人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人乳頭瘤病毒（HPV）L1蛋白的高純度和高效提純方法。根據(jù)所述提純方法，當(dāng)利用還原劑處理細(xì)胞勻漿而形成加熱/冷卻的時(shí)候，所提純的HPV L1蛋白的純度和產(chǎn)率大大地提高。此外，通過(guò)所述提純方法提純的HPV L1蛋白的VLP具有極佳的抗原性和免疫原性。
【專利說(shuō)明】人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有極佳的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性的人乳頭瘤病毒（HPV)的病毒樣顆粒 (VLP)的高效提純方法。

【背景技術(shù)】
[0002] HPV為引起約100%宮頸癌的病原體[1]。據(jù)報(bào)道，全世界每年有500,000位女 性被診斷患有宮頸癌，并且250, 000位女性死于宮頸癌[2]。16、18、45、31、33、52、58、35 和59型被認(rèn)為是為導(dǎo)致宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)類型的HPV，而6和11型被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)類型的 HPV[3, 4]。特別地，HPV16和HPV18被認(rèn)為導(dǎo)致全部宮頸癌的70 %，并且因此被認(rèn)為是是預(yù) 防宮頸癌的最重要類型[5]。導(dǎo)致宮頸癌的HPV類型不同地區(qū)而有所不同[5]。在非洲、歐 洲、北美以及中南美洲，HPV16、HPV18、HPV31和HPV45感染為宮頸癌的主要原因，在亞洲， HPV16、HPV18、HPV58和HPV33感染為宮頸癌的主要原因[5]。
[0003] HPV的衣殼由作為主要抗原的L1蛋白和作為次要抗原的L2蛋白組成[6]。在 這里，L1蛋白已被用作用于預(yù)防宮頸癌的疫苗的抗原和用于診斷宮頸癌的抗原，因?yàn)槠渚?有自組裝形成病毒樣顆粒（VLP)的特性[6,27]。重組L1蛋白在大腸桿菌（Escherichia coli)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母（PichiaPastoris)、干酪乳桿 菌（Lactobacilluscasei)或草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda，Sf)細(xì)胞，或者植物 細(xì)胞中作為表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)[7-12,28]。目前，商用宮頸癌疫苗為GardaSilTM(Merck)和 Cervarix?(GlaxosmithKline，GSK)。Gardasil?包括HPV16、HPV18、HPV6 和HPV11 作為抗 原的L1VLP，并且Cervarix?包括HPV16 和HPV18 作為抗原的L1VLP[13]。Gardasil?使用 釀酒酵母作為抗原表達(dá)細(xì)胞，Cervarix?使用草地貪夜蛾（Sf)細(xì)胞作為抗原表達(dá)細(xì)胞，其 為昆蟲(chóng)細(xì)胞[13, 14]。兩種疫苗均通過(guò)肌肉注射而被注射，并且具有每劑120美元的高成 本，三劑需要360美元[15]。由于商用宮頸癌疫苗的注射成本高，所述疫苗在發(fā)展中國(guó)家的 廣泛使用受到許多限制，而宮頸癌主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家中[16]。據(jù)此，低成本和高效的宮 頸癌疫苗的研發(fā)就仍將是一個(gè)重要的課題。
[0004] 在使用重組蛋白的藥物中，下游加工成本高至總制造成本的80% [17]。為了制造 用于宮頸癌疫苗的抗原，使用了通過(guò)在下游加工中的數(shù)個(gè)提純步驟來(lái)提高目標(biāo)抗原純度的 方法[18]。在釀酒酵母中生產(chǎn)VLP的情況中，為了提高目標(biāo)蛋白的純度，主要使用蔗糖墊 層超速離心或排阻層析。為了提純VLP，Hofmann等使用蔗糖墊層超速離心、陰離子交換層 析、硫酸銨沉淀和排阻層析[19]。Kim等相繼地使用蔗糖墊層超速離心、排阻層析和陽(yáng)離子 交換層析來(lái)提純VLP[7]。Park等使用的提純方法包括硫酸銨沉淀、排阻層析和陽(yáng)離子交換 層析，其被相繼地執(zhí)行[20]。根據(jù)所述方法，可以獲得高純度VLP，但是所述方法會(huì)限制提 純裝置的增大，并且不適用于在大規(guī)模生產(chǎn)中使用。
[0005] 對(duì)于由釀酒酵母制造的HPV的VLP的大規(guī)模生產(chǎn)，使用如下的方法。Cook等使用 的方法中，相繼地使用交叉微流量過(guò)濾、陽(yáng)離子交換層析和羥磷灰石層析[21]。Kim等使用 的方法中，在外來(lái)的蛋白通過(guò)硫酸銨沉淀而被清除以及清除沉淀的污染物的步驟之后，通 過(guò)肝素層析或陽(yáng)離子交換層析來(lái)提純VLP[22]。由釀酒酵母制造的HPVL1蛋白共計(jì)不超過(guò) 全部已知?jiǎng)驖{蛋白的1%，并且其回收并不容易[20]。為了提純通過(guò)制備高純度重組蛋白 的方法來(lái)制造的HPVVLP，應(yīng)當(dāng)執(zhí)行數(shù)個(gè)沉淀和層析步驟，并且也需要反復(fù)透析。此外，因?yàn)?HPV的VLP容易分解，所以VLP在極佳結(jié)構(gòu)中的組裝就被認(rèn)為是非常重要的[31]。雖然研 宄人員已經(jīng)付諸了大量的努力來(lái)研發(fā)在宿主細(xì)胞的勻漿、例如酵母表達(dá)系統(tǒng)中有效地清除 外來(lái)物質(zhì)的方法，但是用于高效提純VLP的技術(shù)尚未被明確地推進(jìn)。
[0006] 縱觀全文，多個(gè)公開(kāi)物和專利文獻(xiàn)已被涉及，并表述了對(duì)其的引用。所引用的公開(kāi) 物和專利文獻(xiàn)的內(nèi)容作為參考而被引入至本文，并且由此包括本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】的程度以 及本發(fā)明的內(nèi)容會(huì)被更加清楚地解釋。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問(wèn)題
[0008] 本發(fā)明人付諸了大量的努力來(lái)研發(fā)提純由表達(dá)HPVL1蛋白的宿主細(xì)胞制造的HPV L1蛋白的新的高純度和高效的方法。因此，當(dāng)HPVL1蛋白通過(guò)包括利用還原劑來(lái)處理表達(dá) HPVL1蛋白的宿主細(xì)胞的勻漿的層析而被提純的時(shí)候，或者利用還原劑處理勻漿并執(zhí)行加 熱和冷卻的時(shí)候，HPVL1蛋白的純度就可被顯著地提高，并且由L1蛋白組裝的VLP的結(jié)構(gòu) 和免疫學(xué)特性也可被顯著地增強(qiáng)，其通過(guò)實(shí)驗(yàn)而被確認(rèn)，并且本發(fā)明因此而被完成。
[0009] 據(jù)此，本發(fā)明涉及提供一種HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。
[0010] 本發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)本發(fā)明的詳細(xì)描述的說(shuō)明書、權(quán)利要求和附圖而變得 更加清晰。
[0011] 技術(shù)方案
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種HPVL1蛋白的提純方法，包括：(a)培 育表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，收獲所培育的宿主細(xì)胞，并使所述細(xì)胞破碎；(b)將 還原劑添加至宿主細(xì)胞的勻漿；和（c)通過(guò)對(duì)添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿執(zhí)行層析來(lái)提 純HPVL1蛋白。
[0013] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了一種HPVL1蛋白的提純方法。所述方法包括 (i) 培育表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，收獲所培育的宿主細(xì)胞，并使所述細(xì)胞破碎； (ii) 將還原劑添加至宿主細(xì)胞的勻漿；（iii)加熱和冷卻添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿； 和（iv)通過(guò)對(duì)加熱和冷卻的宿主細(xì)胞的勻漿執(zhí)行層析來(lái)提純HPVL1蛋白。
[0014] 通過(guò)努力研發(fā)由經(jīng)制備以表達(dá)HPVL1蛋白的宿主細(xì)胞制造的HPVL1蛋白的新的 高純度和高效提純方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)表達(dá)HPVL1蛋白的宿主細(xì)胞的勻漿利用還原劑 處理之后，或者利用還原劑處理之后勻漿被加熱并冷卻，HPVL1蛋白通過(guò)層析而被提純的 時(shí)候，HPVL1蛋白的純度被顯著地提高，并且由L1蛋白組裝的VLP的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性會(huì) 變?yōu)闃O佳的，并且由此本發(fā)明被完成。
[0015] 在下文，本發(fā)明將通過(guò)如下的操作而被詳細(xì)地描述：
[0016] (i)培育表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，收獲所培育的宿主細(xì)胞，并使所述 細(xì)胞破碎的操作
[0017] 在這里使用的術(shù)語(yǔ)"HPVL1蛋白"涉及構(gòu)成HPV衣殼的主要蛋白，其由HPV的L1 基因表達(dá)。L1蛋白可以單獨(dú)地自組裝為VLP，或者與次要蛋白、L2蛋白一起構(gòu)成衣殼。
[0018] 乳頭瘤病毒為二十面體DNA基因組病毒，其具有最多8個(gè)早期基因（E)和2個(gè)晚 期基因（L)，和50至60nm的尺寸，并且無(wú)外殼。在基因E中，"E"表示早期，并且在基因L 中，"L"表示晚期。E基因?yàn)閰⑴c病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)化的基因。L1和L2基因編碼病毒衣殼蛋白。 L1蛋白為主要衣殼蛋白，并且具有55至60kDa的分子量。L2蛋白為次要衣殼蛋白，估算具 有55至60kDa的分子量以及75至lOOkDa的表觀分子量，通過(guò)PAGE測(cè)量。
[0019] 在本發(fā)明的方法中，L1蛋白由其衍生的HPV的類型可以選自但不是特別地限定于 由HPV6a型、HPV6b型、HPV11 型、HPV16 型、HPV18 型、HPV30 型、HPV31 型、HPV33 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV41 型、HPV42 型、HPV43 型、HPV44 型、HPV45 型、HPV51 型、HPV52 型、 HPV54型、HPV55型、HPV56型、HPV58型、HPV68型和HPV70型構(gòu)成的組，并且更優(yōu)選 地，本發(fā)明的L1蛋白可以衍生自選自由HPV6a型、HPV6b型、HPV11型、HPV16型、HPV18 型、HPV31型、HPV33型、HPV45型和HPV58型構(gòu)成的組的HPV，并且最優(yōu)選地，衍生自HPV 16 型、HPV18 型或HPV58 型。
[0020] 在本發(fā)明中，用作宿主細(xì)胞的細(xì)胞為細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物 細(xì)胞。
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明示例性的實(shí)施方式，酵母細(xì)胞為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母（Saccharomycespastorianus)、酵母菌（Saccharomycessp.)、 栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、畢赤酵母（PichiaPastoris)或多形漢遜酵 母（Hansenulapolymorpha)〇
[0022] 在本發(fā)明中，表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為由成功表達(dá)HPVL1蛋白的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體可以包括現(xiàn)有技術(shù)已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或翻譯調(diào)節(jié)因 子，或標(biāo)記基因。本發(fā)明的表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方 法容易地制備。
[0023] (ii)將還原劑添加至宿主細(xì)胞勻漿的操作
[0024] 在這里使用的術(shù)語(yǔ)"還原劑"涉及在還原_氧化反應(yīng)中將電子貢獻(xiàn)給其它形態(tài) (species)的元素或化合物，并且優(yōu)選地，用于減少肽或蛋白質(zhì)中的二硫鍵，或者穩(wěn)定游離 的巰基基團(tuán)的化合物。
[0025] 在本發(fā)明中，還原劑例如選自由巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT)、2_巰基乙 胺-HC1、三（2-羧乙基）磷化氫（TCEP)和半胱氨酸-HC1構(gòu)成的組，并且優(yōu)選為巰基乙 醇或DTT。
[0026] 在本發(fā)明中，還原劑在細(xì)胞勻漿中的最終濃度可以是0.lwt%或更大，優(yōu)選為0. 1 至20wt%，更優(yōu)選為0. 1至10wt%，還更優(yōu)選為1至8wt%，又更優(yōu)選為3至7wt%，并且最 優(yōu)選為4至6wt%。
[0027] 在本發(fā)明中，還原劑與細(xì)胞勻漿的反應(yīng)時(shí)間并不限于特定的時(shí)間范圍，并且本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以選擇適用于本發(fā)明方法的反應(yīng)時(shí)間。
[0028] (iii)加熱和冷卻添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻衆(zhòng)的操作
[0029] 在本發(fā)明中，還原劑被添加至細(xì)胞勻漿，并執(zhí)行加熱和冷卻。如在示例性的實(shí)施方 式中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)的，當(dāng)添加還原劑的細(xì)胞勻漿被加熱和冷卻的時(shí)候，從轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞的勻漿清除雜質(zhì)的效率被顯著地提高，并且由L1蛋白組裝的VLP具有優(yōu)選的結(jié)構(gòu)和免 疫學(xué)特性。
[0030] 在本發(fā)明中，細(xì)胞勻漿的加熱溫度高于室溫，優(yōu)選高于25°C，更優(yōu)選25-80°C，進(jìn) 一步更優(yōu)選為30-65°C，還更優(yōu)選35-65°C，并且最優(yōu)選35-60°C，并且最優(yōu)化的加熱條件為 35-55。。。
[0031] 在本發(fā)明中，細(xì)胞勻漿的加熱時(shí)間可以根據(jù)加熱溫度而變化，并且可以恰當(dāng)?shù)剡x 擇10分鐘至72小時(shí)，但是本發(fā)明并不限于這樣的范圍。加熱時(shí)間優(yōu)選為30分鐘至72小 時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至48小時(shí)，還更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)，并且最優(yōu)選為30分鐘至12 小時(shí)。
[0032] 在本發(fā)明中，冷卻溫度為細(xì)胞勻漿的試樣不會(huì)被凍結(jié)的溫度。這樣的冷卻溫度為 0至10 °C，優(yōu)選0 °C至8 °C，更優(yōu)選0 °C至7 °C，還更優(yōu)選0 °C至6 °C，并且最優(yōu)選0 °C至5 °C。 冷卻時(shí)間可以通過(guò)選擇適用于本發(fā)明方法的冷卻時(shí)間來(lái)使用。
[0033] 同時(shí)，根據(jù)該實(shí)施例，添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿可能不會(huì)被加熱和冷卻，并維 持在室溫。
[0034] 在這里使用的術(shù)語(yǔ)"室溫"為未被加熱或未被冷卻的環(huán)境溫度，其為15°C至25°C。
[0035] (iv)通過(guò)對(duì)添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿或者加熱和冷卻的宿主細(xì)胞勻漿執(zhí)行 層析來(lái)提純HPVL1蛋白的操作
[0036] HPVL1蛋白通過(guò)對(duì)添加還原劑的宿主細(xì)胞勻漿執(zhí)行基于層析的提純而被提純，或 者通過(guò)對(duì)將還原劑添加至勻漿并加熱和冷卻所述勻漿之后在宿主細(xì)胞的勻漿執(zhí)行基于層 析的提純而被提純。
[0037] 在本發(fā)明中，可利用的層析為現(xiàn)有技術(shù)已知的，并且例如可以是但不限于離子交 換層析、例如陽(yáng)離子交換層析或陰離子交換層析，排阻層析（SEC)，疏水作用層析或者親和 層析。在本發(fā)明中，最適用于分離蛋白或肽的離子交換層析為優(yōu)選使用的，因?yàn)閷⒈环蛛x和 提純的物質(zhì)為蛋白。在本發(fā)明示例性的實(shí)施例中，陽(yáng)離子交換層析、肝素樹(shù)脂層析或陽(yáng)離子 交換層析的類型被用于成功地分離和提純HPVL1蛋白。
[0038] 本發(fā)明的特性和優(yōu)點(diǎn)概括如下：
[0039] i)本發(fā)明提供HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。
[0040]ii)本發(fā)明的提純方法的特征在于，在將還原劑添加至表達(dá)HPVL1蛋白的轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的細(xì)胞勻漿之后，或者在利用還原劑處理細(xì)胞勻漿并執(zhí)行加熱和冷卻之后，通過(guò) 層析來(lái)提純L1蛋白。
[0041]iii)根據(jù)本發(fā)明的提純方法，HPVL1蛋白的提純純度可被顯著地提高。
[0042] iv)通過(guò)本發(fā)明的提純方法提純的HPVL1蛋白的VLP形成高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)，并且具 有非常好的免疫原性。
[0043] 有益效果
[0044] 本發(fā)明涉及HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。根據(jù)本發(fā)明的提純方法，HPV L1蛋白的提純純度可被顯著地提高，并且因?yàn)樗峒兊腍PVL1蛋白的VLP形成與原始HPV 病毒粒子更加相似的結(jié)構(gòu)，所以VLP具有非常好的免疫原性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1示出現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中描述的用于提純HPVVLP的方法（在下文被稱為"T-1" 方法），以及本發(fā)明的方法（在下文被稱為"T-5"方法）。涉及T-1方法的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)如 下：
[0046] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)l)KimHJ，KimSY，LimSJ，KimJY，LeeSJ等（2010)0ne-st印 chromatographicpurificationofhumanpapillomavirustype16Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif70:68-74;
[0047] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 2)KimHJ，LimSJ，KimJY，KimSY，KimH-J(2009)Amethodfor removingcontaminatingproteinduringpurificationofhumanpapillomavirustype 18LlproteinfromSaccharomycescerevisiae.ArchPharmRes32:1759-1766;
[0048](現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)3)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請(qǐng)?zhí)枺?10-2011-0137242 (12/19/2011)，登記號(hào)：1011780560000 (08/21/2012);和
[0049](現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)4)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請(qǐng)?zhí)枺?10-2009-0099982(10/20/2009)，登記號(hào)：1011819070000 (09/05/2012)。
[0050] 為了執(zhí)行T-5方法，表達(dá)HPVL1蛋白的宿主細(xì)胞、釀酒酵母被破碎，并隨后將還原 劑添加至細(xì)胞勻漿中。在還原劑被處理之后，進(jìn)行加熱和冷卻以清除雜質(zhì)。清除雜質(zhì)的細(xì) 胞勻漿中包含的L1蛋白通過(guò)肝素層析而被提純。通過(guò)第一提純而被提純的L1蛋白通過(guò)第 二肝素層析而被進(jìn)一步高純度地提純。
[0051] 在T-1方法中，釀酒酵母勻漿中的L1蛋白通過(guò)硫酸銨沉淀而回收?；厥詹糠种械?雜質(zhì)通過(guò)清除所沉淀的污染物而被清除。通過(guò)上述過(guò)程而被加工的勻漿中的L1蛋白通過(guò) 肝素層析而被提純。
[0052] 圖2示出通過(guò)T-5方法獲得的提純結(jié)果，包括表達(dá)L1蛋白的宿主細(xì)胞勻漿的透 析、利用還原劑處理透析的細(xì)胞勻漿并執(zhí)行加熱和冷卻、執(zhí)行第一肝素層析，層析結(jié)果通過(guò) SDS-PAGE來(lái)確認(rèn)。高純度的HPVL1蛋白在第一肝素層析之后被回收。LS表示被負(fù)載至肝 素樹(shù)脂上的負(fù)載試樣，并且FT表示流過(guò)，其為流過(guò)而未結(jié)合至肝素樹(shù)脂的部分。W表示沖 洗，其為流過(guò)的同時(shí)肝素樹(shù)脂被沖洗的部分，并且E表示洗脫，其為HPVL1蛋白利用包括1M NaCl的緩沖溶液而被洗脫的部分。
[0053] 圖3示出通過(guò)T-5方法獲得的提純結(jié)果，包括利用還原劑直接處理表達(dá)HPVL1蛋 白的宿主細(xì)胞勻漿，而不透析細(xì)胞勻漿，執(zhí)行加熱和冷卻，并執(zhí)行第一肝素層析。層析結(jié)果 通過(guò)SDS-PAGE而確定。類似于圖2的結(jié)果，高純度HPVL1蛋白也在第一肝素層析之后獲 得。LS、FT、W和E與在圖2中描述的相同。
[0054] 圖4a示出通過(guò)T-5方法獲得的提純結(jié)果，包括利用還原劑處理表達(dá)HPVL1蛋 白的宿主細(xì)胞勻漿，執(zhí)行加熱和冷卻，執(zhí)行第一肝素層析并執(zhí)行第二肝素層析。結(jié)果通過(guò) SDS-PAGE來(lái)確認(rèn)。LS和FT與在圖2中描述的相同。在SDS-PAGE圖像的上部示出的數(shù)字 3至18表示在使用NaCl的線性梯度洗脫中獲得的各個(gè)部分的數(shù)字。
[0055] 圖4b示出第二肝素層析的圖形。在圖4a的SDS-PAGE的流過(guò)（FT)部分中，未檢 測(cè)到蛋白帶，同時(shí)在圖4b的FT中，確認(rèn)流過(guò)大量的污染物質(zhì)。據(jù)此，圖4b的結(jié)果示出不可 忽視量的污染物質(zhì)通過(guò)第二肝素層析而被清除。
[0056] 圖5示出根據(jù)T-1方法的肝素層析的SDS-PAGE結(jié)果。試樣在肝素層析之前的處理 如在圖1中所示地執(zhí)行。LS表示負(fù)載試樣。結(jié)合至肝素樹(shù)脂的蛋白通過(guò)漸增的NaCl的線性 梯度的方法而被洗脫。進(jìn)行線性梯度洗脫以令NaCl的含量由0. 325M達(dá)到2M。在SDS-PAGE 結(jié)果中，上部的數(shù)字表示洗脫部分的數(shù)字。在部分11至14中示出L1蛋白被高純度地洗脫。
[0057] 圖6a示出通過(guò)傳統(tǒng)方法（T-1方法）和T-5方法提純的VLP的純度的對(duì)比結(jié)果。 "T-1HPV16VLP"為通過(guò)常規(guī)的已知方法提純的產(chǎn)物[Kim等（2010)ProteinExprPurif 70:68-74;Kim等（2009)ArchPharmRes32:1759-1766]，并且"T-5HPV16VLP" 為通過(guò)本 發(fā)明的方法提純的產(chǎn)物。在HPVLI蛋白的SDS-PAGE分析中，進(jìn)行蛋白的定量，并且每孔 上樣500ng、250ng、125ng和62ng蛋白。實(shí)驗(yàn)被單獨(dú)地執(zhí)行兩次，并且各個(gè)實(shí)驗(yàn)被表示為組 A(PanelA)和組B(PanelB)。根據(jù)由所述的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，可以看到T-5HPV16VLP 的L1蛋白帶的強(qiáng)度比T-1HPV16VLP的高得多。
[0058] 圖6b為示出在圖6a中所示的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的T-1HPV16VLP和T-5HPV 16VLP的L1蛋白帶的強(qiáng)度的圖形。結(jié)果被表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，并且將500ng每孔上 樣的T-5HPV16VLP的L1蛋白帶的強(qiáng)度設(shè)定為100%。這種結(jié)果示出通過(guò)T-5方法提純的 VLP的純度遠(yuǎn)高于通過(guò)T-1方法提純的VLP。
[0059] 圖7示出當(dāng)T-1HPV16VLP被上樣至具有與T-5HPV16VLP相同的L1蛋白帶強(qiáng)度 的時(shí)候的SDS-PAGE結(jié)果。
[0060] 圖8示出T-1HPV16VLP和T-5HPV16VLP的電子顯微鏡結(jié)果。其確認(rèn)T-1HPV16VLP 具有20至50nm的尺寸，并且T-5HPV16VLP具有40至65nm的尺寸。這表示T-5HPV16VLP 的尺寸更接近于HPV的原始尺寸（50至60nm) [29, 30]。
[0061] 圖9和10示出動(dòng)態(tài)光散射（DLS)結(jié)果。DLS測(cè)量VLP在溶液中的尺寸。VLP在溶 液中的尺寸分布使用DLS-700(圖9)和ELS-Z2(圖10)系統(tǒng)來(lái)分析。如在圖9和10的結(jié) 果中所示，兩種類型的VLP的尺寸分布相互不同。該結(jié)果示出T-5HPV16VLP的物理特性不 同于T-1HPV16VLP的物理特性。
[0062] 圖11示出關(guān)于T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的單克隆抗體的反應(yīng)活性。 為了評(píng)價(jià)抗HPV16L1單克隆抗體的反應(yīng)活性，現(xiàn)有技術(shù)已知的單克隆抗體H16.V5和H16. E70被使用。VLP相對(duì)于這兩種抗體的反應(yīng)活性的提高被認(rèn)為與免疫原性的提高具有密切 的關(guān)系[26, 32-34]。確認(rèn)了T-5HPV16VLP相對(duì)于H16.V5和H16.E70抗體的反應(yīng)活性遠(yuǎn)高 于T-1HPV16VLP。
[0063] 圖12示出通過(guò)分析T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的免疫原性而獲得的結(jié) 果。為了比較免疫原性，將lng的VLP利用200yg的氫氧化鋁皮下注射至小鼠內(nèi)。免疫 作用以每隔兩周執(zhí)行四次。在第三次和第四次免疫作用之后的10天，從血清測(cè)定抗HPV 16LlIgG的抗體效價(jià)。根據(jù)抗HPV16LlIgG抗體滴定的結(jié)果，確認(rèn)由T-5HPV16L1VLP產(chǎn)生的 抗HPV16LlIgG的含量比由T-1HPV16L1VLP產(chǎn)生的高10倍。
[0064] 圖13示出在圖12中執(zhí)行的免疫作用中，在第四免疫作用之后收集的免疫血清的 抗HPV16中和抗體活性。利用T-5HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性為78%，而 利用T-1HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性為33%。
[0065] 圖14示出當(dāng)勻漿未被處理的時(shí)候（非處理）、勻漿利用還原劑（0-巰基乙醇）處 理的時(shí)候、以及當(dāng)勻漿在利用還原劑處理之后被加熱和冷卻的時(shí)候（0 -巰基乙醇+加熱和 冷卻）提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經(jīng)歷每種條件的試樣通過(guò)第一肝素層析而被洗 脫，并且對(duì)于每種條件來(lái)說(shuō)相同體積的蛋白（5、2. 5或1. 2y1)從洗脫部分收集并上樣在凝 膠中來(lái)執(zhí)行SDS-PAGE和Western印跡。根據(jù)圖14的結(jié)果，確認(rèn)了當(dāng)勾衆(zhòng)利用還原劑處理 并被加熱和冷卻的時(shí)候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻），HPVL1蛋白的純度遠(yuǎn)高于其它 條件。
[0066] 圖15示出當(dāng)勻漿未被處理的時(shí)候（非處理）、當(dāng)勻漿利用還原劑處理的時(shí)候 (0 _巰基乙醇）、以及當(dāng)勻漿在利用還原劑處理之后被加熱和冷卻的時(shí)候（T-5, 0 -巰基乙 醇+加熱和冷卻）所提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經(jīng)歷每種條件的試樣通過(guò)第一肝 素層析而被洗脫，并且相同量的每種蛋白（1、〇. 5或25yg)從洗脫部分收集并上樣在凝膠 中來(lái)執(zhí)行SDS-PAGE和Western印跡。根據(jù)圖15的結(jié)果，確認(rèn)了當(dāng)勾衆(zhòng)利用還原劑處理并 被加熱和冷卻的時(shí)候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻），HPVL1蛋白的純度遠(yuǎn)高于其它條 件。
[0067] 圖16示出當(dāng)勻漿未被處理的時(shí)候（非處理）、當(dāng)勻漿未利用還原劑處理但是僅被 加熱和冷卻的時(shí)候（加熱和冷卻）、以及當(dāng)勻漿在利用還原劑處理并被加熱和冷卻的時(shí)候 (T-5, 巰基乙醇+加熱和冷卻）所提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經(jīng)歷每種條件 的試樣通過(guò)第一肝素層析而被洗脫，并且對(duì)于每種條件來(lái)說(shuō)相同量的每種蛋白（5、2. 5或 1. 2y1)從洗脫部分收集并上樣在凝膠中來(lái)執(zhí)行SDS-PAGE和ffestern印跡。根據(jù)圖16的 結(jié)果，確認(rèn)了當(dāng)勻漿利用還原劑處理并被加熱和冷卻的時(shí)候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷 卻），HPVL1蛋白的純度遠(yuǎn)高于其它條件。
[0068] 圖17示出基于排阻層析（SEC)的提純方法，基于硫酸銨沉淀的提純方法，以及在 利用還原劑處理之后通過(guò)加熱和冷卻來(lái)執(zhí)行的提純方法（T-5, 巰基乙醇+加熱和冷 卻）。為了比較SEC和硫酸銨沉淀以及在利用還原劑處理之后通過(guò)加熱和冷卻來(lái)執(zhí)行的方 法的作用，在T-5提純方法中利用還原劑處理之后進(jìn)行加熱和冷卻的步驟由SEC或硫酸銨 沉淀來(lái)替代。SEC和硫酸銨沉淀（基于T-1的方法）為基于在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法。
[0069] 1)涉及SEC的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0070] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 1)ParkMA,KimHJ,KimH-J(2008)Optimumconditionsfor productionandpurificationofhumanpapillomavirustype16Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif59:175-181〇
[0071](現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)2)已登記專利，Methods of producing and purifying HPV virus-like particles，申請(qǐng)?zhí)枺?0-2008-0026586 (2008.03.21)，登記號(hào)： 1009591450000(05/13/2010)〇
[0072] 2)涉及硫酸銨層析的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0073] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)l)KimHJ，KimSY，LimSJ，KimJY，LeeSJ等（2010)0ne-st印 chromatographicpurificationofhumanpapillomavirustypel6Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif70:68_74〇
[0074] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 2)KimHJ，LimSJ，KimJY，KimSY，KimH-J(2009)Amethodfor removingcontaminatingproteinduringpurificationofhumanpapillomavirustype 18LlproteinfromSaccharomycescerevisiae.ArchPharmRes32:1759_1766〇
[0075] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)3)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請(qǐng)?zhí)枺?102011-0137242(12/19/2011)，登記號(hào)：1011780560000 (08/21/2012)。
[0076] (現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)4)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請(qǐng)?zhí)枺?102009-0099982(10/20/2009)，登記號(hào)：1011819070000 (09/05/2012)。
[0077] 圖18示出硫酸銨沉淀、還原劑處理方法（0 -巰基乙醇）和通過(guò)利用還原劑處理 以及加熱/冷卻執(zhí)行的提純方法（T-5，0-巰基乙醇+加熱和冷卻）之間的差異。在每個(gè) 提純條件中第一層析的洗脫部分的純度通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡來(lái)分析。結(jié)果，確認(rèn) 了由包括利用0 -巰基乙醇處理和加熱/冷卻的方法回收的L1蛋白具有最高的純度。
[0078] 圖19示出對(duì)于根據(jù)硫酸銨沉淀的提純方法以及在利用還原劑處理之后通過(guò)加熱 和冷卻來(lái)執(zhí)行的提純方法（T-5, 巰基乙醇+加熱和冷卻）來(lái)說(shuō)，第一肝素層析結(jié)果。就 像在圖18中所示的結(jié)果，確認(rèn)了由第一肝素層析洗脫的L1蛋白在利用還原劑處理和加熱/ 冷卻執(zhí)行的方法中具有高純度，同時(shí)大量的污染蛋白被包括在L1蛋白部分中，其在硫酸銨 沉淀之后執(zhí)行第一肝素層析時(shí)而被洗脫。根據(jù)Western印跡的結(jié)果，確認(rèn)L1蛋白并未被結(jié) 合至柱樹(shù)脂，并且當(dāng)L1蛋白通過(guò)硫酸銨沉淀而被提純的時(shí)候在肝素層析中流過(guò)，并且當(dāng)L1 蛋白利用還原劑處理并被加熱/冷卻的時(shí)候L1蛋白不會(huì)流過(guò)。
[0079] 圖20示出在根據(jù)SEC的提純方法中，對(duì)于通過(guò)SEC獲得的洗脫部分的SDS-PAGE 和Western印跡結(jié)果。在部分3至9之間，L1蛋白被高純度地洗脫，并且由此，該片段中的 部分被收集以進(jìn)行比較。
[0080] 圖21示出在根據(jù)SEC的提純方法中（SEC)，根據(jù)硫酸銨沉淀的提純方法中，以及利 用還原劑進(jìn)行處理和加熱/冷卻來(lái)執(zhí)行的提純方法中（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）， 在第一層析中獲得的L1蛋白洗脫部分的SDS-PAGE和Western印跡結(jié)果。對(duì)于第一層析來(lái) 說(shuō)，每個(gè)條件的試樣如在圖17中所示的制備。對(duì)于SEC來(lái)說(shuō)，細(xì)胞勻漿經(jīng)歷硫酸銨沉淀和 SEC(第一層析）。對(duì)于根據(jù)硫酸銨沉淀的方法來(lái)說(shuō)，在硫酸銨沉淀之后，細(xì)胞勻漿經(jīng)歷清除 沉淀的污染物的步驟，并且隨后經(jīng)歷肝素層析（第一層析）。對(duì)于利用還原劑處理和加熱 /冷卻來(lái)執(zhí)行的方法來(lái)說(shuō)，勻漿利用還原劑進(jìn)行處理，加熱和冷卻，并經(jīng)歷肝素層析（第一 層析）。對(duì)于由第一層析獲得的洗脫部分的分析來(lái)說(shuō)，每個(gè)條件的部分均以相同的量上樣 (0. 35、0. 17或0. 08y1)。根據(jù)分析結(jié)果，可以看出，由包括利用還原劑處理和加熱/冷卻 的方法獲得的L1蛋白表現(xiàn)為具有最高的純度。
[0081] 圖22示出對(duì)由圖21的第一層析獲得的洗脫部分進(jìn)行第二層析來(lái)進(jìn)一步提純 L1蛋白所獲得的結(jié)果。在第二層析之后，L1蛋白洗脫部分之間的差異通過(guò)SDS-PAGE和 Western印跡進(jìn)行分析。對(duì)于分析來(lái)說(shuō)，每個(gè)提純條件的洗脫部分均以相同的量上樣（2、1 或0. 5y1)。根據(jù)分析結(jié)果，可以看出包括利用還原劑處理和加熱/冷卻的提純方法相對(duì)于 L1蛋白的回收速率為最佳的。
[0082] 圖23示出單克隆抗體（H16.E7)對(duì)在圖22中最終提純的L1蛋白的反應(yīng)活性，其 通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)進(jìn)行分析。為了以相同的量涂覆在每個(gè)提純條件中獲得 的HPV16L1VLP，由根據(jù)SEC的提純方法（SEC)、根據(jù)硫酸銨沉淀的提純方法、以及在利用還 原劑處理之后通過(guò)加熱和冷卻執(zhí)行的提純方法（0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）獲得的L1蛋 白經(jīng)調(diào)節(jié)至具有相同的濃度，并且L1蛋白的量通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡來(lái)檢測(cè)（圖 23A)。其后，HPV16L1VLP對(duì)H16.E70的反應(yīng)活性通過(guò)ELISA進(jìn)行檢測(cè)（圖23B)。結(jié)果，可 以看出利用還原劑處理和加熱/冷卻提純的HPV16L1VLP(T-5HPV16L1VLP)具有對(duì)H16.E70 最佳的反應(yīng)活性。這顯示出由利用還原劑處理和加熱/冷卻來(lái)執(zhí)行的提純方法所獲得的 HPV16L1VLP具有最佳的結(jié)構(gòu)特性[26]。
[0083] 圖24示出根據(jù)SEC的提純方法、根據(jù)硫酸銨沉淀的提純方法、以及利用還原劑處 理和加熱/冷卻所執(zhí)行的提純方法的免疫原性分析。在利用HPV16L1VLP對(duì)小鼠進(jìn)行免疫 作用之前，L1蛋白的量經(jīng)調(diào)節(jié)至與在圖23A中檢測(cè)的相同。lng的HPV16L1VLP與200yg的氫氧化鋁相混合、，并隨后被皮下注射至小鼠內(nèi)。小鼠免疫作用每隔兩周執(zhí)行四次。在四 次免疫作用之后，采集小鼠免疫血清，并且每個(gè)小鼠組的中和活性通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已知的用 于測(cè)量中和抗體活性的基于假病毒的方法檢測(cè)[26]。結(jié)果，可以看到由經(jīng)過(guò)排阻層析提純 獲得的HPV16L1VLP進(jìn)行免疫的小鼠的中和活性為16%，由硫酸銨沉淀獲得的HPV16L1VLP 進(jìn)行免疫的小鼠的中和活性為28%，并且由利用還原劑處理和加熱/冷卻來(lái)執(zhí)行提純所獲 得的HPV16L1VLP進(jìn)行免疫的小鼠的中和活性為50%。因此，由利用還原劑處理和加熱/冷 卻來(lái)執(zhí)行的提純方法所獲得的HPV16L1VLP對(duì)誘導(dǎo)中和抗體的能力表現(xiàn)為最佳的。
[0084] 圖25示出在T-5方法中利用還原劑進(jìn)行處理之后，在加熱/冷卻過(guò)程中作用與加 熱溫度的關(guān)系。細(xì)胞勻漿在每個(gè)加熱溫度下加熱15分鐘并冷卻，并且隨后所沉淀的污染物 通過(guò)離心而被清除。組A示出根據(jù)加熱溫度測(cè)量的蛋白濃度。組B示出在各個(gè)加熱溫度下 以相同的量上樣的試樣的SDS-PAGE結(jié)果。組C為Western印跡結(jié)果，用于對(duì)在各個(gè)加熱溫 度下以相同的量上樣的試樣進(jìn)行L1蛋白分析。組D為Western印跡結(jié)果，用于當(dāng)試樣以相 同的蛋白量上樣的時(shí)候，對(duì)以各個(gè)加熱溫度下定量的試樣進(jìn)行L1蛋白分析。據(jù)此，組D示 出L1蛋白的純度。根據(jù)該結(jié)果，確認(rèn)了HPV16L1蛋白在60°C的加熱溫度下保留在細(xì)胞勻漿 中，并且L1蛋白的純度在細(xì)胞勻漿被加熱至35至50°C時(shí)會(huì)提高。
[0085] 圖26示出根據(jù)T-5方法在HPV18L1蛋白的提純中利用還原劑進(jìn)行處理之后，在加 熱/冷卻步驟中加熱溫度與作用的關(guān)系。每個(gè)組的詳細(xì)描述與圖25的相同。根據(jù)該結(jié)果， 確認(rèn)了HPV18L1蛋白在高至65°C的加熱溫度下保留在細(xì)胞勻漿中，并且L1蛋白的純度在細(xì) 胞勻漿被加熱至45至55°C時(shí)會(huì)提高。
[0086] 圖27示出根據(jù)T-5方法，在HPV16L1VLP的提純中，利用還原劑進(jìn)行處理之后，在 加熱/冷卻中冷卻步驟的作用。組A示出被加熱至45至50°C并被冷卻的試樣（加熱合冷 卻）和未被冷卻的試樣（加熱）之間的蛋白濃度的差異。租B示出對(duì)于被加熱至45°C并被 冷卻的試樣和未被冷卻的試樣來(lái)說(shuō)，通過(guò)Western印跡分析的L1蛋白的量。組C示出，對(duì) 于被加熱至50°C并被冷卻的試樣和未被冷卻的試樣來(lái)說(shuō)，通過(guò)Western印跡分析的L1蛋白 的量。該結(jié)果示出污染的蛋白通過(guò)經(jīng)歷冷卻步驟的沉淀而被清除，并且在該操作中，不會(huì)發(fā) 生L1蛋白的損失。
[0087] 圖28示出根據(jù)T-5方法，在HPV16L1VLP的提純中，利用還原劑進(jìn)行處理之后，在 加熱和冷卻中冷卻步驟的作用。其示出被加熱至45°C并被冷卻的試樣（HC)和未被冷卻的 試樣（H)之間的差異，其通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡進(jìn)行分析。根據(jù)SDS-PAGE和Western 印跡結(jié)果，確認(rèn)了L1蛋白在冷卻步驟之后未減少，而污染的蛋白會(huì)有所減少。
[0088] 圖29示出通過(guò)圖28的SDS-PAGE檢測(cè)的污染蛋白，蛋白1、蛋白2和蛋白3的帶強(qiáng) 度的數(shù)值。這顯示出通過(guò)冷卻步驟，污染蛋白的濃度有所下降。
[0089] 圖30示出根據(jù)T-5方法，通過(guò)在60 °C的加熱溫度下提純HPV16L1VLP和 HPV18L1VLP獲得的結(jié)果。組A示出第一層析的SDS-PAGE結(jié)果。LS表示上樣至柱上的試樣， 并且FT表示流過(guò)而未結(jié)合至柱的試樣。洗脫表示在結(jié)合至柱樹(shù)脂之后洗脫的部分。箭頭表 示HPV16L1和HPV18L1的位置。組B示出在執(zhí)行第一和第二層析之后最終提純的HPV16L1 和HPV18L1的SDS-PAGE結(jié)果。組C為最終提純的產(chǎn)品的透射電子顯微鏡。根據(jù)電子顯微 鏡結(jié)果，確認(rèn)提純的L1蛋白形成VLP。
[0090] 圖31示出根據(jù)T-5方法，通過(guò)第一層析提純HPV18L1所獲得的結(jié)果。每個(gè)部分 均通過(guò)SDS-PAGE來(lái)進(jìn)行分析。LS表示上樣試樣，F(xiàn)T表示流過(guò)，W表示柱被沖洗的部分，并 且E表示蛋白部分，其被結(jié)合至柱，通過(guò)添加包括1MNaCl的緩沖溶液而被洗脫?？梢钥闯?HPV18L1通過(guò)在利用還原劑處理和加熱/冷卻之后的層析而被高純度地提純。
[0091] 圖32示出使用圖31的第一層析的洗脫部分執(zhí)行的，在第二陽(yáng)離子交換層析之后 洗脫的HPV18L1蛋白部分的SDS-PAGE結(jié)果。LS、FT和W為與如上所述相同的。結(jié)合至柱 樹(shù)脂的蛋白利用包含〇. 6、0. 7、0. 8、0. 9或1MNaCl的緩沖溶液而被相繼地洗脫。確認(rèn)了 HPV18L1蛋白在0. 9M和1MNaCl部分中洗脫。
[0092] 圖33示出通過(guò)T-5方法提純的HPV18L1VLP的DLS結(jié)果。T-5HPV18L1VLP的DLS 使用ELS-Z2系統(tǒng)進(jìn)行分析。
[0093] 圖34示出通過(guò)T-5提純方法來(lái)提純HPV58L1所獲得的結(jié)果。組A示出通過(guò)第一 層析洗脫的L1蛋白部分的SDS-PAGE結(jié)果。組B示出第二層析的SDS-PAGE結(jié)果。組B的 詳細(xì)說(shuō)明與在圖32中描述的相同。
[0094] 圖35示出根據(jù)T-5提純方法，通過(guò)第一和第二層析最終回收的HPV58L1蛋白的 SDS-PAGE和Western印跡結(jié)果。其示出HPV58L1可以通過(guò)利用還原劑進(jìn)行處理并隨后通過(guò) 執(zhí)行加熱/冷卻步驟的方法而被成功地提純。
[0095] 圖36示出編碼HPV16L1蛋白的DNA序列（HPV16L1NG2)。釀酒酵母利用載有 HPV16L1NG2基因的表達(dá)載體而被轉(zhuǎn)化。所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被用于表達(dá)和提純HPV16L1蛋白。 HPV16L1的核酸序列在基因庫(kù)的登記號(hào)為KC792555. 1。
[0096] 圖37示出編碼HPV18L1蛋白的DNA序列（HPV18L1NG3)。釀酒酵母利用載有 HPV18L1NG3基因的表達(dá)載體而被轉(zhuǎn)化。所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被用于表達(dá)和提純HPV18L1蛋白。 HPV18L1的核酸序列在基因庫(kù)的登記號(hào)為KC792556. 1。
[0097] 圖38分別示出通過(guò)HPV16L1NG2編碼的HPV16L1氨基酸序列和通過(guò)HPV18L1NG3 編碼的HPV18L1氨基酸序列。
[0098] 發(fā)明方式
[0099] 在下文，本發(fā)明將參考實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。所述實(shí)施例僅被提供用來(lái)更 加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，并且本發(fā)明的范圍并不限于所述實(shí)施例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清 楚理解的是本發(fā)明的范圍并不限于根據(jù)本發(fā)明這些要點(diǎn)的實(shí)施例。

【具體實(shí)施方式】
[0100] 試驗(yàn)方法
[0101] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0102] 表達(dá)HPVL1蛋白的釀酒酵母（S.cerevisiae)Y2805根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法來(lái) 培養(yǎng)[25]。表達(dá)HPVL1蛋白的細(xì)胞被置于不含尿嘧啶的完全合成培養(yǎng)基"SD-ura"上，并 培養(yǎng)四天或五天。單個(gè)菌落接種于SD-ura液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)兩天。為了由GAL10啟動(dòng)子 表達(dá)HPV16L1蛋白，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在包含1%酵母提取物（Duchefa，荷蘭）、2%蛋白胨 (Duchefa)、7%葡萄糖（Duchefa)和1%半乳糖（Duchefa)的YPDG培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培 養(yǎng)之后，所培養(yǎng)的細(xì)胞被離心以清除培養(yǎng)基，并利用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)進(jìn)行沖洗。所沖 洗的細(xì)胞再次通過(guò)離心來(lái)采集，并在蛋白的提純之前儲(chǔ)存在-70°C。
[0103] 2、使用T-1方法提純HPVVLP
[0104] 根據(jù)T-1方法提純HPVVLP，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法，在勻漿中的蛋白作為球 粒通過(guò)硫酸銨沉淀而被回收之后，通過(guò)肝素層析來(lái)執(zhí)行[22, 23, 24]。對(duì)于肝素層析，使用 HiTrap?肝素HP(GEHealthcare，USA)樹(shù)脂。由清除硫酸銨和清除沉淀的污染物的步驟所 回收的試樣利用包含〇. 325MNaCl的PBST進(jìn)行透析，并令其經(jīng)過(guò)利用包含0. 325MNaCl的 PBST平衡的肝素樹(shù)脂。肝素樹(shù)脂利用五倍于樹(shù)脂床體積的緩沖溶液（包含0. 325MNaCl的 PBS)沖洗，并且結(jié)合有樹(shù)脂的蛋白通過(guò)將NaCl的濃度由0. 325提高至2M的線性梯度而洗 脫。在洗脫部分中，包括HPVL1的那些部分通過(guò)SDS-PAGE來(lái)選擇。所提純的HPVL1VLP 利用包含〇. 01 %吐溫80和0. 33MNaCl的PBS(PBST)進(jìn)行透析。
[0105] 3、通過(guò)T-5方法提純HPVVLP((0-巰基乙醇+加熱和冷卻方法）
[0106] 3-1、細(xì)胞破碎，利用還原劑處理并加熱/冷卻
[0107] 所培養(yǎng)的表達(dá)HPVL1蛋白的細(xì)胞在破碎緩沖溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mM NaCl，1.7mMEDTA，0.01%吐溫80pH7.2)中混合。細(xì)胞混合物與0.5mm玻璃珠（Biospec Product，USA)再次混合，并且所述細(xì)胞通過(guò)渦流而被破碎。細(xì)胞碎片通過(guò)在12000xg下離 心15分鐘而被清除。在柱層析之前，細(xì)胞裂解液通過(guò)兩種不同的方法而被制備。第一種方 法包括將0 _巰基乙醇添加至細(xì)胞裂解液至具有4至6wt%的0 -巰基乙醇（0 -巰基乙 醇，Sigma，USA)的最終濃度，并調(diào)節(jié)pH至7. 0至7. 3。第二種方法包括利用細(xì)胞破碎緩沖 溶液（10禮磷酸氫二鈉，1501111似(：1，1.71111￡0了4,0.01%吐溫8(^117.2)透析細(xì)胞勻漿4至 6小時(shí)，并將0 -巰基乙醇添加至細(xì)胞裂解液至具有4-6%的0 -巰基乙醇的最終濃度。隨 后，添加0 _巰基乙醇的細(xì)胞裂解液被保持在25至65°C的恒溫水浴中30至50分鐘，并在 冰上冷卻30分鐘至3小時(shí)或者在4°C下冷卻16小時(shí)。冷卻的細(xì)胞裂解液以12000xg離心 15分鐘來(lái)清除沉淀的污染物。
[0108] 3-2、第一層析
[0109] 在利用還原劑處理之后通過(guò)加熱和冷卻制備的細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)肝素樹(shù)脂 (HiTrap?肝素HP，GEHealthcare，USA或P〇R〇Sl! 50HE，AppliedBiosystems，USA)或 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（P〇R〇SKXS，Applied Biosystems, USA)。在細(xì)胞勾衆(zhòng)經(jīng)過(guò)肝素樹(shù)脂或 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂之前，所述樹(shù)脂利用包含4至6% 巰基乙醇的破碎緩沖溶液（10mM磷 酸氫二鈉，0. 15to0. 48MNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫 80，pH7. 2)來(lái)平衡。細(xì)胞勻漿被上 樣在樹(shù)脂上，并且肝素或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂利用五倍于或多于五倍于樹(shù)脂床體積的沖洗緩沖 溶液（包含〇. 35to0. 48MNaCl和5% 0 -巰基乙醇的PBST)進(jìn)行沖洗。結(jié)合至肝素樹(shù)脂 的HPVL1蛋白利用包含lMNaCl和5% 0 -巰基乙醇的PBST，或者通過(guò)連續(xù)地添加經(jīng)制備 在包含5% 0 -巰基乙醇的PBST中具有0. 6M、0. 7M、0. 8M、0. 9M和1M的最終NaCl濃度的緩 沖溶液進(jìn)行洗脫。包括L1蛋白的洗脫溶液使用AmiconUltra(Millip〇re，USA)來(lái)濃縮，并 利用包含1MNaCl和0. 2M硫酸銨的PBST透析20至24小時(shí)。
[0110] 3-3、第二層析
[0111] 在第一層析之后透析的溶液被再次利用包含〇. 3至0. 42MNaCl的PBST進(jìn)行額外 的透析，經(jīng)過(guò)肝素樹(shù)脂或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂來(lái)執(zhí)行第二層析。用于第二層析的肝素樹(shù)脂或陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂與在第一層析中使用的那些相同。在試樣上樣之前，肝素/陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 利用包含0. 42MNaCl的PBST平衡。在試樣上樣之后，樹(shù)脂利用五倍于或多于五倍于樹(shù)脂床 體積的包含0.42MNaCl的PBST進(jìn)行沖洗。結(jié)合至肝素/陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的HPVL1蛋白通 過(guò)將NaCl的濃度由0. 42提高至2. 0M，或者通過(guò)連續(xù)地添加經(jīng)制備具有0. 6M、0. 7M、0. 8M、 0. 9M和1M的NaCl濃度的緩沖溶液來(lái)洗脫。層析的洗脫模式在280nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)，并使 用Autochro-2000程序來(lái)收集（YoungLinInstrumentCo.，韓國(guó)）。洗脫的L1蛋白部分 被收集，使用AmiconUltra(Millipore，USA)進(jìn)行濃縮，并利用包含0.33MNaCl的PBST來(lái) 透析。
[0112] 4、非處理方法
[0113] 對(duì)于非處理提純來(lái)說(shuō)，細(xì)胞通過(guò)如上所述的破碎來(lái)制備。所制備的勻漿利用緩沖 溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0.01%吐溫 80pH7.2)透析 4 至 6 小時(shí)。 透析試樣的沉淀污染物通過(guò)在12000Xg下離心10分鐘來(lái)清除，并且隨后制備產(chǎn)物經(jīng)過(guò)如上 利用緩沖溶液平衡的肝素樹(shù)脂。隨后，肝素樹(shù)脂利用五倍于樹(shù)脂床體積的包含0.42MNaCl 的PBST進(jìn)行沖洗，并且在沖洗步驟之后，結(jié)合至肝素樹(shù)脂的蛋白利用包含1MNaCl的PBST 洗脫。
[0114] 5、利用0 -巰基乙醇進(jìn)行處理的提純方法（0 -巰基乙醇方法）
[0115] 利用巰基乙醇進(jìn)行處理的提純方法為T-5提純方法中不包括加熱和冷卻步驟 的提純方法。對(duì)于通過(guò)利用巰基乙醇進(jìn)行處理的提純方法來(lái)說(shuō)，表達(dá)HPVL1的細(xì)胞如 上所述地制備，并利用緩沖溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫 80pH7. 2)透析4至6小時(shí)。|3 -疏基乙醇被添加至透析的裂解液至具有4至6% |3 -疏 基乙醇的最終濃度。肝素樹(shù)脂利用包含4至6% 0 -巰基乙醇的緩沖溶液（10mM磷酸氫二 鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫80pH7. 2)平衡，并令所制備的勻漿經(jīng)過(guò)樹(shù)脂。裂 解液經(jīng)過(guò)的肝素樹(shù)脂利用五倍于樹(shù)脂床體積的包含4至6% -巰基乙醇和0. 42MNaCl的 PBST進(jìn)行沖洗。結(jié)合至肝素樹(shù)脂的蛋白利用包含4至6% 巰基乙醇和1MNaCl的PBST 洗脫。
[0116] 6、加熱和冷卻方法
[0117] 加熱和冷卻方法為T-5提純方法中不包括0 -巰基乙醇處理步驟的提純方法。對(duì) 于HPVL1蛋白的提純來(lái)說(shuō)，細(xì)胞利用緩沖溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1. 7mMEDTA， 0. 01%吐溫80pH7. 2)來(lái)破碎和透析4至6小時(shí)。所透析的裂解液在37°C至45°C下處理 30分鐘，并在冰上冷卻30分鐘至3小時(shí)。經(jīng)歷加熱/冷卻的裂解液的沉淀污染物通過(guò)在 12000xg下離心10分鐘而被清除，并經(jīng)過(guò)利用緩沖溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl， 1.7mMEDTA，0.01%吐溫80pH7. 2)平衡的肝素樹(shù)脂。隨后，肝素樹(shù)脂利用五倍于樹(shù)脂床 體積的包含〇. 42MNaCl的PBST沖洗，并且結(jié)合至樹(shù)脂的蛋白在沖洗步驟之后利用包含1M NaCl的PBST來(lái)洗脫。
[0118] 7、使用排阻層析（SEC)進(jìn)行提純
[0119] 使用SEC進(jìn)行提純通過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)方法[20]的些許改進(jìn)來(lái)執(zhí)行。HPVL1表達(dá)酵 母通過(guò)如上所述的破碎來(lái)制備，并且蛋白通過(guò)45%的飽和硫酸按來(lái)沉淀。所沉淀的蛋白使 用PBST再懸浮，并利用緩沖溶液（10mM磷酸氫二鈉，0. 65M NaCl，1.7mM EDTA，0. 01%吐溫 80pH 7. 2)透析4小時(shí)。透析部分的提純通過(guò)作為第一層析的SEC來(lái)執(zhí)行。所制備的試樣 經(jīng)過(guò)利用包含0.65M NaCl的PBST平衡的superose-6樹(shù)脂（1.5x 32cm，GE Healthcare， USA)(第一層析）[36]。SEC的洗脫模式利用280nm的波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)，并使用Autochro-2000 程序來(lái)收集（YoungLinInstrumentCo.，韓國(guó)）。
[0120] 收集包含HPVLI的部分，利用包含0.33MNaCl的PBST進(jìn)行透析，并經(jīng)過(guò)利用包 含0.33MNaCl的PBST平衡的肝素樹(shù)脂（第二層析）。隨后，肝素樹(shù)脂利用五倍于樹(shù)脂床體 積的包含0.42MNaCl的PBST來(lái)沖洗。在沖洗之后，結(jié)合至肝素樹(shù)脂的蛋白通過(guò)相繼地流 過(guò)包含 0. 6M、0. 7M、0. 8M、0. 9M和 1MNaCl的PBST來(lái)洗脫。
[0121] 8、使用硫酸銨沉淀進(jìn)行提純（硫酸銨沉淀方法）
[0122] 使用硫酸銨沉淀的提純?yōu)樵赥-5方法中0 -巰基乙醇處理之后的加熱和冷卻步驟 被硫酸銨沉淀所替代的方法。在層析之前，硫酸銨沉淀和沉淀污染物的清除根據(jù)現(xiàn)有技術(shù) 已知方法來(lái)執(zhí)行[22, 24]。細(xì)胞裂解液中的蛋白利用45%的硫酸銨飽和來(lái)沉淀，并且污染 物質(zhì)被清除（沉淀污染物的清除）。在層析之前如上制備的試樣利用緩沖溶液（10mM磷酸 氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫80pH7. 2)透析4小時(shí)。肝素樹(shù)脂利用與如 上所述相同的緩沖溶液來(lái)平衡，并隨后令透析的試樣經(jīng)過(guò)樹(shù)脂（第一層析）。其后，樹(shù)脂利 用五倍于樹(shù)脂床體積的包含0. 42MNaCl的PBST來(lái)沖洗，并且結(jié)合蛋白利用包含1MNaCl的 PBST來(lái)洗脫。對(duì)于第二層析來(lái)說(shuō)，洗脫部分利用包含0.33MNaCl的緩沖溶液進(jìn)行透析。隨 后，SEC的第二層析以與如上所述相同的方式來(lái)執(zhí)行。
[0123] 9、蛋白的定量分析
[0124] 蛋白的濃度利用牛血清白蛋白（BSA;Pierce，USA)作為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)蛋白定量分析試 劑盒（Bio-RadLaboratories，USA)來(lái)測(cè)量。
[0125] 10、SDS-PAGE和Western印跡
[0126]SDS-PAGE根據(jù)Laemmli方法來(lái)執(zhí)行[35]，并且Western印跡通過(guò)已知方法來(lái)執(zhí) 行[26]。在SDS-PAGE凝膠上擴(kuò)展的蛋白通過(guò)染色而被觀察到。HPVL1蛋白使用兔抗HPV 16L1血清作為一級(jí)抗體和山羊過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔IgG多克隆抗體（氧化物酶標(biāo)記山羊抗 兔IgG，Bethyl，USA)作為二級(jí)抗體來(lái)檢測(cè)[26]。帶強(qiáng)度通過(guò)國(guó)立衛(wèi)生研宄院（NIH)開(kāi)源 軟件圖像J來(lái)測(cè)量，并根據(jù)已知方法來(lái)評(píng)估[25]。
[0127] 11、電子顯微鏡
[0128] 提純的HPV16L1蛋白被吸附在碳涂覆的格柵上，并利用磷鎢酸或乙酸雙氧鈾染 色。透射電子顯微鏡圖像使用了￡1120(^乂(邛01，日本）以150,000倍的最終放大倍數(shù)來(lái)采 集。
[0129] 12、HPVVLP的動(dòng)態(tài)光散射（DLS)
[0130]HPVVLP的DLS通過(guò)已知方法來(lái)執(zhí)行[26]。提純的HPVVLP在包含0.13MNaCl的 PBST中稀釋至具有0? 13mg/ml的濃度，并使用DLS-700系統(tǒng)（OtsukaElectronics，日本） 或者ELS-Z2系統(tǒng)（OtsukaElectronics，日本）進(jìn)行分析。
[0131] 13、單克隆抗體對(duì)HPVVLP的反應(yīng)活性分析
[0132] 單克隆抗體對(duì)HPVVLP的反應(yīng)活性根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知方法進(jìn)行分析[26]。96孔酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)板利用400ng提純的HPVVLP進(jìn)行涂覆。在執(zhí)行SDS-PAGE之后，通 過(guò)不同方法提純的HPVL1VLP被用作為涂層，從而確認(rèn)在每種方法中提純的HPVL1VLP的 L1蛋白的量在數(shù)量上為相同的。VLP涂覆的板利用包含3%牛血清白蛋白的PBS-T2(I(包含 0. 05%吐溫20的PBS)在室溫下封閉2小時(shí)?？笻PV16L1單克隆抗體，H16.V5和H16.E70， 利用包含0. 3 %牛血清白蛋白的PBS-T2Q稀釋至具有0. 25yg/ml、0. 12yg/ml、0. 06yg/ml、 0. 03yg/ml和0. 015yg/ml的濃度，并與涂覆的HPVVLP在37°C下反應(yīng)90分鐘。所獲得 的抗體利用PBS-T沖洗三次，過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG抗體（Bethyl，USA)在包含0. 3% 牛血清白蛋白的PBS-T2Q中以1:5000的比例稀釋，并在37°C下于板上反應(yīng)40分鐘。利用 PBS-T2(I沖洗所述板五次，并執(zhí)行顯色反應(yīng)。所述的顯色反應(yīng)使用鄰苯二胺（Sigma，USA)來(lái) 執(zhí)行，并且光密度在492nm下測(cè)量。
[0133] 14、提純的HPVL1VLP對(duì)小鼠的免疫和免疫原性評(píng)估
[0134] 為了評(píng)價(jià)HPV16L1的免疫原性，使用6周大的Balb/c小鼠（Orientbio.韓國(guó)）。 為了利用HPVL1蛋白使小鼠免疫，L1蛋白的純度和濃度根據(jù)已知的蛋白定量分析方法和 SDS-PAGE方法來(lái)確認(rèn)。小鼠通過(guò)以每?jī)芍芷は伦⑸渌拇味庖?。?duì)于單獨(dú)的免疫作用來(lái) 說(shuō)，lng的L1蛋白與200yg的氫氧化錯(cuò)（Sigma,USA) -起皮下注射。lng的蛋白是基于 T-5HPV16L1VLP的定量分析結(jié)果。通過(guò)另一種方法提純的HPV16L1蛋白使用T-5HP16L1作 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。在第三和第四次免疫之后的10天，血液從小鼠尾巴的靜脈收 集。為了收集血清，小鼠血液以12000xg離心10分鐘來(lái)制備上清液，并且所述上清液被存儲(chǔ) 在-70°C，直至測(cè)定抗體效價(jià)和評(píng)價(jià)中和抗體的活性?？笻PV16LlIgG抗體的效價(jià)和小鼠血 液中抗HPV16的中和活性根據(jù)已知方法通過(guò)ELISA和基于假病毒的中和實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)量[26]。
[0135] 15、統(tǒng)計(jì)分析
[0136] 不同組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性使用雙尾t檢驗(yàn)來(lái)確定。P〈0. 05被認(rèn)為是顯著 性差異。
[0137] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0138] 1、T-5提純：通過(guò)第一層析提純L1蛋白的結(jié)果
[0139]T-5提純方法在圖1中示出。第一肝素層析的上樣試樣被制備成兩種類型，包括透 析被執(zhí)行的情況和透析未被執(zhí)行的情況。在透析被執(zhí)行的情況中，在細(xì)胞被破碎之后，透析 在細(xì)胞破碎緩沖溶液中執(zhí)行，并且隨后添加還原劑（0 _巰基乙醇），并且當(dāng)透析未被執(zhí)行 的時(shí)候，還原劑被直接添加至勻漿。隨后，兩個(gè)試樣被加熱至37°C至42°C，并留在冰上30至 50分鐘以冷卻至約0°C。由加熱/冷卻步驟獲得的沉淀的污染物質(zhì)被清除，并且執(zhí)行肝素 層析。圖2和3示出透析試樣和未透析試樣的肝素層析結(jié)果，其通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。 在兩種情況中獲得的L1蛋白均為高純度的。
[0140] 2、T-5提純：通過(guò)第二層析提純L1蛋白的結(jié)果
[0141] 由第一肝素層析獲得的L1蛋白洗脫部分通過(guò)第二肝素層析而被進(jìn)一步提純。圖 4a示出通過(guò)第二肝素層析獲得的提純結(jié)果。結(jié)合至肝素樹(shù)脂的L1蛋白通過(guò)線性增加的 NaCl梯度來(lái)洗脫（圖4b)。根據(jù)SDS-PAGE的結(jié)果，流過(guò)而未被結(jié)合至肝素樹(shù)脂的L1蛋白未 在FT部分中觀察到。確認(rèn)了結(jié)合至肝素樹(shù)脂的L1蛋白通過(guò)線性梯度增加而被洗脫（11-17 部分）。圖4b示出在肝素層析中在280nm的波長(zhǎng)檢測(cè)到的洗脫物質(zhì)。當(dāng)考慮SDS-PAGE結(jié) 果的時(shí)候，洗脫的蛋白并未在FT中（流過(guò)）觀察到，但當(dāng)在280nm檢測(cè)的時(shí)候，確認(rèn)在FT 中大量的物質(zhì)會(huì)流過(guò)。據(jù)此，認(rèn)為污染物質(zhì)，而非L1蛋白會(huì)通過(guò)第二肝素層析被清除。
[0142] 3、通過(guò)T-1和T-5方法分離的HPV16L1VLP的純度分析
[0143] 通過(guò)第二肝素層析（T-5HPV16L1VLP)收集的L1蛋白的純度與通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已知 方法[22. 24] (T-1HPV16L1VLP)提純的L1蛋白的純度進(jìn)行比較。T-1提純方法在圖1中示 出，并且T-1提純方法的肝素層析的SDS-PAGE結(jié)果在圖5中示出。在圖5中，LS表示上樣在 層析柱上的試樣（上樣試樣）。根據(jù)T-1方法的肝素層析，L1蛋白通過(guò)NaCl濃度從0. 325M 至2M的線性梯度提高而被洗脫，并且L1蛋白在11至15部分之間洗脫。圖6a示出通過(guò) T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的純度對(duì)比結(jié)果。為了分析VLP的純度，提純實(shí)驗(yàn)被單 獨(dú)地執(zhí)行兩次，并且結(jié)果表示于組A和組B中。在蛋白的定量分析之后，T-1HPV16L1VLP和 T-5HPV16L1VLP以500ng、250ng、125ng和62ng每孔上樣，并且在由SDS-PAGE分級(jí)之后，其 結(jié)果通過(guò)染色而可視化。根據(jù)兩個(gè)VLP，高純度的55kDaL1帶被觀察到。然而，可以看出 T-5HPV16VLP的L1帶的強(qiáng)度高于T-1HPV16VLP。圖6b示出在圖6a中實(shí)施的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的 數(shù)值，其用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。為了生成結(jié)果，以500ng上樣的T-5HPV16VLP的L1 帶的強(qiáng)度被設(shè)定為100%。根據(jù)該結(jié)果，確認(rèn)T-5HPV16L1VLP的純度高于T-1HPV16L1VLP。
[0144] 對(duì)于電子顯微鏡來(lái)說(shuō)，DLS和單克隆抗體反應(yīng)活性的分析將在下文描述，T-1HPV 16VLP的L1量經(jīng)調(diào)節(jié)以與T-5HPV16VLP相同。圖7示出兩種類型的VLP的L1量的SDS-PAGE 結(jié)果，其被調(diào)節(jié)為相同的。
[0145] 4、通過(guò)T-1和T-5提純方法分離的HPV16L1VLP的電子顯微鏡觀察
[0146]圖 8 示出T-1HPV16VLP和T-5HPV16VLP的電子顯微鏡結(jié)果。確認(rèn)T-5HPV16L1VLP 的尺寸范圍為40至65nm，并且T-1HPV16L1VLP的尺寸范圍為20至50nm。據(jù)此，通過(guò)T-5 方法提純的HPV16L1VLP的類型具有不同于通過(guò)T-1方法提純的HPV16L1VLP類型的特征。 已知HPV病毒粒子的尺寸天然存在為50至60nm[29, 30]。這樣的結(jié)果表明T-5HPV16VLP 的尺寸更接近于原始HPV尺寸。
[0147] 5、通過(guò)T-1和T-5方法分離的HPV16L1VLP的DLS分析
[0148]DLS被廣泛用于評(píng)價(jià)在溶液中存在的VLP的狀態(tài)[31]。圖9示出使用DLS-700系 統(tǒng)來(lái)分析提純的T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的代表性結(jié)果。圖10示出使用ELS-Z2 系統(tǒng)來(lái)分析HPV16L1VLP的代表性結(jié)果。VLP尺寸用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在圖9中， T-1HPV16L1VLP分布于29至438nm之間，并且T-5HPV16L1VLP分布于17至233nm之間。據(jù) 此，根據(jù)兩種類型的VLP的尺寸的流體靜力分布相互不同。圖10A示出兩種VLP的DLS的 強(qiáng)度圖形。圖10B示出兩種類型VLP的多分散指數(shù)（P.I.)。在圖10B中，就像在圖10A中， 確認(rèn)T-1HPV16L1VLP比T-5HPV16L1VLP具有更寬的尺寸分布范圍。確認(rèn)T-5HPV16L1VLP的 P.I.低于T-1HPV16L1VLP(圖 10B)。因此，確認(rèn)與T-1HPV16L1VLP相比，T-5HPV16L1VLP在 溶液中以均一的類型存在。
[0149] 6、對(duì)通過(guò)T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的單克隆抗體反應(yīng)活性的分析
[0150] 抗HPV16L1單克隆抗體對(duì)HPV16VLP的反應(yīng)活性被用作為用于評(píng)價(jià) HPV16L1VLP的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)和誘導(dǎo)中和抗體能力的重要標(biāo)準(zhǔn)[26,32-34]。T-1HPV16L1VLP和 T-5HPV16L1VLP對(duì)單克隆抗體的反應(yīng)活性使用抗體H16.V5和H16.E70進(jìn)行比較，其為評(píng) 價(jià)這些特性最為常用的[26]。對(duì)兩種抗體的反應(yīng)活性的增加與免疫原性的增加極為相關(guān) [26, 36]。如在圖11中所示的，確認(rèn)了T-5HPV16VLP對(duì)兩種類型抗體的反應(yīng)活性顯著高于 T-1HPV16VLP。
[0151] 7、通過(guò)T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的免疫原性的比較
[0152]確認(rèn)了T-1HPV16L1VLP的L1 蛋白的純度低于T-5HPV16L1VLP(圖 6a、圖 6b)。為了 以相同的量免疫接種兩種HPV16L1VLP，T-1HPV16L1VLP的量被調(diào)節(jié)為T-5HPV16L1VLP的量， 并且L1蛋白的量通過(guò)SDS-PAGE來(lái)評(píng)價(jià)（圖7)。對(duì)于免疫作用來(lái)說(shuō)，lng的HPV16L1VLP與 氫氧化鋁一起注射。由T-5HPV16L1VLP定量分析的lng的蛋白量（數(shù)值由Bradford蛋白測(cè) 定獲得）被設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)的。通過(guò)T-1或T-5提純方法提純的HPV16L1VLP每隔兩周被四次 皮下注射至小鼠內(nèi)。在第三次和第四次免疫作用之后檢測(cè)的在血清中的抗HPV16LlIgG的 效價(jià)在圖12中示出。在第三次免疫作用之后，T-5HPV16L1VLP免疫組具有的中值為450,而 T-1HPV16L1VLP免疫組具有的中值為0。在第四次免疫作用之后，T-5HPV16L1VLP免疫組具 有的中值為4050,而T-1HPV16L1VLP免疫組具有的中值為300。據(jù)此，確認(rèn)T-5HPV16L1VLP 誘導(dǎo)比T-1HPV16L1VLP高10倍或大于10倍的抗HPV16LlIgG抗體效價(jià)。
[0153] 在第四次免疫作用之后，小鼠血清中的抗HPV16中和抗體活性被檢測(cè)（圖13)。 1'-5冊(cè)￥1611￥1^免疫組具有78%的中和活性（中值），而1'-1冊(cè)￥1611￥1^免疫組具有33% 的中和活性。在兩組之間，中和活性顯示出顯著性差異。
[0154] 8、在利用還原劑處理之后，加熱/冷卻作用的評(píng)價(jià)（未處理、0 -巰基乙醇處理以 及在0 _巰基乙醇處理之后進(jìn)行加熱和冷卻條件的比較）
[0155] 如上文結(jié)果可知的，高純度的L1蛋白可以通過(guò)第一肝素層析獲得。為了具體評(píng)價(jià) 在利用還原劑處理之后進(jìn)行加熱/冷卻對(duì)L1蛋白純度的作用，兩種類型的試驗(yàn)被執(zhí)行。在 第一種試驗(yàn)中，在未處理時(shí)，當(dāng)僅利用還原劑處理的時(shí)候（0 _巰基乙醇處理方法），和當(dāng)在 利用還原劑處理之后執(zhí)行加熱/冷卻的時(shí)候（T-5提純方法，0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）， 在肝素層析之后，比較L1蛋白的純度。在第二種試驗(yàn)中，在未處理時(shí)，當(dāng)僅執(zhí)行加熱/冷卻 的時(shí)候（加熱和冷卻方法），和當(dāng)在利用還原劑處理之后執(zhí)行加熱/冷卻的時(shí)候（T-5提純 方法，0 _巰基乙醇+加熱和冷卻），在肝素層析之后，比較L1蛋白的純度。
[0156] 表1和2示出分別在第一種和第二種試驗(yàn)中，對(duì)于肝素層析來(lái)說(shuō)，在每種條件下的 蛋白量和清除上樣試樣的污染蛋白的比率。如在表1中所示的，在未處理和當(dāng)利用還原劑 處理的時(shí)候，24至25%的蛋白在肝素層析之前被清除，但是當(dāng)加熱/冷卻在利用還原劑進(jìn) 行處理之后被執(zhí)行的時(shí)候，66%的蛋白被清除。同樣地，在表2中，在未處理和當(dāng)利用還原 劑處理的時(shí)候，34至40%的蛋白在肝素層析之前被清除，但是當(dāng)加熱/冷卻在利用還原劑 進(jìn)行處理之后被執(zhí)行的時(shí)候，70%的蛋白被清除。
[0157][表1]

【權(quán)利要求】
1. 一種提純?nèi)巳轭^瘤病毒（HPV) L1蛋白的方法，包含： (a) 培養(yǎng)表達(dá)HPV L1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，收獲所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，并破碎所述細(xì) 胞； (b) 將還原劑添加至宿主細(xì)胞的勻漿；和 (c) 通過(guò)對(duì)添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿執(zhí)行層析來(lái)提純HPV L1蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包含： 在操作（b)之后， 將添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿保持在室溫。
3. -種提純?nèi)巳轭^瘤病毒（HPV)Ll蛋白的方法，包含： (i) 培養(yǎng)表達(dá)HPV L1蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，收獲所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞并破碎所述細(xì) 胞； (ii) 將還原劑添加至宿主細(xì)胞的勻漿； (iii) 加熱和冷卻添加還原劑的宿主細(xì)胞的勻漿；和 (iv) 通過(guò)對(duì)加熱和冷卻的宿主細(xì)胞的勻漿執(zhí)行層析來(lái)提純HPV L1蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和3任一項(xiàng)所述的方法，其中HPV選自由HPV6a型、HPV 6b型、HPV 11 型、HPV 16 型、HPV 18 型、HPV 30 型、HPV 31 型、HPV 33 型、HPV 35 型、HPV 39 型、HPV 41 型、HPV 42 型、HPV 43 型、HPV 44 型、HPV 45 型、HPV 51 型、HPV 52 型、HPV 54 型、HPV 55型、HPV 56型、HPV 58型、HPV 68型和HPV 70型構(gòu)成的組。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1和3任一項(xiàng)所述的方法，其中宿主細(xì)胞為細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì) 胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中酵母細(xì)胞為釀酒酵母、畢赤酵母或多形漢遜酵 母。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1和3任一項(xiàng)所述的方法，其中還原劑選自由0 -巰基乙醇、二硫蘇 糖醇（DTT)、2-巰基乙胺-HC1、三（2-羧乙基）磷化氫（TCEP)或半胱氨酸-HC1構(gòu)成的組。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1和3任一項(xiàng)所述的方法，其中還原劑為0 -巰基乙醇或二硫蘇糖 醇。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中0-巰基乙醇被添加至宿主細(xì)胞的勻漿至具有 0. lwt%或更高的最終濃度。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中二硫蘇糖醇被添加至宿主細(xì)胞的勻漿至具有 2mM或更高的最終濃度。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，加熱在高于室溫的溫度下執(zhí) 行。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，在操作（iii)中，高于室溫的溫度為高于 25。。。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在操作（iii )中，高于室溫的溫度為高于25°C 并低于80°C。
14. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，加熱被執(zhí)行10分鐘至72小 時(shí)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，冷卻在0至10°C下執(zhí)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求1和3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述層析為離子交換層析、肝素層析 或親和層析。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK104507956SQ201380040425
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月30日
【發(fā)明者】金洪珍, 金亨真 申請(qǐng)人:金洪珍