且可以例如通常如在WO08/020079第57頁〇)段描述的。還如在WO08/020079 第57頁〇)段提到的，半衰期可以使用參數(shù)諸如tl/2-a，tl/2-f3和曲線下面積（AUC)表 達。例如對標(biāo)準(zhǔn)手冊，諸如Kenneth等人（ChemicalStablityofPharmaceuticals:A HandbookforPharmacists,JohnWiley&SonsInc,1986)和MGibaldi和DPerron("Ph armacokinetics〃,MarcelDekker, 2nd修改版，1982)進行參考。術(shù)語"半衰期的增加"或 "增加的半衰期"也在W0 08/020079第57頁〇)段定義并且尤其是指tl/2-f3的增加，有 或沒有tl/2-a和/或AUC或二者的增加。
[0219] 除非另有說明，術(shù)語"免疫球蛋白不論在本文中用于指重鏈抗體或常規(guī)4-鏈 抗體-用作一般術(shù)語以包括全尺寸抗體，其單個鏈，以及其所有部分，結(jié)構(gòu)域或片段（分 別包括但不限于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段諸如VHH結(jié)構(gòu)域或VH/\結(jié)構(gòu)域）。
[0220] 本文中使用的術(shù)語（多肽或蛋白）的"結(jié)構(gòu)域"是指具有獨立于蛋白的其余部分 保留其三級結(jié)構(gòu)的能力的折疊的蛋白結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的單獨的功能性質(zhì)，并 且在很多情況下可以被添加、去除或轉(zhuǎn)移至其它蛋白而不損失蛋白和/或結(jié)構(gòu)域的其余部 分的功能。
[0221] 本文中使用的術(shù)語"免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域"是指抗體鏈（諸如例如，常規(guī)4-鏈抗 體或重鏈抗體的鏈）的球狀區(qū)域，或指基本上由此種球狀區(qū)域組成的多肽。免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域特征為，它們保留了抗體分子的免疫球蛋白折疊特性，所述抗體分子由以兩個折 疊排列的約七條反平行鏈的雙層夾心組成，任選地由保守二硫鍵穩(wěn)定。
[0222] 本文中使用的術(shù)語"免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域"意為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其基本上 由四個"構(gòu)架區(qū)"組成，所述四個"構(gòu)架區(qū)"在本領(lǐng)域中和在本文下文中分別被稱為"構(gòu) 架區(qū)1〃或〃FR1〃 ；〃構(gòu)架區(qū)2〃或〃FR2〃 ；〃構(gòu)架區(qū)3〃或〃FR3〃 ；和〃構(gòu)架區(qū)4〃或〃FR4〃 ；所 述構(gòu)架區(qū)由三個〃互補決定區(qū)〃或〃⑶Rs〃打斷，所述三個〃互補決定區(qū)〃或〃⑶Rs〃在本 領(lǐng)域中和在本文下文中分別被稱為〃互補決定區(qū)1〃或〃CDR1";〃互補決定區(qū)2〃或"CDR2"; 和〃互補決定區(qū)3"或"CDR3"。因此，免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般結(jié)構(gòu)或序列可以表示 如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通過攜帶抗原結(jié)合位點賦予抗體對抗原的特異 性的是免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。
[0223] 與"單可變結(jié)構(gòu)域"交替使用的術(shù)語"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域"限定了這樣的 分子，其中抗原結(jié)合位點存在于單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域上，和由單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形 成。這使得免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域脫離"常規(guī)"免疫球蛋白或其片段，其中，兩個免疫球 蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是兩個可變結(jié)構(gòu)域相互作用以形成抗原結(jié)合位點。典型地，在常規(guī)免疫 球蛋白中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)相互作用以形成抗原結(jié)合位點。 在此種情況下，VH和VL的互補決定區(qū)（CDRs)都將促成抗原結(jié)合位點，即總共6個CDRs 將包括在抗原結(jié)合位點的形成中。
[0224] 鑒于上述定義，常規(guī)4-鏈抗體（諸如IgG,IgM,IgA,IgD或IgE分子；本領(lǐng)域已知 的）或源自此種常規(guī)4-鏈抗體的Fab片段，F(xiàn)(ab'）2片段，F(xiàn)v片段諸如二硫化物連接的Fv 或scFv片段，或雙抗體（diabody)(全部是本領(lǐng)域已知的）的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑼ǔ２槐?認(rèn)為是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，因為在這些情況中，由一個（單個）免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 對各個抗原表位的結(jié)合將通常不發(fā)生，而由（締合的）免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域諸如輕和重鏈可 變結(jié)構(gòu)域?qū)?，即，通過免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的VH-VL對，其共同結(jié)合各個抗原的表位。
[0225] 相比之下，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域能夠特異結(jié)合抗原表位而無需與另外的免 疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域配對。由單個VH/VHH或VL結(jié)構(gòu)域形成免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合位點。因此，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點由不多于三個CDRs形成。
[0226] 由此，單可變結(jié)構(gòu)域可以是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，VL-序列）或其合適的片 段；或重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，VH-序列或VHH序列）或其合適的片段；只要其能夠形 成單個抗原結(jié)合單元（即功能性抗原結(jié)合單元，其基本上由單可變結(jié)構(gòu)域組成、從而所述 單個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不需要與另一個可變結(jié)構(gòu)域相互作用以形成功能性抗原結(jié)合單元）。
[0227] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域 序列（例如，VH-序列）；更具體地，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是源自常規(guī)四-鏈 抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或源自重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
[0228] 例如，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是（單）結(jié)構(gòu)域抗體（或適于用作（單） 結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），"dAb"或dAb(或適于用作dAb的氨基酸）或納米抗體（如本文中 定義的，并且包括但不限于VHH);其它單可變結(jié)構(gòu)域，或其任一個的任意合適片段。
[0229] 尤其是，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是納米抗體g (如本文中定義的） 或其合適的片段。[注意：納米抗體' 納米抗體&和納米克隆XNanoclone)?是Ablynx N.V.的注冊商標(biāo)]。對于納米抗體的一般描述，對下文進一步描述，以及對本文中引用的 現(xiàn)有技術(shù)，諸如例如在W0 08/020079中描述的（第16頁）進行參考。
[0230] "VHH結(jié)構(gòu)域〃，也稱為VHHs，VhH結(jié)構(gòu)域，VHH抗體片段，和VHH抗體，最初 被描述為〃重鏈抗體〃（即〃缺少輕鏈的抗體〃；Hamers-Casterman等人Nature363 : 446-448,1993)的抗原結(jié)合免疫球蛋白（可變）結(jié)構(gòu)域。選擇術(shù)語"VHH結(jié)構(gòu)域"以將這 些可變結(jié)構(gòu)域與存在于常規(guī)4-鏈抗體中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（其在本文被稱為"VHg構(gòu)域" 或"VH結(jié)構(gòu)域"）和與存在于常規(guī)4-鏈抗體中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（其在本文被稱為"'結(jié) 構(gòu)域〃或〃VL結(jié)構(gòu)域〃）相區(qū)別。為了進一步描述VHH's和納米抗體，對Muyldermans的 綜述文章（ReviewsinMolecularBiotechnology74 :277_302, 2001)，以及以下作為一般

【背景技術(shù)】被提及的專利申請進行引用：VrijeUniversiteitBrussel的WO94/04678，W0 95/04079 和WO96/34103;Unilever的TO94/25591，TO99/37681，TO00/40968,TO 00/43507,TO00/65057,TO01/40310,TO01/44301，EP1134231 和TO02/48193;Vlaams InstituutvoorBiotechnologie(VIB)的TO97/49805,TO01/21817,TO03/035694,TO 03/054016和TO03/055527;AlgonomicsN.V?和AblynxN.V?的TO03/050531 ;加拿大國 家研宄委員會（NationalResearchCouncilofCanada)的TO01/90190;Instituteof Antibodies的TO03/025020 ( =EP1 433 793);以及AblynxN.V?的TO04/041867,TO 04/041862,WO04/041865,WO04/041863,WO04/062551,WO05/044858,WO06/40153,WO 06/079372,TO06/122786,TO06/122787 和TO06/122825 和AblynxN.V.的進一步公開 的專利申請。還對在這些申請中提到的進一步現(xiàn)有技術(shù)進行引用，并且尤其是對在國際申 請W0 06/040153的第41-43頁上提到的參考文獻表進行引用，所述表和參考文獻通過引 用并入本文。如在這些參考文獻中描述的，納米抗體（尤其是VHH序列和部分人源化納米 抗體）可以尤其是特征為在一個或多個構(gòu)架序列中存在一個或多個"標(biāo)志殘基"。納米抗體 的進一步描述，包括納米抗體的人源化和/或駱駝源化，以及其它修飾，部分或片段，衍 生物或"納米抗體融合體"，多價構(gòu)建體（包括接頭序列的一些非限制性實例）和增加納米 抗體及其制劑的半衰期的不同修飾可以例如在W0 08/101985和W0 08/142164中找到。為 了進一步一般描述納米抗體，對本文中引用的現(xiàn)有技術(shù)，諸如例如在WO08/020079中描 述的（第16頁）進行引用。
[0231] 〃結(jié)構(gòu)域抗體〃，也稱為〃Dab〃, 〃結(jié)構(gòu)域抗體〃，和〃dAbs〃（由GlaxoSmithKline 集團公司用作商標(biāo)的術(shù)語〃結(jié)構(gòu)域抗體（DomainAntibodies) 〃和〃dAbs〃）已經(jīng)在例如EP 0368684,Ward等人（Nature341:544-546, 1989)，Holt等人（TendsinBiotechnology 21 :484-490, 2003)和TO03/002609 以及例如TO04/068820,TO06/030220,TO06/003388 和DomantisLtd的其它公開的專利申請中描述。結(jié)構(gòu)域抗體基本上對應(yīng)于非駱蛇科哺乳 動物，尤其是人4-鏈抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域。為了以單個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合表位，即 無需分別與VL或VH結(jié)構(gòu)域配對，需要對此種抗原結(jié)合性質(zhì)的特定選擇，例如通過使用人 單VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的文庫。如VHHs，結(jié)構(gòu)域抗體具有大約13至大約16kDa的分子量， 并且如果源自全人序列，則不需要人源化用于例如人中的治療用途。
[0232] 應(yīng)該注意，盡管由于它們不是哺乳動物來源的而在本發(fā)明的情形中欠佳，但 單可變結(jié)構(gòu)域可以源自鯊魚的某些物種（例如，所謂的"IgNAR結(jié)構(gòu)域"，參見例如W0 05/18629)〇
[0233] 因此，在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域"或"單可變結(jié)構(gòu)域"包 含源自非人來源，優(yōu)選駱駝科，優(yōu)選駱駝科重鏈抗體的多肽。它們可以如之前描述的被人 源化。此外，術(shù)語包含源自非駱駝科來源，例如小鼠或人的多肽，所述多肽被"駱駝源化"， 例如在Davies和Riechman(FEBS339 :285-290, 1994 ;Biotechonol. 13 :475-479, 1995 ; Prot.Eng. 9 :531_537, 1996)以及Riechman和Muyldermans(J.Immunol.Methods231 ： 25-38, 1999)中描述的。
[0234] 根據(jù)由Kabat等人（''Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest",US PublicHealthServices，NIHBethesda，MD,PublicationNo. 91)給出的對VH結(jié)構(gòu)域的 一般編號方式對VHH結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基編號，如例如在Riechmann和Muyldermans(J. Immunol.Methods231:25-38,1999)的圖2中顯示應(yīng)用于來自駱駝科的VHH結(jié)構(gòu)域。用于 給％結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基編號的替代方法（所述方法還能夠以與VHH結(jié)構(gòu)域類似的方式 應(yīng)用）是本領(lǐng)域已知的。然而，在本說明書，權(quán)利要求和附圖中，將按照如上文描述的根 據(jù)Kabat應(yīng)用于VHH結(jié)構(gòu)域的編號方式，除非另有說明。
[0235] 應(yīng)該注意-如本領(lǐng)域?qū)τ赩Hg構(gòu)域和VHH結(jié)構(gòu)域公知的-各個⑶Rs中氨基酸 殘基總數(shù)可以變化并且可以不對應(yīng)于由Kabat編號方法指出的氨基酸殘基總數(shù)（即，根 據(jù)Kabat編號方法的一個或多個位置在實際序列中可以不被占據(jù)，或?qū)嶋H序列可以含有比 Kabat編號方法允許的數(shù)量更多的氨基酸殘基）。這意為，通常，根據(jù)Kabat的編號方法 可以對應(yīng)或可以不對應(yīng)于實際序列中氨基酸殘基的實際編號。VH結(jié)構(gòu)域和VHH結(jié)構(gòu)域中的 氨基酸殘基總數(shù)將通常在110至120,常在112和115之間的范圍內(nèi)。然而應(yīng)該注意，更小 或更長的序列也可以適于本文中描述的目的。
[0236] ⑶R區(qū)的確定也可以根據(jù)不同方法完成。在根據(jù)Kabat的⑶R確定中，VHH的FR1 包含位置1-30的氨基酸殘基，VHH的⑶R1包含位置31-35的氨基酸殘基，VHH的FR2包 含位置36-49的氨基酸，VHH的⑶R2包含位置50-65的氨基酸殘基，VHH的FR3包含位置 66-94的氨基酸殘基，VHH的⑶R3包含位置95-102的氨基酸殘基，并且VHH的FR4包含位 置103-113的氨基酸殘基。
[0237] 可以根據(jù)Kontermann和DUbel(編輯，AntibodyEngineering,第 2 卷，Springer VerlagHeidelbergBerlin,Martin,第3 章，pp. 33-51,2010)確定CDR序列。根據(jù)該方 法，F(xiàn)R1包含位置1-25的氨基酸殘基，⑶R1包含位置26-35的氨基酸殘基，F(xiàn)R2包含位 置36-49的氨基酸，⑶R2包含位置50-58的氨基酸殘基，F(xiàn)R3包含位置59-94的氨基酸殘 基，⑶R3包含位置95-102的氨基酸殘基，和FR4包含位置103-113的氨基酸殘基。
[0238] 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域諸如結(jié)構(gòu)域抗體和納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域）可以進 行人源化。尤其是，人源化免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如納米抗體（包括結(jié)構(gòu)域） 可以為如在之前段落中通常定義的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，但其中是和/或?qū)?yīng)于人源 化置換（如本文中定義的）的至少一個氨基酸殘基存在（并且尤其是，在至少一個構(gòu)架殘 基中）?？赡苡杏玫娜嗽椿脫Q可以通過比較天然存在的Vhh序列的構(gòu)架區(qū)序列與一個或 多個密切相關(guān)的人VH序列的相應(yīng)構(gòu)架序列來確定，這之后因此確定的一個或多個可能有 用的人源化置換（或其組合）可以被引入所述Vhh序列（以本身已知的任意方式，如本文 中進一步描述的）并且可以測試產(chǎn)生的人源化VHH序列對靶的親和力，穩(wěn)定性，表達的容 易度和水平，和/或其它所需性質(zhì)。這樣，通過有限程度的試錯試驗，其它合適的人源化 置換（或其合適的組合）可以由熟練技術(shù)人員基于本文中公開的內(nèi)容確定。同樣，基于在 前描述，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域）（的構(gòu)架區(qū)），可以 部分人源化或完全人源化。
[0239] 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域諸如結(jié)構(gòu)域抗體和納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域和人源 化VHH結(jié)構(gòu)域），還可以通過在一個或多個CDRs的氨基酸序列中引入一個或多個改變進 行親和力成熟，所述改變導(dǎo)致產(chǎn)生的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與各自的親本分子相比對 其各自的抗原的改善的親和力。本發(fā)明的親和力-成熟的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域分 子可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，所述方法例如由Marks等人（Biotechnology10 : 779-783, 1992)，Barbas,等人（Proc.Nat.Acad.Sci,USA91 :3809-3813, 1994)，Shier等人 (Gene169 :147-155, 1995)，Yelton等人（Immunol. 155 :1994-2004, 1995)，Jackson等人 (J.Immunol. 154 :3310-9, 1995)，Hawkins等人（J.Mol.Biol. 226 :889896, 1992)，Johnson 和Hawkins(Affinityofantibodiesusingphagedisplay,OxfordUniversity Press, 1996)描述的。
[0240] 從免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域諸如結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體開始的設(shè)計/選擇和/或 制備多肽的過程在本文中也稱為"格式化（formatting) "所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域； 并且組成多肽的部分的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域被表示為"格式化的"或為所述多肽的"形 式（format) "。基于本文中的公開內(nèi)容，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以被格式化的方式的實 例和此種格式的實例對于熟練技術(shù)人員將是清楚的；并且此種格式化的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域形成本發(fā)明的進一步方面。
[0241] 例如，并且不受限制，一個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以用作用于制備多 肽的"結(jié)合單元"，"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)構(gòu)單元"（這些術(shù)語可交替使用），其可以任選地含 有一個或多個可以用作結(jié)合單元的進一步免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（即針對P2X7的相同 或其它表位和/或針對一個或多個P2X7之外的其它抗原，蛋白或靶）。
[0242] 單價多肽僅包含一個結(jié)合單元（諸如例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）或基本上僅 由一個結(jié)合單元（諸如例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）組成。包含兩個或多個結(jié)合單元 (諸如例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）的多肽將在本文中也被稱為"多價的"多肽，并且 存在于此種多肽中的結(jié)合單元/免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域在本文中也將被稱為為"多價形 式"。例如"雙價的"多肽可以包含任選地通過接頭序列連接的兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，然而"三價"多肽可以包含任選地通過兩個接頭序列連接的三個免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域；等等。
[0243] 在多價多肽中，所述兩個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以相同或不同，并且 可以針對相同抗原或抗原決定簇（例如針對相同部分或表位或針對不同部分或表位）或可 以備選地針對不同抗原或抗原決定簇；或其任意合適組合。含有至少兩個結(jié)合單元（諸如 例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）的多肽（其中至少一個結(jié)合單元針對第一抗原（即P2X7) 且至少一個結(jié)合單元針對第二抗原（即不同于P2X7))也將被稱為"多特異性"多肽，并且 存在于此種多肽中的結(jié)合單元（諸如例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）將在本文中也被稱為 為"多特異性形式"。因此，例如，本發(fā)明的"雙特異性"多肽是包含至少一個針對第一抗 原（即P2X7)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和至少一個針對第二抗原（即不同于P2X7)的 進一步免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽，然而本發(fā)明的"三特異性"多肽是包含至少一個 針對第一抗原（即P2X7)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，至少一個針對第二抗原（即不同于 P2X7)的進一步免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和至少一個針對第三抗原（即不同于P2X7和第二 抗原二者）的進一步的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽；等等。
[0244] "多互補位多肽"，諸如例如"雙互補位多肽"或"三互補位（triparatopic)多肽"， 包含各具有不同互補位的兩個或多個結(jié)合單元或基本上由各自具有不同互補位的兩個或 多個結(jié)合單元組成（如將進一步在本文中描述的；參見本發(fā)明關(guān)于多價多肽的章節(jié)）。
[0245] P2X7
[0246] 本發(fā)明的ISVs和多肽可以通常用于調(diào)節(jié)，并且尤其是抑制和/或預(yù)防，ATP對 P2X7的結(jié)合或細(xì)胞外ATP介導(dǎo)的P2X7并且尤其是人P2X7的活化（參見表B-2)，并且因此 用于調(diào)節(jié)，并且尤其是抑制或預(yù)防，由P2X7并且尤其是人P2X7(SEQIDN0:l-3)導(dǎo)致的 門控和/或調(diào)節(jié)與此種門控（P2X7結(jié)構(gòu)單元）相關(guān)的生物機制，響應(yīng)和效果。優(yōu)選地，本 發(fā)明的ISVs選自由以下組成的組：lc81-樣序列，3c23-樣序列，lcll3-樣序列，13a7-樣 序列和14d5-樣序列。
[0247] 本發(fā)明提供的氨基酸序列優(yōu)選地為基本上分離的形式（如本文中定義的），或形 成本發(fā)明的蛋白或多肽的部分（如本文中定義的），其可以包含本發(fā)明的一個或多個氨基 酸序列或基本上由本發(fā)明的一個或多個氨基酸序列組成并且其可以任選地進一步包含一 個或多個進一步的氨基酸序列（所有都任選地通過一個或多個合適的接頭連接）。例如， 并且不受限制，本發(fā)明的一個或多個氨基酸序列可以用作此種蛋白或多肽中的結(jié)合單元， 其可以任選地含有一個或多個可以用作結(jié)合單元（即針對一個或多個P2X7之外的其它靶） 的進一步的氨基酸序列，從而分別提供本發(fā)明的單價，多價的或多特異性多肽，全部如本 文中描述的。此種蛋白或多肽也可以是基本上分離的形式（如本文中定義的）。
[0248] 本發(fā)明的氨基酸序列和多肽本身優(yōu)選基本上由不通過二硫化物橋連接于其它氨 基酸序列或鏈的單個氨基酸鏈組成（但可以含有或可以不含有一個或多個分子內(nèi)二硫化 物橋，例如，已知納米抗體-如本文中描述的-有時可以在⑶R3和⑶R1或FR2之間含 有二硫化物橋）。然而，應(yīng)該注意本發(fā)明的一個或多個氨基酸序列可以彼此連接和/或 連接于其它氨基酸序列（例如，通過二硫化物橋）以提供也可以用于本發(fā)明的肽構(gòu)建體 (例如Fab'片段，F(xiàn)(ab'）2片段，ScFv構(gòu)建體，"雙抗體"及其它多特異性構(gòu)建體。例如對 Holliger和Hudson的綜述，NatBiotechnol.2005S??；23(9) :1126-36)進行參考。
[0249] 通常，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列（或包含本發(fā)明的氨基酸序列的化合物，構(gòu)建體或 多肽）要施用于受試者（例如用于本文中描述的治療和/或診斷目的），其優(yōu)選為不天然 存在于所述受試者中的氨基酸序列；或當(dāng)其的確天然存在于所述受試者中時為基本上分離 的形式（如本文中定義的）。
[0250] 此外，除了至少一個用于結(jié)合P2X7的結(jié)合位點之外，本發(fā)明的氨基酸序列可以任 選地含有一個或多個結(jié)合其它抗原，蛋白或靶的進一步的結(jié)合位點。
[0251] 在本說明書和權(quán)利要求中，以下術(shù)語定義如下：
[0252] A)1C81-樣序列："1C81-樣序列"," 1C81-樣ISV"或" 1C81-樣結(jié)構(gòu)單元"被定 義為包含以下的ISV(如本文中描述的）：
[0253] a)⑶R1，所述⑶R1包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列 RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)或（ii)與氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)僅具有 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0254] b)⑶R2,所述⑶R2包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ IDNO:62)或（ii)與氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDNO:62)具有至少80%，諸如至少85%， 例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ IDNO:62)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和 /或
[0255] c)⑶R3,所述⑶R3包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列 HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDN0:90)或（ii)與氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQID NO:90)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸 序列；或（iii)與氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0256] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 CDR3優(yōu)選為這樣：1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的任意合適的測定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（如本領(lǐng)域已知的）或通過基 于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）確定。
[0257] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性由基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確定， 例如，諸如在實施例1. 7或1. 8中描述的。優(yōu)選地，1C81-樣ISV具有小于250nM，更優(yōu) 選，小于200nM, 175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM的 IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定，例 如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0258] 優(yōu)選地，在此種1C81-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的；或 CDR1和CDR3分別如在a)和c)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的。 更優(yōu)選地，在此種1C81-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在a)，b)和c)下定義 的。同樣，在此種1C81-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：1C81-樣ISV具有調(diào) 節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通 過Alphascreen測定或通過基于細(xì)胞的測定（例如，諸如本文中描述的）。
[0259] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述1C81-樣ISV具有小于250nM， 更優(yōu)選，小于200nM，175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0260] 例如，在此種1C81-樣序列中：⑶R1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列RTFSFSTSTMG(SEQIDNO:34) (CDR2 和CDR3 分別如在b)和c)下定義的）；和 / 或CDR2 可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDN0:62)(CDR1和CDR3如 在a)和c)下定義的，分別）；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序 列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90) (CDR1 和CDR2 分別如在a)和b)下定義的）。特 別是，當(dāng)1C81-樣序列根據(jù)此方面時：CDR1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序 列RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列 AIDWSDFN(SEQIDN0:62)(CDR3如在上述c)下定義的）；和/或CDR1可以包含以下或基本 上由以下組成：氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)并且CDR3可以包含以下或基本上 由以下組成：氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90) (CDR2如在上述b)下定義 的）；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDNO: 62)并且⑶R3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ IDN0:90)(CDR1如在上述a)下定義的）。同樣，在此種1C81-樣序列中，CDR1，CDR2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述 的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如，諸如本文中描述的）。
[0261] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1. 7或1. 8中描述的。優(yōu)選地，1C81-樣ISV具有小于250nM，更 優(yōu)選，小于200nM, 175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0262] 在特別優(yōu)選的方面，"1C81-樣序列"，"1C81-樣ISV"或"1C81-樣結(jié)構(gòu)單元"是 包含以下的ISV:
[0263] d)CDRl，所述CDR1 是⑴氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQIDNO:34)或（ii)與氨 基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQIDNO:34)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的） 的氨基酸序列；和/或
[0264] e)CDR2,所述CDR2 是（i)氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDN0:62)或（ii)與氨基 酸序列410150?以5￡〇10勵：62)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于 95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDN0:62)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0265] f)CDR3,所述CDR3 是⑴氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90) 或（ii)與氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDN0:90)具有至少80%，諸如至 少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列 HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或 1 個氨基酸差異（如本文中 定義的）的氨基酸序列；
[0266] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如，諸如本文中描 述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0267] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1. 7或1. 8中描述的。優(yōu)選地，1C81-樣ISV具有小于250nM，更 優(yōu)選，小于200nM, 175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0268] 優(yōu)選地，在根據(jù)該具體優(yōu)選的方面的1C81-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在d) 和e)下定義的；或CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在e) 和f)下定義的。更優(yōu)選，在此種1C81-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在d)，e) 和f)下定義的。同樣，在此種1C81-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：1C81-樣 ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定， 諸如，例如，通過A lphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定 (例如，諸如本文中描述的）。
[0269] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述1C81-樣ISV具有小于250nM， 更優(yōu)選，小于200nM，175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0270] 例如，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的1C81-樣序列中：CDR1是氨基酸序列 RTFSFSTSTMG(SEQIDNO:34)(其中CDR2和CDR3分別如在e)和f)下定義的）；和/或 CDR2為氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDNO:62)(其中CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定 義的）；和 / 或CDR3 為氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90)(其中CDR1 和 CDR2分別如在d)和e)下定義的）。特別是，當(dāng)1C81-樣序列根據(jù)該方面時：CDR1是氨 基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)并且CDR2 是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDNO: 62)(其中CDR3如在上述f)下定義的）；和/或CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQID NO:34)并且CDR3 是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90)(其中CDR2 如在 上述e)下定義的）；和/或CDR2是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDN0:62)并且CDR3是 HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDNO:90)(其中CDR1如在上述d)下定義的）。同樣，在此種 1C81-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活 性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen 測定（例如，諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如，諸如本文中描述的）。
[0271] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述1C81-樣ISV具有小于250nM， 更優(yōu)選，小于200nM，175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0272] 在特別優(yōu)選的1C81-樣序列中：CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQID NO:34)，CDR2是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQIDNO:62);并且CDR3是氨基酸序列 HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDN0:90)。
[0273] 在該部分A)中描述的所有1C81-樣序列中，構(gòu)架序列可以如本文中進一步描述 的。優(yōu)選地，所述構(gòu)架序列是這樣：所述構(gòu)架序列與1C81的構(gòu)架序列具有至少80%，諸如 至少85%，例如至少90%，諸如至少95%序列同一性（其例如可以通過確定給定序列與 1C81序列的序列同一性的整體程度同時在計算中忽略CDR's來確定）。同樣，存在于給定 序列中的CDR's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活 性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen 測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0274] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述1C81-樣ISV具有小于250nM， 更優(yōu)選，小于200nM，175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0275]在一個特定的方面，1C81-樣序列是與SEQIDNO:6具有至少70%，諸如至少 80%，例如至少85%，諸如至少90%或大于95%序列同一性的ISV。例如，在根據(jù)此 方面的1C81-樣序列中，⑶R's可以根據(jù)上文描述具體優(yōu)選的方面，并且可以尤其（但 不受限制）是RTFSFSTSTMG(SEQIDN0:34)(CDR1) ;AIDWSDFN(SEQIDN0:62)(CDR2);和 HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQIDN0:90)(CDR3)。同樣，優(yōu)選地，存在于此種 1C81-樣ISV中 的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的1C81-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可 以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測 定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0276] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述1C81-樣ISV具有小于250nM， 更優(yōu)選，小于200nM，175nM或甚至更小，諸如小于150nM或125nM或甚至更優(yōu)選小于110nM 的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定， 例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS) 確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0277] 在一個特定的方面，任意1C81-樣序列可以是人源化和/或序列優(yōu)化的序列，如 本文中進一步描述的。
[0278] B)3C23-樣序列："3C23-樣序列", "3C23-樣ISV"或"3C23-樣結(jié)構(gòu)單元"被定 義為包含以下的ISV(如本文中描述的）：
[0279] a)⑶R1，所述⑶R1包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ IDNO:40)或（ii)與氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)僅具有3, 2或1個氨基酸差 異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0280] b)CDR2,所述CDR2包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列AISSYGST(SEQ IDNO:68)或（ii)與氨基酸序列AISSYGST(SEQIDNO:68)具有至少80%，諸如至少85%， 例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列AISSYGST(SEQ IDNO:68)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和 /或
[0281] c)⑶R3,所述⑶R3包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列 DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)或（ii)與氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ IDNO:96)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸 序列；或（iii)與氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0282] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（如本領(lǐng)域中已知的） 或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0283] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0284] 優(yōu)選地，在此種3C23-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的；或 CDR1和CDR3分別如在a)和c)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的。更 優(yōu)選地，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在a)，b)和c)下定義的。 同樣，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié) 活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如， 通過Alphascreen測定）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0285] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0286] 例如，在此種3C23-樣序列中：⑶R1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)(其中CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的）；和/ 或CDR2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列AISSYGST(SEQIDN0:68)(其中 ⑶R1和⑶R3分別如在a)和c)下定義的）；和/或⑶R3可以包含以下或基本上由以下組 成：氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)(其中CDR1 和CDR2 分別如在a) 和b)下定義的）。特別是，當(dāng)3C23-樣序列根據(jù)該方面時：CDR1可以包含以下或基本上 由以下組成：氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQIDN0:40)并且⑶R2可以包含以下或基本上由 以下組成：氨基酸序列AISSYGST(SEQIDNO:68)(其中CDR3如在上述c)下定義的）；和/ 或⑶R1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQIDN0:40)并且 ⑶R3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO: 96)(其中⑶R2如在上述b)下定義的）；和/或⑶R2可以包含以下或基本上由以下組成： 氨基酸序列AISSYGST(SEQIDN0:68)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基 酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDN0:96)(其中CDR1如在上述a)下定義的）。同 樣，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活 性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通 過A lphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文 中描述的）。
[0287] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0288] 在特別優(yōu)選的方面，"3C23-樣序列"，"3C23-樣ISV"或"3C23-樣結(jié)構(gòu)單元"是 包含以下的ISV:
[0289] d)CDRl，所述CDR1 是⑴氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)或（ii)與氨基 酸序列RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨 基酸序列；和/或
[0290] e)CDR2,所述CDR2 是⑴氨基酸序列AISSYGST(SEQIDN0:68)或（ii)與氨基 酸序列4155￥65!'(5￡〇10勵：68)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于 95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列AISSYGST(SEQIDN0:68)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0291] f)CDR3,所述CDR3 是（i)氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96) 或（ii)與氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)具有至少80%，諸如至 少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列 DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或 1 個氨基酸差異（如本文 中定義的）的氨基酸序列；
[0292] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述 的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0293] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0294] 優(yōu)選地，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的3C23-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在d)和 e) 下定義的；或CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在e)和 f) 下定義的。更優(yōu)選，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在d)，e)和 f)下定義的。同樣，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述3C23-樣 ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定， 諸如，例如，通過A lphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定 (例如諸如本文中描述的）。
[0295] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0296] 例如，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的3C23-樣序列中：CDR1是氨基酸序列 RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)(其中CDR2和CDR3分別如在e)和f)下定義的）；和/或CDR2 是氨基酸序列AISSYGST(SEQIDN0:68)(其中CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的）； 和 / 或CDR3 是氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)(其中CDR1 和CDR2 分 別如在d)和e)下定義的）。特別是，當(dāng)3C23-樣序列根據(jù)此方面時：CDR1是氨基酸序列 RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)并且CDR2 是氨基酸序列AISSYGST(SEQIDNO:68)(其中CDR3 如在f)下定義的）；和/或CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQIDNO:40)并且CDR3是氨 基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDN0:96)(其中CDR2如在上述e)下定義的）；和/ 或CDR2 是氨基酸序列AISSYGST并且CDR3 是DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO:96)(其 中⑶R1如在上述d)下定義的）。同樣，在此種3C23-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為 這樣：所述3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任 意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或 通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0297] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0298] 在特別優(yōu)選的3C23-樣序列中：CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQID NO:40)，CDR2是氨基酸序列AISSYGST(SEQIDNO:68);并且CDR3是氨基酸序列 DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDN0:96)。
[0299] 在該部分B)描述的所有3C23-樣序列中，構(gòu)架序列可以如本文中進一步描述的。 優(yōu)選地，所述構(gòu)架序列是這樣：所述構(gòu)架序列與3C23的構(gòu)架序列具有至少80%，諸如至少 85%，例如至少90%，諸如至少95%的序列同一性（所述序列同一性例如，可以通過確 定給定序列與3C23序列的序列同一性的整體程度而在計算中忽略CDR's來確定）。同樣， 存在于給定序列中的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選地為這樣：產(chǎn)生的3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活 性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通 過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文 中描述的）。
[0300] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0301]在一個特定的方面，3C23-樣序列是與SEQIDNO:6具有至少70%，諸如至少 80%，例如至少85%，諸如至少90%或大于95%序列同一性的ISV。例如，在根據(jù)這方 面的3C23-樣序列中，CDR's可以根據(jù)上文描述的具體優(yōu)選的方面，并且可以尤其（但 不受限制）為RTFRHYAMG(SEQIDN0:40)(CDR1) ;AISSYGST(SEQIDN0:68)(CDR2);和DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDN0:96)(CDR3)。同樣，優(yōu)選地，存在于此種 3C23-樣ISV 中的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的3C23-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen 測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0302] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定，例如，諸如在實施例1.7或1.8中描述的。優(yōu)選地，所述3C23-樣ISV具有小于100nM， 更優(yōu)選，小于50nM，25nM或甚至更小，諸如小于20nM或15nM，10nM，8nM或甚至更優(yōu)選小于 5nM的IC50的調(diào)節(jié)活性；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確 定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫 落（PS)確定，例如，諸如在實施例1. 11中描述的；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡確定，例如，諸如在實施例1. 10中描述的。
[0303] 在一個特定的方面，任何3C23-樣序列可以是人源化和/或序列優(yōu)化的序列，如 本文中進一步描述的。
[0304] 01C113-樣序列："1C113-樣序列", "1C113-樣ISV"或"1C113-樣結(jié)構(gòu)單元"被 限定為包含以下的ISV(如本文中描述的）：
[0305] a)⑶R1，所述⑶R1包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ IDNO:35)或（ii)與氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)僅具有3, 2或1個氨基酸差 異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0306] b)CDR2,所述CDR2包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列DISPGGHT(SEQ IDNO:63)或（ii)與氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDNO:63)具有至少80%,諸如至少85%, 例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列DISPGGHT(SEQ IDNO:63)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和 /或
[0307] c)⑶R3,所述⑶R3包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列 RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91)或（ii)與氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91)具有至少 80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與 氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文 中定義的）的氨基酸序列；
[0308] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過A lphascreen測定（如本領(lǐng)域中已知的） 或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0309] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0310] 優(yōu)選地，在此種1C113-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的；或 CDR1和CDR3分別如在a)和c)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的。更 優(yōu)選，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在a)，b)和c)下定義的。 同樣，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述1C113-樣ISV具有 調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例 如，通過Alphascreen測定）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0311] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0312] 例如，在此種1C113-樣序列中：⑶R1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)(其中CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的）；和/或 ⑶R2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDN0:63)(其中⑶R1 和CDR3分別如在a)和c)下定義的）；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下組成：氨 基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)(其中CDR1和CDR2分別如在a)和b)下定義的）。 特別是，當(dāng)1C113-樣序列根據(jù)此方面時：CDR1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列IAFNYYSMS(SEQIDN0:35)并且⑶R2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列 DISPGGHT(SEQIDNO:63)(其中CDR3如在上述c)下定義的）；和/或CDR1可以包含以下 或基本上由以下組成：氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQIDN0:35)并且⑶R3可以包含以下或基 本上由以下組成：氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91)(其中CDR2如在上述b)下定義 的）；和/或⑶R2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDNO: 63)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91) (其中⑶R1如在上述a)下定義的）。同樣，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu) 選為這樣：1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任 意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或 通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0313] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0314] 在特別優(yōu)選的方面，"1C113-樣序列"，"1C113-樣ISV"或"1C113-樣結(jié)構(gòu)單元" 是包含以下的ISV:
[0315] d)CDRl，所述CDR1 是⑴氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)或（ii)與氨基 酸序列IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨 基酸序列；和/或
[0316] e)CDR2,所述CDR2 是（i)氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDNO:63)或（ii)與氨基 酸序列015?66肌(5￡〇10勵：63)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于 95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列DISPGGHT僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1 個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0317] f)CDR3,所述CDR3 是⑴氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)或（ii)與氨 基酸序列虬1^￡￥33附(3￡〇10勵：91)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大 于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91)僅 具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0318] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述 的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0319] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0320] 優(yōu)選地，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的1C113-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在d) 和e)下定義的；或CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在 e)和f)下定義的。更優(yōu)選，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在 d) ，e)和f)下定義的。同樣，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所 述1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適 的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基 于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0321] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0322] 例如，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的1C113-樣序列中：CDR1是氨基酸序列 IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)(其中CDR2和CDR3分別如在e)和f)下定義的）；和/或CDR2 是氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDN0:63)(其中CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的）； 和/或CDR3是氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)(其中CDR1和CDR2分別如在d)和 e) 下定義的）。特別是，當(dāng)1C113-樣序列根據(jù)此方面時：⑶R1是氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ IDNO:35)并且CDR2是氨基酸序列DISPGGHT(SEQIDNO:63)(其中CDR3如在上述f)下 定義的）；和/或CDR1是氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQIDNO:35)并且CDR3是氨基酸序列 RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)(其中CDR2如在上述e)下定義的）；和/或CDR2是氨基酸序 列DISPGGHT(SEQIDNO:63)并且CDR3 是RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91)(其中CDR1 如在上 述d)下定義的）。同樣，在此種1C113-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述 1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測 定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì) 胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0323] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0324] 在特別優(yōu)選的1C113-樣序列中：⑶R1是氨基酸序列IAFNYYSMS，⑶R2是氨基酸序 列DISPGGHT(SEQIDN0:63);并且CDR3 是氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQIDN0:91)。
[0325] 在該部分C)中描述的所有1C113-樣序列中，構(gòu)架序列可以如本文中進一步描述 的。優(yōu)選地，所述構(gòu)架序列是這樣：所述構(gòu)架序列與1C113的構(gòu)架序列具有至少80%，諸 如至少85%，例如至少90%，諸如至少95%序列同一性（所述序列同一性，例如，可以 通過確定給定序列與1C113的序列的序列同一性的整體程度同時在計算中忽略CDR's來確 定）。同樣，存在于給定序列中的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的1C113-樣ISV具 有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如， 例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如 諸如本文中描述的）。
[0326] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0327]在一個特定的方面，1C113-樣序列是與SEQIDNO:6具有至少70%，諸如至少 80%，例如至少85%，諸如至少90%或大于95%序列同一性的ISV。例如，在根據(jù)此方 面的1C113-樣序列中，CDR's可以根據(jù)上文描述的具體優(yōu)選的方面，并且可以尤其（但 不受限制）是IAFNYYSMS(SEQIDN0:35)(CDR1) ;DISPGGHT(SEQIDN0:63)(CDR2);和 RLRFEVSSNY(SEQIDNO:91) (CDR3)。同樣，優(yōu)選地，存在于此種 1C113-樣ISV的CDR's和 構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的1C113-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸 如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0328] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)活性通過基于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的測定中ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落確 定；或通過由人T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸（PS)外化確定；或通過由人T細(xì)胞 產(chǎn)生的ATP-誘導(dǎo)的⑶62L脫落（PS)確定；或通過阻止RPMI8226細(xì)胞的P2X7-介導(dǎo)的細(xì) 胞死亡確定。
[0329] 在一個特定的方面，任意1C113-樣序列可以是人源化和/或序列優(yōu)化的序列， 如本文中進一步描述的。
[0330] D)13A7-樣序列："13A7-樣序列"," 13A7-樣ISV"或" 13A7-樣結(jié)構(gòu)單元"被定 義為包含以下的ISV(如本文中描述的）：
[0331] a)⑶R1，所述⑶R1包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列YYDIG(SEQID NO:47)或（ii)與氨基酸序列YYDIG(SEQIDNO:47)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本 文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0332] b)⑶R2,所述⑶R2包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列 CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDN0:75)或（ii)與氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO: 75)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列； 或（iii)與氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或 1 個氨 基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0333] c)⑶R3,所述⑶R3包含以下或基本上由以下組成：⑴氨基酸序列 GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103)或（ii)與氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQID NO:103)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸 序列；或（iii)與氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0334] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（如本領(lǐng)域中已知的）， 通過基于細(xì)胞的測定（如本領(lǐng)域中已知的），通過體內(nèi)測定。
[0335] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0336] 優(yōu)選地，在此種13A7-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的；或 CDR1和CDR3分別如在a)和c)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的。更 優(yōu)選地，在此種13A7-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在a)，b)和c)下定義的。 同樣，在此種13A7-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié) 活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如， 通過Alphascreen測定）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0337] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0338] 例如，在此種13A7-樣序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列YYDIG(SEQIDNO:47)(其中CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的）；和/或CDR2 可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)(其 中⑶R1和⑶R3分別如在a)和c)下定義的）；和/或⑶R3可以包含以下或基本上由以下 組成：氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103)(其中CDR1和CDR2分別如在a) 和b)下定義的）。特別是，當(dāng)13A7-樣序列根據(jù)此方面時：CDR1可以包含以下或基本上由 以下組成：氨基酸序列YYDIG(SEQIDN0:47)并且⑶R2可以包含以下或基本上由以下組 成：氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)(其中CDR3如在上述c)下定義的）； 和/或⑶R1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列YYDIG(SEQIDN0:47)并且 ⑶R3可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO: 103)(其中⑶R2如在上述b)下定義的）；和/或⑶R2可以包含以下或基本上由以下組成： 氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下 組成：氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103)(其中CDR1如在上述a)下定義 的）。同樣，在此種13A7-樣序列中，CDR1，CDR2和CDR3優(yōu)選為這樣：所述13A7-樣ISV具 有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如， 例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如 諸如本文中描述的）。
[0339] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0340] 在特別優(yōu)選的方面，"13A7-樣序列"，"13A7-樣ISV"或"13A7-樣結(jié)構(gòu)單元"是 包含以下的ISV:
[0341] d)CDRl，所述CDR1是⑴氨基酸序列YYDIG(SEQ IDNO:47)或（ii)與氨基酸序 列YYDIG(SEQ IDNO:47)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序 列；和/或
[0342]e)CDR2,所述CDR2 是⑴氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75) 或（ii)與氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)具有至少80 %，諸如至 少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列 CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定 義的）的氨基酸序列；和/或
[0343]f)CDR3,所述CDR3 是⑴氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103) 或（ii)與氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDN0:103)具有至少80%，諸如至 少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列 GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中 定義的）的氨基酸序列；
[0344] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述 的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0345] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0346] 優(yōu)選地，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的13A7-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在d)和 e) 下定義的；或CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在e)和 f) 下定義的。更優(yōu)選，在此種13A7-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在d)，e) 和f)下定義的。同樣，在此種13A7-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：13A7-樣 ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定， 諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定 (例如諸如本文中描述的）。
[0347] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0348] 例如，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的13A7-樣序列中：CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQ IDNO:47)(其中CDR2和CDR3分別如在e)和f)下定義的）；和/或CDR2是氨基酸序列 CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)(其中CDR1 和CDR3 分別如在d)和f)下定義的）； 和/或CDR3是氨基酸序列GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQID勵：103)(其中〇?1和〇)1?2分 別如在d)和e)下定義的）。特別是，當(dāng)13A7-樣序列根據(jù)此方面時：CDR1是氨基酸序列 YYDIG(SEQIDN0:47)并且CDR2 是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(其中CDR3 如在上述 f)下定義的）；和/或CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQIDNO:47)并且CDR3是氨基酸序列 GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO: 103)(其中CDR2 如在上述e)下定義的）；和 / 或CDR2 是 氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75)并且CDR3 是GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQID NO:103)(其中⑶R1如在上述d)下定義的）。同樣，在此種13A7-樣序列中，⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中 描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0349] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0350] 在特別優(yōu)選的13A7-樣序列中：CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQIDNO: 47)，CDR2是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDN0:75);并且CDR3是氨基酸序列 GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDN0:103)。
[0351] 在該部分D)中描述的所有13A7-樣序列中，所述構(gòu)架序列可以是如本文中進 一步描述的。優(yōu)選地，所述構(gòu)架序列是這樣，所述構(gòu)架序列與13A7的構(gòu)架序列具有至少 80%，諸如至少85%，例如至少90%，諸如至少95%序列同一1性（所述序列同一'性， 例如，可以通過確定給定序列與13A7的序列的序列同一性的整體程度同時在計算中忽 略CDR's來確定）。同樣，存在于給定序列中的CDR's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的 13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測 定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì) 胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0352] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0353]在一個特定的方面，13A7-樣序列是與SEQIDNO:6具有至少70%，諸如至少 80%，例如至少85%，諸如至少90%或大于95%序列同一性的ISV。例如，在根據(jù)此方 面的13A7-樣序列中，CDR's可以根據(jù)上文描述的具體優(yōu)選的方面，并且可以尤其（但不 受限制）是YYDIG(SEQIDNO:47) (CDR1);
[0354]CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQIDNO:75) (CDR2);和
[0355]GPLTKRRQCVP⑶FSMDF(SEQIDNO:103) (CDR3)。同樣，優(yōu)選地，存在于此種 13A7-樣ISV中的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選是這樣：產(chǎn)生的13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性， 所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過 Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描 述的）。
[0356] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性由來自用13A7-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2.3中描述的。優(yōu)選 地，所述13A7-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0357] 在一個特定的方面，任何13A7-樣序列可以是人源化和/或序列優(yōu)化的序列，如 本文中進一步描述的。
[0358]E)14D5-樣序列："14D5-樣序列"," 14D5-樣ISV"或" 14D5-樣結(jié)構(gòu)單元"被定 義為包含以下的ISV(如本文中描述的）：
[0359]a)⑶R1，所述⑶R1包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列SYAMG(SEQID NO:46)或（ii)與氨基酸序列SYAMG(SEQIDNO:46)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本 文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0360]b)⑶R2,所述⑶R2包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列 RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDN0:74)或（ii)與氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO: 74)具有至少80%，諸如至少85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列； 或（iii)與氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)僅具有 7, 6, 5, 4, 3, 2 或 1 個氨 基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；和/或
[0361]c)⑶R3,所述⑶R3包含以下或基本上由以下組成：（i)氨基酸序列RVRYDY(SEQID NO:102)或（ii)與氨基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)具有至少80%，諸如至少85%， 例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列RVRYDY僅具 有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0362] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（如本領(lǐng)域中已知的）， 通過基于細(xì)胞的測定（如本領(lǐng)域中已知的），通過體內(nèi)測定。
[0363] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0364] 優(yōu)選地，在此種14D5-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的；或 CDR1和CDR3分別如在a)和c)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在b)和c)下定義的。更 優(yōu)選地，在此種14D5-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在a)，b)和c)下定義的。 同樣，在此種14D5-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié) 活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如， 通過Alphascreen測定）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0365] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0366] 例如，在此種14D5-樣序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸 序列SYAMG(SEQIDNO:46)(其中⑶R2和⑶R3分別如在b)和c)下定義的）；和/或⑶R2 可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)(其中 ⑶R1和⑶R3分別如在a)和c)下定義的）；和/或⑶R3可以包含以下或基本上由以下組成： 氨基酸序列RVRYDY(其中⑶R1和⑶R2分別如在a)和b)下定義的）。特別是，當(dāng)14D5-樣 序列根據(jù)此方面時：CDR1可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列SYAMG(SEQID NO:46)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ IDN0:74)(其中⑶R3如在上述c)下定義的）；和/或⑶R1可以包含以下或基本上由以下 組成：氨基酸序列SYAMG(SEQIDNO:46)并且⑶R3可以包含以下或基本上由以下組成：氨 基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)(其中CDR2如在上述b)下定義的）；和/或CDR2可以 包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDN0:74)并且CDR3 可以包含以下或基本上由以下組成：氨基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)(其中⑶R1如在 上述a)下定義的）。同樣，在此種14D5-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3優(yōu)選為這樣：所述 14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測 定確定，諸如，例如，通過A lphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì) 胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0367] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0368] 在特別優(yōu)選的方面，"14D5-樣序列"，"14D5-樣ISV"或"14D5-樣結(jié)構(gòu)單元"是 包含以下的ISV:
[0369]d)CDRl，所述CDR1是⑴氨基酸序列SYAMG(SEQIDNO:46)或（ii)與氨基酸序 列SYAMG(SEQIDNO:46)僅具有3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序 列；和/或
[0370]e)CDR2，所述CDR2 是⑴氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74) 或（ii)與氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDN0:74)具有至少80%，諸如至少 85%，例如至少90%或大于95%序列同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列 RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2或1個氨基酸差異（如本文中定 義的）的氨基酸序列；和/或
[0371]f)CDR3,所述CDR3是（i)氨基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)或（ii)與氨基酸序 列RVRYDY(SEQIDNO: 102)具有至少80%,諸如至少85%,例如至少90%或大于95%序列 同一性的氨基酸序列；或（iii)與氨基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)僅具有7, 6, 5, 4, 3, 2 或1個氨基酸差異（如本文中定義的）的氨基酸序列；
[0372] 其中存在于此種ISV中的構(gòu)架序列如本文中進一步描述，并且其中⑶R1，⑶R2和 ⑶R3優(yōu)選為這樣：14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述 的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0373] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0374] 優(yōu)選地，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的14D5-樣序列中，⑶R1和⑶R2分別如在d)和 e) 下定義的；或CDR1和CDR3分別如在d)和f)下定義的；或CDR2和CDR3分別如在e)和 f) 下定義的。更優(yōu)選，在此種14D5-樣序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3分別全部如在d)，e)和 f)下定義的。同樣，在此種14D5-樣序列中，CDR1，CDR2和CDR3,優(yōu)選為這樣：所述14D5-樣 ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定， 諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定 (例如諸如本文中描述的）。
[0375] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0376] 例如，在根據(jù)該具體優(yōu)選方面的14D5-樣序列中：⑶R1是氨基酸序列SYAMG(SEQ IDNO:46)(其中CDR2和CDR3分別如在e)和f)下定義的）；和/或CDR2是氨基酸序列 RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)(其中CDR1 和CDR3 分別如在d)和f)下定義的）；和 /或CDR3是氨基酸序列RVRYDY(SEQIDNO:102)(其中CDR1和CDR2分別如在d)和e)下 定義的）.特別是，當(dāng)14D5-樣序列根據(jù)此方面時：⑶R1是氨基酸序列SYAMG(SEQIDNO: 46)并且CDR2是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)(其中CDR3如在上述f) 下定義的）；和/或⑶R1是氨基酸序列SYAMG(SEQIDN0:46)并且⑶R3是氨基酸序列 RVRYDY(SEQIDNO:102)(其中CDR2如在上述e)下定義的）；和/或CDR2是氨基酸序列 RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)并且CDR3 是RVRYDY(其中CDR1 如在上述d)下定義 的）。同樣，在此種14D5-樣序列中，CDR1，CDR2和CDR3優(yōu)選為這樣：所述14D5-樣ISV具 有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如， 例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如 諸如本文中描述的）。
[0377] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0378] 在特別優(yōu)選的14D5-樣序列中：CDR1是氨基酸序列SYAMG(SEQIDNO:46)，CDR2 是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDN0:74);并且CDR3是氨基酸序列RVRYDY(SEQID NO：102)〇
[0379] 在此部分E)中描述的所有14D5-樣序列中，所述構(gòu)架序列可以是如本文中進 一步描述的。優(yōu)選地，所述構(gòu)架序列是這樣：所述構(gòu)架序列與14D5的構(gòu)架序列具有至少 80%，諸如至少85%，例如至少90%，諸如至少95%的序列同一性（所述序列同一性，例 如，可以通過確定給定序列與14D5的序列的序列同一性整體程度同時在計算中忽略CDR's 確定）。同樣，存在于給定序列中的⑶R's和構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的14D5-樣ISV 具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸 如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例 如諸如本文中描述的）。
[0380] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0381]在一個特定的方面，14D5-樣序列是與SEQIDNO:6具有至少70%，諸如至少 80%，例如至少85%，諸如至少90%或大于95%序列同一性的ISV。例如，在根據(jù)此方 面的14D5-樣序列中，CDR's可以根據(jù)上文描述的具體優(yōu)選的方面，并且可以尤其（但不 受限制）是SYAMG(SEQIDN0:46)(CDR1) ;MYTGGTAWYEDSVKG(SEQIDNO:74)(CDR2);和 RVRYDY(SEQIDNO:102) (CDR3)。同樣，優(yōu)選地，存在于此種14D5-樣ISV中的CDR's和 構(gòu)架的組合優(yōu)選為這樣：產(chǎn)生的14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性可以通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的任意合適的測定確定，諸如，例如，通過Alphascreen測定（例如諸 如本文中描述的）或通過基于細(xì)胞的測定（例如諸如本文中描述的）。
[0382] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)活性通過來自用14D5-樣ISVs注射的小鼠的脾和肝細(xì)胞中 ATP-誘導(dǎo)的CD27脫落或PS外化的調(diào)節(jié)來確定，例如，諸如在實施例2. 2中描述的。優(yōu)選 地，所述14D5-樣ISV具有調(diào)節(jié)活性，所述調(diào)節(jié)活性在實施例3中描述的抗-足細(xì)胞誘導(dǎo) 的腎炎模型中確定。
[0383] 在一個特定的方面，任何14D5-樣序列可以是人源化和/或序列優(yōu)化的序列，如 本文中進一步描述的。
[0384] 如在實施例1. 5中描述的，本發(fā)明的ISVs可以通過如本文中描述的交叉-阻斷 分析被分為不同表位箱或家族。組AISVs以lc81-樣ISVs和lcll3-樣ISVs為代表，而 組BISVs以3c23-樣ISVs為代表。
[0385] 如在實施例1. 4中描述的，本發(fā)明的ISVs可以基于交叉反應(yīng)性的存在或缺失被 分類?！ㄈ颂禺惖摹↖SVs以3c23-樣ISVs和lcll3-樣ISVs為代表；〃人/大鼠/小鼠-特 異的〃ISVs以lc81-樣ISVs為代表；〃小鼠-特異的"ISVs以13A7-樣ISVs和14D5-樣 ISVs為代表。
[0386] 通常，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（尤其是VHH序列和序列優(yōu)化的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域）可以尤其特征在于在一個或多個構(gòu)架序列（同樣如本文中進一步描述的）中存 在一個或多個"特征殘基"（如本文中描述的）。
[0387] 因此，通常，疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以被定義為具有以下（通用）結(jié)構(gòu)的氨基 酸序列
[0388] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0389] 其中FR1至FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1至4,并且其中⑶R1至⑶R3分別是指互補決 定區(qū)1至3。
[0390] 在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供包含至少一個具有以下（通用）結(jié)構(gòu)的氨基酸序列的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽
[0391] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0392] 其中FR1至FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1至4,并且其中⑶R1至⑶R3分別是指互補決 定區(qū)1至3,并且其中：
[0393]i)至少一個根據(jù)Kabat編號方法在位置 11，37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 和 108 的氨基酸殘基選自在以下表A-1中提到的特征殘基；并且其中：
[0394]ii)所述氨基酸序列與在WO2009/138519顯示的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（參見 WO2009/138519中SEQIDNOs:1至125)中的至少一個具有至少80%，更優(yōu)選90%，甚 至更優(yōu)選95%的氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度，忽略形成CDR序列的氨 基酸殘基（在序列中以X表示）；并且其中：
[0395]iii)⑶R序列通常如本文中進一步限定的（例如在表（B-2)中提供的組合中的 ⑶R1，⑶R2和⑶R3,注意：⑶R定義根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)計算）。
[0396] 表A-1 :VHHs中的特征殘基

【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療P2X7相關(guān)疾病的包含至少一個能夠以小于50nM的Kd結(jié)合P2X7的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯬2X7的結(jié)合抑 制P2X7的活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述P2X7相關(guān)疾病選自由以下組成的組： MS，IBD，神經(jīng)病性疼痛，癲癇，卒中，糖尿病，高血壓和癌癥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述P2X7是人P2X7。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2 和 / 或 SEQ ID NO :3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的多肽，其中至少一個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包 含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);其中FR1至FR4是指構(gòu)架區(qū) 1至4并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)（FRs);并且 -其中⑶R1選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :34-47, -與SEQ ID NOs :34-47具有至少80%氨基酸同一性的多肽，和 -與SEQ ID NOs :34-47具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；并且 -其中⑶R2選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :62-75 ； -與SEQ ID NOs :62-75具有至少80%氨基酸同一性的多肽；和 -與SEQ ID NOs :62-75具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；并且 -其中⑶R3選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :90-103 ； -與SEQ ID NOs :90-103具有至少80%氨基酸同一性的多肽；和 -與SEQ ID NOs :90-103具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述構(gòu)架區(qū)（FRs)與SEQ ID NOs :6-19的FRs具 有大于80%的序列同一性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的多肽，其中至少一個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組，其中： -CDR1 是 SEQ ID NO :34, CDR2 是 SEQ ID NO :62 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :90 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :35, CDR2 是 SEQ ID NO :63 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :91 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :40, CDR2 是 SEQ ID NO :68 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :96 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :36, CDR2 是 SEQ ID NO :64 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :92 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :37, CDR2 是 SEQ ID NO :65 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :93 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :38, CDR2 是 SEQ ID NO :66 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :94 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :39, CDR2 是 SEQ ID NO :67 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :95 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :41, CDR2 是 SEQ ID NO :69 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :97 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :42, CDR2 是 SEQ ID NO :70 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :98 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :43, CDR2 是 SEQ ID NO :71 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :99 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :44, CDR2 是 SEQ ID NO :72 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :100 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :45, CDR2 是 SEQ ID NO :73 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :101 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :46, CDR2 是 SEQ ID NO :74 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :102 ;并且 -CDR1 是 SEQ ID NO :47, CDR2 是 SEQ ID NO :75 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :103。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的組， 所述多肽包含具有與SEQ ID NOs :6-19具有大于80%的序列同一性的氨基酸序列的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的組， 所述多肽包含具有與SEQ ID NOs :6-19具有大于90%的序列同一性的氨基酸序列的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的多肽，所述多肽包含至少兩個能夠結(jié)合P2X7的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其中至少兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含式1的 氨基酸序列疋1?1-〇)1?141?2-〇)1?241?3-〇)1?341?4(1);其中？1?1至？1?4是指構(gòu)架區(qū)1至4并 且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)（FRs);并且 -其中⑶R1選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :34-47, -與SEQ ID NOs :34-47具有至少80%氨基酸同一性的多肽，和 -與SEQ ID NOs :34-47具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；并且 -其中⑶R2選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :62-75 ； -與SEQ ID NOs :62-75具有至少80%氨基酸同一性的多肽；和 -與SEQ ID NOs :62-75具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽；并且 -其中⑶R3選自由以下組成的組： -SEQ ID NOs :90-103 ； -與SEQ ID NOs :90-103具有至少80%氨基酸同一性的多肽；和 -與SEQ ID NOs :90-103具有3, 2,或1個氨基酸差異的多肽。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述構(gòu)架區(qū)（FRs)具有與SEQ ID NOs :6-19的 FRs大于80%的序列同一性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的多肽，其中至少兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組，其中： -CDR1 是 SEQ ID NO :34, CDR2 是 SEQ ID NO :62 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :90 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :35, CDR2 是 SEQ ID NO :63 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :91 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :40, CDR2 是 SEQ ID NO :68 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :96 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :36, CDR2 是 SEQ ID NO :64 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :92 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :37, CDR2 是 SEQ ID NO :65 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :93 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :38, CDR2 是 SEQ ID NO :66 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :94 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :39, CDR2 是 SEQ ID NO :67 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :95 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :41, CDR2 是 SEQ ID NO :69 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :97 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :42, CDR2 是 SEQ ID NO :70 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :98 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :43, CDR2 是 SEQ ID NO :71 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :99 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :44, CDR2 是 SEQ ID NO :72 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :100 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :45, CDR2 是 SEQ ID NO :73 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :101 ; -CDR1 是 SEQ ID NO :46, CDR2 是 SEQ ID NO :74 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :102 ;并且 -CDR1 是 SEQ ID NO :47, CDR2 是 SEQ ID NO :75 ;并且 CDR3 是 SEQ ID NO :103。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的 組，所述多肽包含各自具有與SEQ ID NOs :6-19具有大于80%的序列同一性的氨基酸序列 的至少兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的 組，所述多肽包含各自具有與SEQ ID NOs :6-19具有大于90%的序列同一性的氨基酸序列 的至少兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10至15任一項所述的多肽，所述多肽包含至少兩個能夠結(jié)合P2X7 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個能夠結(jié)合P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域可以相同或不同。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項所述的多肽，所述多肽還包含結(jié)合人血清白蛋白的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如例如Alb8(SEQ ID N0:126)或Albll(SEQ ID N0:125)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的 組，所述多肽具有與SEQ ID NOs :118-124具有大于80%的序列同一性的氨基酸序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由以下多肽組成的 組，所述多肽具有與SEQ ID NOs :118-124具有大于90%的序列同一性的氨基酸序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項所述的多肽，其中所述多肽選自由SEQ ID NOs: 118-124組成的組。
21. -種多肽，所述多肽包含至少兩個針對P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中 a) 至少一個第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對P2X7的第一抗原決定簇，表位，部分， 結(jié)構(gòu)域，亞單位或構(gòu)象；并且其中， b) 至少一個第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對所述P2X7的分別不同于所述第一抗原 決定簇表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞單位或構(gòu)象的第二抗原決定簇，表位，部分，結(jié)構(gòu)域，亞 單位或構(gòu)象。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域由以 下組成：結(jié)構(gòu)域抗體，適于用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，單結(jié)構(gòu)域抗體，適于用作單結(jié) 構(gòu)域抗體的氨基酸序列，dAb，適于用作dAb的氨基酸序列，納米抗體，VHH序列，人源化 VHH序列或駱駝源化VH序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多肽，其中Alphascreen測定中的IC50是 30nM或更低。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項所述的多肽，其中Alphascreen測定中的IC50是3nM 或更低。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項所述的多肽，所述多肽還包含藥用賦形劑。
26. -種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至25任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包含以下 步驟： a)在合適的宿主細(xì)胞或宿主生物中或在另一個合適的表達系統(tǒng)中表達編碼根據(jù)權(quán)利 要求1至25任一項所述的多肽的核酸或核苷酸序列；任選地接著： b)分離和/或純化所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或所述多肽。
27. 篩選針對P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID N0s:l-3)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的 方法，所述方法包括至少以下步驟： a) 提供免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫；并且 b) 從所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫中篩選能夠結(jié)合P2X7和尤其是 人P2X7(SEQ ID NOs :1-3)和/或?qū)2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NOs :1-3)具有親和力 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；并且 c) 分離能夠結(jié)合P2X7和尤其是人P2X7 (SEQ ID NO : 1-3)和/或?qū)2X7和尤其是人 P2X7(SEQ ID N0:l-3)具有親和力的氨基酸序列。
28. -種能夠以小于50nM的Kd結(jié)合P2X7的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與所述P2X7的結(jié)合抑制P2X7的活性。
【文檔編號】C07K14/705GK104507964SQ201380040371
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月1日
【發(fā)明者】韋爾貝克·奧烏蘇丹夸, 弗里德里?！ぶZ爾特, 卡特林恩·斯托特勒斯, 圖恩·萊瑞曼斯 申請人:埃博靈克斯股份有限公司