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血腦屏障穿梭體的制作方法

文檔序號:3490367閱讀:1896來源:國知局
血腦屏障穿梭體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及結(jié)合血腦屏障上的受體(R/BBB)的血腦屏障穿梭體及其使用方法。
【專利說明】血腦屏障穿梭體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合血腦屏障上的受體(R/BBB)的血腦屏障穿梭體及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)疾病藥物(例如具有低腦穿透的大生物治療藥物或小分子藥物)的腦穿透, 受廣泛的且不可滲透的血腦屏障(BBB)以及神經(jīng)血管單元(NVU)中的其它細胞組分嚴(yán)格限 制。已經(jīng)試驗了許多克服該阻礙的策略,并且一種策略是利用在腦毛細血管內(nèi)皮上表達的 內(nèi)源性受體所介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運途徑。已經(jīng)針對這些受體設(shè)計了重組蛋白諸如單克隆抗體或 肽,以實現(xiàn)受體介導(dǎo)的生物治療劑向腦的遞送。但是,使腦攝取最大化、同時使腦內(nèi)皮細胞 (BEC)內(nèi)的錯誤分選(miss-sorting)以及在BEC中的某些細胞器(特別是導(dǎo)致生物治療劑 的降解的細胞器)內(nèi)的積累程度最小化的策略仍未得到探究。
[0003] 單克隆抗體和其它生物治療劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的病理學(xué)中具有巨大 治療潛力。但是,它們進入腦中的途徑被BBB阻止。以前的研究已經(jīng)闡明,非常小百分比(大 約0? 1% )的在血流中注射的IgG能夠穿透進CNS隔室中(Felgenhauer,Klin. Wschr. 52 : 1158-1164(1974))。由于抗體在CNS內(nèi)的低濃度,這必然會限制任何藥理學(xué)作用。
[0004] 因此,需要使神經(jīng)疾病藥物穿過BBB的遞送系統(tǒng),以將藥物有效地穿梭進腦中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在第一方面,本發(fā)明提供了一種血腦屏障穿梭體,其包含腦效應(yīng)物實體、接頭和一 個結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié)合實體,其中所述接頭將所述效應(yīng)物實體與所述結(jié)合血腦屏 障受體的單價結(jié)合實體偶聯(lián)。
[0006] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié) 合實體選自蛋白、多肽和肽。
[0007] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié) 合實體包含選自以下的分子:血腦屏障受體配體、scFv、Fv、sFab、VHH,優(yōu)選sFab。
[0008] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述血腦受體選自轉(zhuǎn)鐵蛋白受 體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白8、低密度脂蛋白受 體相關(guān)的蛋白1和結(jié)合肝素的表皮生長因子樣生長因子,優(yōu)選轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
[0009] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié) 合實體包含一個針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab,更具體地是識別被包含在Seq. Id. No. 14、15 或16的氨基酸序列中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)的表位的scFab。
[0010] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述腦效應(yīng)物實體選自神經(jīng)疾病 藥物、神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子、酶、細胞毒性劑、針對腦靶標(biāo)的抗體、針對腦靶標(biāo)的單克隆 抗體、針對腦祀標(biāo)的肽。
[0011] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述腦靶標(biāo)選自0 -分泌酶1、 A3、表皮生長因子、表皮生長因子受體2、Tau、磷酸化的Tau、載脂蛋白E4、a突觸核蛋白、 a突觸核蛋白的寡聚片段、CD20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白、富含亮氨酸的重復(fù)序列激酶2、 帕金蛋白、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6、淀粉樣蛋白前體蛋白、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 和胱天蛋白酶6。
[0012] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述腦效應(yīng)物實體選自蛋白、多 肽和肽。
[0013] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述結(jié)合血腦受體的單價結(jié)合 實體選自蛋白、多肽和肽,且所述單價結(jié)合實體通過所述接頭偶聯(lián)至所述腦效應(yīng)物實體的 c-末端。
[0014] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述腦效應(yīng)物實體包含針對腦靶 標(biāo)的全長抗體,優(yōu)選全長IgG。
[0015] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述血腦屏障穿梭體包含作為腦 效應(yīng)物實體的全長IgG抗體、接頭和一個作為結(jié)合血腦受體的單價結(jié)合實體的scFab,其中 所述scFab通過所述接頭偶聯(lián)至所述IgG抗體的重鏈之一的Fc部分的C-末端。
[0016] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述效應(yīng)物實體是針對AP的全 長抗體。
[0017] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述針對A0的抗體包含:(a) H-CDR1,其包含Seq. Id. No. 5的氨基酸序列,(b)H_CDR2,其包含Seq. Id. No. 6的氨基酸序 列,(c)H_CDR3,其包含 Seq.Id.No.7 的氨基酸序列,(d)L-CDRl,其包含 Seq.Id.No.8 的 氨基酸序列,(6)1^-〇?2,其包含5叫.1(0〇.9的氨基酸序列,和江)1-〇)1?3,其包含5叫. Id. No. 10的氨基酸序列。
[0018] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述針對AP的抗體包含:包含 Seq. Id. No. 11的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域和包含Seq. Id. No. 12的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。 [0019] 在血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述效應(yīng)物實體是針對AP的全長 抗體,且所述單價結(jié)合實體是針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab,更具體地是識別被包含在Seq. Id. No. 14、15或16的氨基酸序列中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)的表位的scFab。
[0020] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述針對腦靶標(biāo)的血腦屏障穿梭 體的抗體的第一重鏈包含第一二聚化模塊,且所述針對腦靶標(biāo)的血腦屏障穿梭體的抗體的 第二重鏈包含第二二聚化模塊,從而允許所述兩個重鏈的異源二聚化。
[0021] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,根據(jù)突出物進入孔洞(knobs into holes)策略,所述針對腦祀標(biāo)的血腦屏障穿梭體的抗體的第一重鏈的第一二聚化模 塊包含突出物,且所述針對腦靶標(biāo)的血腦屏障穿梭體的抗體的第二重鏈的二聚化模塊包含 孔洞。
[0022] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述效應(yīng)物實體是針對磷酸化的 Tau的全長抗體,且所述單價結(jié)合實體是一個針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab。
[0023] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述效應(yīng)物實體是針對a突觸 核蛋白的全長抗體,且所述單價結(jié)合實體是一個針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab。
[0024] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述接頭是肽接頭,優(yōu)選地是具 有至少25個氨基酸長度的氨基酸序列的肽,更優(yōu)選地具有30-50個氨基酸的長度,特別地 所述接頭是(G 4S)6G2或(G4S)4。
[0025] 本發(fā)明的下述3個實施方案涉及血腦屏障穿梭體,其中所述腦效應(yīng)物實體是蛋 白、多肽或肽,前提條件是,所述腦效應(yīng)物實體不是全長抗體,尤其全長IgG。
[0026] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié) 合實體包含CH2-CH3 Ig實體和一個結(jié)合血腦屏障受體的sFab,其中所述sFab通過第二接 頭偶聯(lián)至CH2-CH3 Ig實體的C-末端。
[0027] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述血腦屏障穿梭體包含腦效應(yīng) 物實體、接頭、CH2-CH3 Ig結(jié)構(gòu)域、第二接頭和一個結(jié)合血腦屏障受體的sFab,其中所述腦 效應(yīng)物實體通過第一接頭偶聯(lián)至CH2-CH3Ig結(jié)構(gòu)域的N-末端,且所述sFab通過第二接頭 偶聯(lián)至CH2-CH3 Ig結(jié)構(gòu)域的C-末端。
[0028] 在所述血腦屏障穿梭體的一個特定實施方案中,所述CH2-CH3 Ig實體是CH2-CH3 IgG實體。
[0029] 此外,本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的血腦屏障穿梭體的分離的核酸、包含編碼所述血 腦屏障穿梭體的分離的核酸的宿主細胞、和包含所述血腦屏障穿梭體的藥物制劑。
[0030] 本發(fā)明的血腦屏障穿梭體可以用作藥物,特別地,它可以用于治療神經(jīng)疾病例如 阿爾茨海默病。
[0031] 本發(fā)明的血腦屏障穿梭體可以用于運輸所述腦效應(yīng)物實體穿過血腦屏障。
[0032] 在一個特定實施方案中,本發(fā)明的血腦屏障穿梭體的IgG抗體的重鏈(其在Fc部 分的C-末端處偶聯(lián)至scFab,所述scFab作為結(jié)合血腦屏障受體的單價結(jié)合實體)具有下 述結(jié)構(gòu):
[0033] ? IgG 重鏈,
[0034] ?接頭,其將IgG重鏈的Fc部分的C-末端偶聯(lián)至scFab的VL結(jié)構(gòu)域的N-末端,
[0035] ? scFab的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)和C-k輕鏈結(jié)構(gòu)域,
[0036] ?接頭,其將scFab的C-k輕鏈結(jié)構(gòu)域的C-末端偶聯(lián)至scFab的VH結(jié)構(gòu)域的 N-末端,
[0037] ? scFab抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和IgG CH3重鏈結(jié)構(gòu)域。
[0038] 在第二方面,本發(fā)明提供了一種運輸腦效應(yīng)物實體穿過血腦屏障的融合蛋白,所 述融合蛋白包含CH2-CH3 Ig實體、接頭和一個針對血腦屏障受體的sFab,其中所述sFab通 過所述接頭偶聯(lián)至CH2-CH3 Ig實體的C-末端。
[0039] 在本發(fā)明的融合蛋白的一個特定實施方案中,本發(fā)明的融合蛋白進一步包含在 CH2-CH3 Ig實體的N-末端處的接頭,以將所述腦效應(yīng)物實體偶聯(lián)至CH2-CH3 Ig實體的 N-末端。
[0040] 在本發(fā)明的融合蛋白的一個特定實施方案中,所述腦效應(yīng)物實體選自神經(jīng)疾病藥 物、神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子、酶、細胞毒性劑、選自scFv、Fv、scFab、Fab、VHH、F(ab') 2的針 對腦靶標(biāo)的抗體片段或肽。
[0041] 在本發(fā)明的融合蛋白的一個特定實施方案中,所述針對血腦屏障受體的sFab是 針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的sFab,優(yōu)選地是識別被包含在Seq. Id. No. 14、15或16的氨基酸序列中 的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)的表位的scFab。
[0042] 在本發(fā)明的融合蛋白的一個特定實施方案中,所述接頭是肽接頭,尤其是具有至 少15個氨基酸長度的氨基酸序列的肽,更優(yōu)選地具有20-50個氨基酸的長度,最特別地所 述接頭具有氨基酸序列(G4S)6G2(Seq. Id. No. 13)或(G4S)4(Seq. Id. No. 17)。
[0043] 在本發(fā)明的融合蛋白的一個特定實施方案中,所述CH2-CH3Ig實體是CH2-CH3 IgG實體。
[0044] 此外,本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明的融合蛋白的分離的核酸和包含編碼本發(fā)明 的融合蛋白的核酸的宿主細胞。
[0045] 在第三方面,本發(fā)明提供了一種綴合物,其包含本發(fā)明的融合蛋白和腦效應(yīng)物實 體,所述腦效應(yīng)物實體通過接頭偶聯(lián)至本發(fā)明的融合蛋白的CH2-CH3Ig實體的N-末端。
[0046] 在本發(fā)明的綴合物的一個特定實施方案中,所述腦效應(yīng)物實體是神經(jīng)營養(yǎng)因子, 且其中將所述神經(jīng)營養(yǎng)因子偶聯(lián)至CH2-CH3Ig實體的N-末端的接頭是肽接頭。
[0047] 此外,本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的綴合物和藥用載體的藥物制劑,所述綴合物作 為藥物的用途,尤其是所述綴合物用于治療神經(jīng)變性疾病、尤其是阿爾茨海默病的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1:在實施例中使用的不同形式的血腦屏障穿梭體(融合蛋白)。1A:針對A3 的IgG(mAb31)。1B:針對TfR的單Fab(sFab),其偶聯(lián)至針對AP的IgG(mAb31)的Fc部分。 1C :針對TfR的雙Fab (dFab),其偶聯(lián)至針對A 0的IgG (mAb31)的Fc部分。所述scFab結(jié) 構(gòu)與IgG抗體的重鏈的C-末端融合。
[0049] 圖2:融合蛋白對AP結(jié)構(gòu)的結(jié)合性能。使用ELISA方案測量結(jié)合親和力,所述 ELISA方案表明,所述Fab構(gòu)建體已經(jīng)保留A 0結(jié)合性能。mAb31-8D3構(gòu)建體與A 0纖絲的 結(jié)合。盡管8D3(空心正方形)不會結(jié)合固定化的AP纖絲,但是mAb31-8D3-dFab(實心正 方形)、mAb31-8D3-sFab (空心三角形)和mAb31(實心三角形)以可比較的親和力結(jié)合。
[0050] 圖3:所述構(gòu)建體對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的結(jié)合性能。使用ELISA方案測量結(jié)合 親和力,所述ELISA方案表明,僅Fab構(gòu)建體結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR),且雙Fab構(gòu)建體由 于二價結(jié)合模式而具有稍微更高的表觀親和力。mAb31-8D3構(gòu)建體與mTfR的結(jié)合。盡管 mAb31(實心三角形)不會結(jié)合固定化的mTfR,但是mAb31-8D3-dFab (實心正方形)的結(jié)合 親和力與8D3親本抗體(空心正方形)的結(jié)合親和力相當(dāng)。單價構(gòu)建體mAb31-8D3-sFab (空 心三角形)顯示出中間結(jié)合親和力。
[0051] 圖4 :抗-A P單克隆抗體mAb31 (圖4A)、單Fab mAb31 (與mAb31的C-末端融合 的單Fab)(圖4B)和雙Fab mAb31 (與mAb31的C-末端融合的雙Fab)(圖4C)的斑塊染 色。將構(gòu)建體注射進PS2APP小鼠(n = 3/構(gòu)建體),單次靜脈內(nèi)給藥10mg/kg,然后在給藥 后8小時進行腦灌注。分析包括斑塊結(jié)合的免疫組織化學(xué)和共焦顯微術(shù)。數(shù)據(jù)表明,僅單 Fab-mAb31構(gòu)建體能夠穿過BBB并結(jié)合斑塊。該圖顯示了得自所有動物的腦的一個代表性 區(qū)域。
[0052] 圖5:顯示了雙Fab_mAb31構(gòu)建體的定量。在所有3只治療的動物的3個不同區(qū)域 (每種構(gòu)建體共計9個區(qū)域)定量斑塊和毛細血管染色。數(shù)據(jù)表明,僅雙Fab-mAb31構(gòu)建體 與mAb31相比存在毛細血管的增加。沒有檢測到在斑塊處(在腦內(nèi))增加的雙Fab-mAb31 水平。以l〇mg/kg給藥后8h,mab31 (HEK對照)相對于雙Fab_mab3的定量。
[0053] 圖6:顯示了單Fab_mAb31構(gòu)建體的定量。在所有3只治療的動物的3個不同區(qū) 域(每種構(gòu)建體共計9個區(qū)域)定量斑塊和毛細血管染色。數(shù)據(jù)表明,單Fab-mAb31構(gòu)建 體與mAb31相比存在斑塊的大量增加。熒光信號的定量指示,單Fab-mAb31與mAb31構(gòu)建 體相比超過50倍的增加。單Fab-mAb31構(gòu)建體與mAb31相比也存在毛細血管中的短暫染 色,從而指示穿過BBB。以10mg/kg給藥后8h和以25mg/kg給藥后24h,mab31 (HEK對照) 相對于單Fab_mab31的定量。
[0054] 圖7 :2種不同劑量的抗-AP單克隆抗體mAb31和非常低劑量的單FabmAb31(與 mAb31的C-末端融合的單Fab)的斑塊染色。將構(gòu)建體注射進PS2APP小鼠(n = 3/構(gòu)建體) 中,單次靜脈內(nèi)給藥,然后在給藥后的不同時間點進行腦灌注。分析包括斑塊結(jié)合的免疫組 織化學(xué)和共焦顯微術(shù)。數(shù)據(jù)表明,僅單Fab-mAb31構(gòu)建體能夠穿過BBB并結(jié)合斑塊。對于 單Fab-mAb31構(gòu)建體而言,腦暴露是非??焖俚模⑶野邏K染色從單次施用持續(xù)超過至少1 周。
[0055] 圖8 :用單Fab-mab31或雙Fab-mAb31處理的TfR的細胞表面表達的定量。雙 Fab-mAb31構(gòu)建體對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的細胞表面減量調(diào)節(jié)。將表達TfR的腦內(nèi)皮細胞 與單Fab-mAb31構(gòu)建體(圖8A)或雙Fab-mAb31構(gòu)建體(圖8B) -起溫育24小時。僅雙 Fab-mAb31構(gòu)建體降低了細胞表面表達的TfR的水平。
[0056] 圖9:用單Fab_mab31或雙Fab_mAb31處理的TfR的體內(nèi)細胞運輸。在體內(nèi)研究 毛細血管和斑塊染色的早期時間點。sFab-MAb31 (圖9A)和dFab-MAb31 (圖9B)在注射后 15分鐘將腦脈管系統(tǒng)染色,它們的分布沒有差異。注射后8小時,sFab-MAb31達到實質(zhì)并 將淀粉樣蛋白斑塊染色(箭頭,圖9C),而dFab-MAb31停留在腦脈管系統(tǒng)內(nèi),類似于15分鐘 時間點(圖9D)。對于dFab-MAb31而言,在實質(zhì)中沒有檢測到淀粉樣蛋白斑塊。
[0057] 圖10:用單Fab_mab31或雙Fab_mAb31處理的TfR的體內(nèi)細胞運輸。為了控 制在研究中使用的所有構(gòu)建體的完整性,使用MAb31(圖10A)、sFab-MAb31(圖10B)或 dFab-MAB31(圖10C),進行18個月小鼠APP轉(zhuǎn)基因腦冷凍切片的染色。圖10D顯示了對照 的結(jié)果。結(jié)果表明,所有3種構(gòu)建體檢測到轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中的淀粉樣蛋白斑塊。
[0058] 圖11:用單Fab_mab31處理的TfR的體內(nèi)細胞運輸。對體內(nèi)處理過的樣品的高分 辨率共焦顯微術(shù)表明,sFab-MAb31沒有將腦毛細血管的腔側(cè)染色,但是被包含在囊泡樣結(jié) 構(gòu)(其穿過內(nèi)皮細胞的腔膜)內(nèi)和內(nèi)皮細胞胞質(zhì)溶膠內(nèi)。在圖11中的箭頭指示在內(nèi)皮細 胞細胞核的近腔側(cè)上含有sFab-MAb31構(gòu)建體的囊泡。這些數(shù)據(jù)提示,sFab-MAb31可以進 入腦內(nèi)皮細胞并穿過脈管系統(tǒng)和到達腦的實質(zhì)空間內(nèi)的淀粉樣蛋白斑塊(與圖9A和C對 比)。
[0059] 圖12:用雙Fab_mab31處理的TfR的體內(nèi)細胞運輸。對體內(nèi)處理過的樣品的高分 辨率共焦顯微術(shù)表明,dFab-MAb31沒有將腦毛細血管的腔側(cè)染色,但是被包含在囊泡樣結(jié) 構(gòu)(其穿過內(nèi)皮細胞的腔膜)內(nèi)和內(nèi)皮細胞胞質(zhì)溶膠內(nèi)。在圖12中的箭頭指示在內(nèi)皮細 胞細胞核的近腔側(cè)上含有dFab-MAb31構(gòu)建體的囊泡。這些數(shù)據(jù)提示,dFab-MAb31可以進 入腦內(nèi)皮細胞,但是被捕集,不能穿過脈管系統(tǒng),且因此不能到達腦的實質(zhì)空間內(nèi)的淀粉樣 蛋白斑塊(與圖圖9B和D對比)。
[0060] 圖13:靜脈內(nèi)施用以后的腦暴露和斑塊染色。圖13A:將mAb31、dFab和sFab構(gòu) 建體以10mg/kg靜脈內(nèi)地注射進PS2APP轉(zhuǎn)基因動物,在注射后8小時將動物灌注和處死。 dFab與mAb31相比,沒有檢測到斑塊染色的顯著增加。對于sFab構(gòu)建體,基于來自檢測抗體 的在555nm的熒光強度,檢測到比親本mAb31高55倍的斑塊染色。注射后8小時,mAb31 (圖 13B)、dFab (圖13C)和sFab (圖13D)在皮質(zhì)中的代表性免疫組織化學(xué)染色。dFab僅顯示 微血管染色,而sFab廣泛地將淀粉樣蛋白斑塊染色。圖13E :證實了與2mg/kg和10mg/ kg mAb31相比,低劑量的sFab構(gòu)建體(2. 66mg/kg)會快速地且顯著地到達腦中的斑塊。 sFab構(gòu)建體的靶標(biāo)嚙合在注射后持續(xù)超過至少1周。免疫組織化學(xué)染色顯示了 2mg/kg的 mAb31 (圖13F)和2. 66mg/kg的sFab (圖13G)在注射后7天的斑塊染色。
[0061] 圖14 :在通過14次每周靜脈內(nèi)注射治療的、帶有斑塊的PS2APP小鼠中的慢性 研究的體內(nèi)效力。分別對于低劑量mAb31、中劑量mAb31、低劑量sFab和中劑量sFab (圖 14A-D),顯示了在研究結(jié)束時,與殘余斑塊結(jié)合的施用構(gòu)建體的靶斑塊結(jié)合。在斑塊的免疫 組織化學(xué)染色以后,顯示了皮質(zhì)和海馬的定量形態(tài)測定分析(圖14E)。在4. 5個月齡時處 死的未治療的動物的斑塊負(fù)載被顯示為在研究開始時的淀粉樣變性的基線水平。與在媒介 物治療的動物中觀察到的進行性斑塊形成相比,在用中劑量sFab治療以后,斑塊數(shù)目的顯 著減少是顯而易見的;減少的斑塊形成的趨勢甚至出現(xiàn)在低劑量sFab。因而,sFab構(gòu)建體 顯著減少了皮質(zhì)和海馬中的斑塊數(shù)目。斑塊尺寸的分析揭示了斑塊數(shù)目的減少,對于小斑 塊尺寸而言是最顯著的。*P < 〇? 05, < 0? 01,< 0? 001。
[0062] 圖15:具有與Fc C-端融合的TfR scFab片段的抗體多聚體沒有誘導(dǎo)ADCC。通過 定量LDH釋放,測量NK92介導(dǎo)的BA/F3小鼠紅白血病細胞的殺死。僅多聚體構(gòu)建體(其具 有結(jié)合TfR的Fab部分,呈"常規(guī)" "N-端至Fc"取向)誘導(dǎo)顯著的ADCC,而呈相反取向的 腦穿梭構(gòu)建體是沉默的。
[0063] 圖16:針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab 8D3結(jié)合小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細胞外結(jié)構(gòu)域中 的3個不同肽。通過抗體的化學(xué)發(fā)光檢測,揭示了有3個氨基酸重疊的抗體8D3-15聚體肽 的結(jié)合,所述抗體在攜帶固定化的mTfR肽的CelluSpot載玻片上溫育??颍罕?D3結(jié)合的 肽 #373、374 和 376 (Seq. Id. No. 15、16 和 17)。

【具體實施方式】
[0064] 定義
[0065] "血腦屏障"或"BBB"是指外周循環(huán)與腦和脊髓之間的生理屏障,其由腦毛細血 管內(nèi)皮質(zhì)膜內(nèi)的緊密連接部形成,從而建立限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道爾 頓))運輸進腦中的緊密屏障。腦內(nèi)的BBB、脊髓內(nèi)的血液-脊髓屏障和視網(wǎng)膜內(nèi)的血液-視 網(wǎng)膜屏障,是CNS內(nèi)的相連毛細血管屏障,并且在本文中被統(tǒng)稱為血腦屏障或BBB。BBB還 包括血液-CSF屏障(脈絡(luò)叢),其中屏障由室管膜細胞而不是毛細血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成。
[0066] 突出物進入孔洞二聚化模塊和它們在抗體工程中的應(yīng)用描述在:Carter P.; Ridgway J. B. B. ;Presta L. G. :Immunotechnology, Volume 2, Numberl, 1996 年 2 月,第 73-73 頁(1))。
[0067] "中樞神經(jīng)系統(tǒng)"或"CNS"是指控制身體功能的神經(jīng)組織的復(fù)合體,并且包括腦和 脊髓。
[0068] "血腦屏障受體"(本文中簡寫為"R/BBB")是在腦內(nèi)皮細胞上表達的細胞外膜連 接的受體蛋白,其能夠?qū)⒎肿舆\輸穿過BBB或者用于運輸外源施用的分子。本文中R/BBB 的例子包括:轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF-R)、低密度脂 蛋白受體(包括但不限于低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受體相關(guān) 的蛋白8(LRP8))、和結(jié)合肝素的表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。本文中的一種示例性 的R/BBB是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)。
[0069] "腦效應(yīng)物實體"是指要穿過BBB運輸至腦的分子。效應(yīng)物實體通常具有希望遞送 至腦的特征性治療活性。效應(yīng)物實體包括神經(jīng)疾病藥物和細胞毒性劑例如肽、蛋白和抗體, 尤其是針對腦靶標(biāo)的單克隆抗體或其片段。
[0070] "單價結(jié)合實體"是指能夠特異性地且以單價結(jié)合模式與R/BBB結(jié)合的分子。本發(fā) 明的血腦穿梭和/或綴合物的特征在于存在單價結(jié)合實體的單個單元,即本發(fā)明的血腦穿 梭和/或綴合物包含單價結(jié)合實體的一個單元。所述單價結(jié)合實體包括但不限于蛋白、多 肽、肽和抗體片段,包括Fab、Fab'、Fv片段、單鏈抗體分子例如單鏈Fab、scFv。所述單價 結(jié)合實體可以是例如使用現(xiàn)有技術(shù)(如噬菌體展示或免疫接種)工程改造的支架蛋白。所 述單價結(jié)合實體還可以是肽。在某些實施方案中,所述單價結(jié)合實體包含CH2-CH3Ig結(jié)構(gòu) 域和針對血腦屏障受體的單Fab (sFab)。所述sFab通過接頭偶聯(lián)至CH2-CH3 Ig結(jié)構(gòu)域的 C-末端。在某些實施方案中,所述sFab是指轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
[0071] "單價結(jié)合模式"是指與R/BBB的特異性結(jié)合,其中單價結(jié)合實體和R/BBB之間的 相互作用通過一個單獨表位而發(fā)生。由于單個表位相互作用點,單價結(jié)合模式會阻止R/BBB 的任何二聚化/多聚化。單價結(jié)合模式會阻止R/BBB的細胞內(nèi)分選發(fā)生變化。
[0072] 術(shù)語"表位"包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實施方案中,表 位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面分組(groupings),諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺酰 基,且在某些實施方案中,可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征,和或特定的帶電特性。表位是被 抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。
[0073] "轉(zhuǎn)鐵蛋白受體"("TfR")是一種跨膜糖蛋白(具有約180, 000的分子量),其由 參與脊椎動物中的鐵攝取的兩個二硫鍵鍵合的亞基(各自的表觀分子量為約90, 000)組 成。在一個實施方案中,本文中的TfR是人TfR,其包含例如在Schneider等.Nature 311: 675-678(1984)中的氨基酸序列。
[0074] 本文中使用的"神經(jīng)疾病"是指影響CNS和/或具有在CNS中的病因的疾病或病 癥。示例性的CNS疾病或病癥包括、但不限于:神經(jīng)病、淀粉樣變性、癌癥、眼的疾病或病癥、 病毒或微生物感染、炎癥、缺血、神經(jīng)變性疾病、癲癇發(fā)作、行為疾病和溶酶體貯積病。為了 本申請的目的,將理解CNS包括眼,其通常通過血液-視網(wǎng)膜屏障與身體的其它部分隔離。 神經(jīng)疾病的具體例子包括、但不限于:神經(jīng)變性疾?。òā⒌幌抻?,雷維小體?。↙ewy body disease),脊髓灰質(zhì)炎后綜合征(postpoliomyelitis syndrome),夏伊-德雷格綜合 征(Shy-Draeger syndrome),撤攬體腦橋小腦萎縮(olivopontocerebellar atrophy),帕 金森病(帕金蛋白son' s disease),多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy),紋狀體 黑質(zhì)變性(striatonigral degeneration), Tau 病變(tauopathy)(包括、但不限于,阿爾 茨海默病(Alzheimer disease)和核上性麻搏(supranuclear palsy)),|元病毒病(prion disease)(包括、但不限于,牛海綿狀腦?。╞ovine spongiform encephalopathy),癢病 (scrapie),克-雅綜合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome),庫魯病(kuru),格-施-沙 病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease),慢性消耗性疾?。╟hronic wasting disease),和致命性家族性失眠癥(fatal familial insomnia)),延髓性麻搏(bulbar palsy),運動神經(jīng)兀?。╩otor neuron disease),和 heterodegenerative 疾病(包括、 但不限于卡納范?。–anavan disease),亨廷頓病(Huntington' s disease),神經(jīng)兀 錯樣脂褐素沉積癥(neuronal ceroid-lipofuscinosis),亞歷山大?。ˋlexander' s disease),圖雷特綜合征(Tourette' s syndrome),門克斯扭結(jié)發(fā)綜合征(Menkes kinky hair syndrome),科凱恩綜合征(Cockayne syndrome),哈勒沃登-施帕茨綜合 征(Halervorden-Spatz syndrome),拉福拉?。╨afora disease),雷特綜合征(Rett syndrome),肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration),萊施-奈恩綜合征 (Lesch-Nyhan syndrome),和翁-隆綜合征(Unverricht-Lundborg syndrome)),癡呆(包 括、但不限于,皮克?。≒ick' s disease),和脊髓小腦性共濟失調(diào)(spinocerebellar ataxia)),癌癥(例如CNS和/或腦的癌癥,包括源自身體其它位置的癌癥的腦轉(zhuǎn)移灶)。
[0075] "神經(jīng)疾病藥物"是治療一種或多種神經(jīng)疾病的藥物或治療劑。本發(fā)明的神經(jīng)疾病 藥物包括,但不限于,小分子化合物,抗體,肽,蛋白質(zhì),一種或多種CNS靶標(biāo)的天然配體,一 種或多種CNS靶標(biāo)的天然配體的修飾形式,適體,抑制性核酸(即,小的抑制性RNA(siRNA) 和短發(fā)夾RNA (shRNA)),核酶,和小分子,或上述中任何一種的活性片段。本發(fā)明的示例性神 經(jīng)疾病藥物描述于此并且包括、但不限于:抗體,適體,蛋白質(zhì),肽,抑制性核酸和小分子和 上述中任何一種的活性片段,它們是它們本身或特異性識別和/或作用于(即,抑制,活化, 或檢測)CNS抗原或靶標(biāo)分子如,但不限于,淀粉樣蛋白前體蛋白或其部分,淀粉樣蛋白3, 3 -分泌酶,Y -分泌酶,tau,a -突觸核蛋白,帕金蛋白,亨廷頓蛋白,DR6,早老蛋白,ApoE, 神經(jīng)膠質(zhì)瘤或其它CNS癌癥標(biāo)志物,和神經(jīng)營養(yǎng)因子。神經(jīng)疾病藥物的非限制性例子以及 可以使用它們治療的對應(yīng)疾?。耗X衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),慢性腦損傷(神經(jīng)發(fā)生), 成纖維細胞生長因子2 (FGF-2),抗-表皮生長因子受體腦癌,(EGFR)-抗體,神經(jīng)膠質(zhì)細胞 系衍生的神經(jīng)因子,帕金森?。á荖F),腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),肌萎縮性側(cè)索硬化, 抑郁癥,溶酶體酶,腦的溶酶體貯積疾病,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF),肌萎縮性側(cè)索硬化,神 經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1,精神分裂癥,抗-HER2抗體(例如曲妥珠單抗),來自HER2-陽性癌癥的腦 轉(zhuǎn)移。
[0076] "成像劑"是這樣的化合物:其具有允許它的存在和/或位置被直接或間接檢測到 的一種或多種性質(zhì)。這樣的成像劑的例子包括蛋白和小分子化合物,其摻入使檢測成為可 能的標(biāo)記實體。
[0077] "CNS抗原"或"腦靶標(biāo)"是在CNS (包括腦)中表達的抗原和/或分子,其可以被抗 體或小分子所靶向。這樣的抗原和/或分子的例子包括、但不限于4 -分泌酶1 (BACE1)、 淀粉樣蛋白0 (AP )、表皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、載脂 蛋白E4(ApoE4)、a-突觸核蛋白、⑶20、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸的重復(fù) 序列激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、Y分泌酶、死亡受體6(DR6)、淀粉 樣蛋白前體蛋白(APP)、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一個實施方 案中,所述抗原是BACE1。
[0078] 本文中的"天然序列"蛋白質(zhì)是指包含在自然中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋 白質(zhì),包括所述蛋白質(zhì)的天然存在的變體。本文中使用的該術(shù)語包括從其天然來源分離的 蛋白質(zhì)或重組制備的蛋白質(zhì)。
[0079] 術(shù)語"抗體"在本文中以最寬的含義使用,并且具體地涵蓋單克隆抗體、多克隆抗 體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如、雙特異性抗體)和抗體片段,只要它 們表現(xiàn)出期望的生物活性即可。
[0080] "抗體片段"在本文中包括保持結(jié)合抗原的能力的完整抗體的一部分。抗體片段的 例子包括Fab、Fab '、F (ab') 2和Fv片段;雙體;線性抗體;單鏈抗體分子例如單鏈Fab、 scFv和由多個抗體片段形成的多特異性抗體。"單鏈Fab"形式例如描述在Hust M.等.BMC Biotechnol. 2007 年 3 月 8 日;7 :14 中。
[0081] 本文中使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體, 即除了可能的變體(該變體可以在產(chǎn)生單克隆抗體的過程中出現(xiàn),此類變體通常少量存 在)外,構(gòu)成群體的個體抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位。相比于通常包括針對不同 決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物,每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定 簇。除它們的特異性外,單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們不受其它免疫球蛋白的污染。修飾 語"單克隆"表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征,不應(yīng)解釋為要求通過任何特定 方法來生產(chǎn)抗體。例如,根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最先由Kohler等,Nature, 256 :495(1975)描述的雜交瘤方法制備,或可以通過重組DNA方法(參見,例如,美國 專利號4, 816, 567)制備。"單克隆抗體"也可以使用例如在Clackson等,Nature, 352 : 624-628(1991)和 Marks 等,J. Mol. Biol.,222 :581-597 (1991)中所述的技術(shù)從噬菌體抗 體文庫分離。本文中的單克隆抗體的具體實例包括嵌合抗體、人源化抗體和人抗體,包括 它們的抗原結(jié)合片段。單克隆抗體在本文中具體地包括:"嵌合"抗體(免疫球蛋白),其 中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相 應(yīng)序列相同或同源,而所述鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類 的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源;以及此類抗體的片段,只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活 性(美國專利號4,816,567以〇1'1^8〇11等,?1'〇(3.似七4〇3(1.5(^^54(美國國家科學(xué)院學(xué) 報)81:6851-6855 (1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括"靈長類源化(primatized)"抗 體,該抗體包含來源于非人靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey),如狒狒、恒河 猴(rhesus)或食蟹猴(cynomolgus monkey))的可變結(jié)構(gòu)域抗原-結(jié)合序列以及人恒定區(qū) 序列(美國專利號5, 693, 780)。
[0082] 非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在大部分情況中,人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體),其中受體高 變區(qū)的殘基被具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、 兔或非人靈長類動物)的高變區(qū)殘基替換。在有些情況中,將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR) 殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外,人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有 發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步改進抗體的性能。一般而言,人源化抗體將包含基本 上全部的至少一個、典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域,其中所有或基本上所有高變區(qū)對應(yīng)于非人免 疫球蛋白的高變區(qū),且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些,不同之處在于如 上所述的FR置換。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū),所述免疫球蛋 白恒定區(qū)典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)見例如Jones等,自然(Nature)321 : 522-525(1986) ;Riechmann 等,自然(Nature)332:323-329(1988) ; &Presta,Curr. Op.Struct. Biol. 2 :593_596(1992)。
[0083] "人抗體"在本文中是包含這樣的氨基酸序列結(jié)構(gòu)的抗體,所述氨基酸序列結(jié)構(gòu)與 可獲得自人B細胞的抗體的氨基酸序列結(jié)構(gòu)對應(yīng),并且包括人抗體的抗原結(jié)合片段??梢?通過多種技術(shù)鑒定或制備這樣的抗體,所述技術(shù)包括、但不限于:通過在免疫后能夠在不存 在內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)的情況下生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因動物(例如,小鼠)生產(chǎn)(參見,例 如,Jakobovits 等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,90 :2551 (1993) ;Jakobovits 等,Nature, 362 :255_258 (1993) ;Bruggermann 等,Year in Tmmuno. , 7 :33 (1993);和美國專利號 5, 591,669, 5, 589, 369和5, 545, 807));從表達人抗體或人抗體片段的噬菌體展示文庫選 擇(參見,例如,McCafferty等,Nature 348:552-553(1990) ;Johnson等,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993) ;Clackson 等,Nature, 352:624-628 (1991); Marks等,J.Mol.Biol. 222 :581-597(1991) ;Griffith等,EMBO J. 12:725-734(1993);美國 專利號5, 565, 332和5, 573, 905);通過體外活化的B細胞生成(參見美國專利5, 567, 610 和5, 229, 275);和分離自生產(chǎn)人抗體的雜交瘤。
[0084] "多特異性抗體"在本文中是對至少兩個不同的表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例 性多特異性抗體可以結(jié)合R/BBB和腦抗原兩者。多特異性抗體可以被制備成全長抗體或抗 體片段(例如F(ab' )2雙特異性抗體)。也預(yù)期有改造的具有兩個、三個或更多個(例如 四個)功能性抗原結(jié)合位點的抗體(參見,例如,美國申請?zhí)朥S 2002/0004587 Al,Miller 等)。多特異性抗體可以被制備成全長抗體或抗體片段。
[0085] 本文中的抗體包括具有改變的抗原結(jié)合或生物學(xué)活性的"氨基酸序列變體"。這樣 的氨基酸變化的例子包括具有增強的對抗原的親和力的抗體(例如"親和力成熟"抗體), 和具有改變的Fc區(qū)(如果存在的話)的抗體,例如具有改變的(增加或減小的)依賴抗體 的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或依賴補體的細胞毒性(CDC)的抗體(參見,例如,W0 00/42072, Presta,L.和W0 99/51642, Iduosogie等);和/或具有增加的或減小的血清半 衰期的抗體(參見,例如,W000/42072, Presta,L.)。
[0086] "親和力修飾的變體"具有一個或多個被置換的親本抗體的高變區(qū)或框架殘基(例 如親本嵌合、人源化或人抗體的),其改變(增加或減小)親和力。在一個實施方案中,根據(jù) 本發(fā)明,所得的被選用于進一步開發(fā)的變體將具有減小的對R/BBB的親和力。產(chǎn)生這種置 換變體的簡便方式是使用噬菌體展示。簡言之,將若干個高變區(qū)位點(例如6-7個位點) 突變以在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基置換。因此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式從絲狀噬菌 體顆粒展示為與包裝在每個顆粒內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物的融合體(fusion)。然后對噬菌 體展示的變體的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)進行篩選。為了鑒定用于修飾的候選高變 區(qū)位點,可以進行丙氨酸掃描誘變以鑒別顯著有助于抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基。可替換地,或 另外地,可能有利的是分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)從而鑒別抗體及其靶標(biāo)間的接觸 點。根據(jù)本文所述的技術(shù),這樣的接觸殘基和鄰近殘基是置換的候選物。在這樣的變體產(chǎn) 生后,對一組變體進行篩選,并且可以選擇具有改變的親和力的抗體用于進一步的開發(fā)。 [0087] 本文中的抗體可以是"糖基化變體"以使與Fc區(qū)相連的任何糖(如果存在的 話)被改變。例如,具有缺乏與抗體的Fc區(qū)偶聯(lián)的巖藻糖的成熟糖結(jié)構(gòu)的抗體描述于美 國專利申請?zhí)?US 2003/0157108 (Presta,L.)中。也參見 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd)。在與抗體的Fc區(qū)連接的糖中具有平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的 抗體引用在 W0 2003/011878(Jean-Mairet 等)和美國專利號 6,602,684(Umana 等)中。 在與抗體的Fc區(qū)連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體在W0 1997/30087, Patel 等中被報道。也參見 W0 1998/58964(Raju,S.)和 W0 1999/22764(Raju,S.),其涉及具 有改變的與其Fc區(qū)連接的糖的抗體。也參見US 2005/0123546 (Umana等),其描述了具 有修飾的糖基化的抗體。術(shù)語"高變區(qū)"當(dāng)在本文中使用時是指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的 氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變結(jié) 構(gòu)域中的殘基24-34 (L1)、50-56(L2)和89-97 (L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35 (H1)、 50_65(H2)和95-102 (H3) ;Kabat 等,免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版?公眾健康服務(wù)(Public Health Service),國立衛(wèi) 生研究所(National Institutes of Health),Bethesda,MD. (1991))和/或來自"高變環(huán)" 的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重鏈 可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3) ;Chothia和Lesk,分子生物學(xué)雜志 (J. Mol. Biol.) 196 :901-917 (1987))。"框架"或"FR"殘基是不同于本文所定義的高變區(qū)殘 基的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。
[0088]"全長抗體"是這樣的抗體,其包含抗原-結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和 重鏈恒定結(jié)構(gòu)域,CH1,CH2和CH3。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序 列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。
[0089]"裸抗體"是沒有綴合異源分子(如細胞毒性實體、聚合物或放射性標(biāo)記)的抗體 (如本文所定義的)。
[0090] 抗體"效應(yīng)子功能"指那些可歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列 變體Fc區(qū))的生物學(xué)活性??贵w效應(yīng)子功能的例子包括:Clq結(jié)合,補體依賴性細胞毒性 (CDC),F(xiàn)c受體結(jié)合,抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)等。在一個實施方案中,本文 中的抗體基本上缺少效應(yīng)子功能。
[0091] 術(shù)語"抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC) "是指在有效應(yīng)細胞存在下抗體對人 靶細胞的裂解。術(shù)語"補體依賴性的細胞毒性(CDC)"指由補體因子Clq與大多數(shù)IgG抗 體亞類的Fc部分結(jié)合而起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點的定義的蛋 白-蛋白相互作用所導(dǎo)致。這樣的Fc部分結(jié)合位點是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。這些Fc部分結(jié) 合位點例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329 (根據(jù) Kabat的EU索引編號)。亞類IgGl、IgG2和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結(jié)合的補 體激活,而IgG4不激活補體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。
[0092] 取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列,可以將全長抗體分配到不同的"類別"。 有五個主要類別的全長抗體:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且這些中的數(shù)個可以進一步被 劃分為"亞類"(同種型),例如,IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類別的 抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為a、S、 e、Y和y。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié) 構(gòu)和三維構(gòu)型是已知的。術(shù)語"重組抗體",當(dāng)在本文中使用時,是指這樣的抗體(例如嵌 合、人源化或人抗體或其抗原結(jié)合片段),該抗體由包含編碼所述抗體的核酸的重組宿主細 胞表達。用于生產(chǎn)重組抗體的"宿主細胞"的例子包括:(1)哺乳動物細胞,例如,中國倉 鼠卵巢(CH0)、C0S、骨髓瘤細胞(包括Y0和NS0細胞),幼倉鼠腎細胞(BHK),Hela細胞和 Vero細胞;(2)昆蟲細胞,例如,sf9, sf21和Tn5 ; (3)植物細胞,例如屬于煙草屬(genus Nicotiana)的植物(例如煙草(Nicotiana tabacum)) ;(4)酵母細胞,例如,屬于酵母屬 (genus Saccharomyces)的那些(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或?qū)儆谇?霉屬(genus Aspergillus)的那些(例如黑曲霉(Aspergillus niger)) ; (5)細菌細胞,例 如大腸桿菌(Escherichia, coli)細胞或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞等。
[0093] 本文中使用的"特異性結(jié)合"或"特異地結(jié)合"是指抗體選擇性地或優(yōu)先地結(jié)合抗 原。通常使用標(biāo)準(zhǔn)測定,如斯卡查德分析或表面等離子共振技術(shù)(例如使用B1ACORE? )確定結(jié)合親和力。
[0094] 與參照抗體"結(jié)合相同表位的抗體"是指這樣的抗體,其在競爭測定中阻斷50%以 上的所述參照抗體與其抗原的結(jié)合,反之,參照抗體在競爭測定中阻斷50%以上的該抗體 與其抗原的結(jié)合。
[0095] 術(shù)語"細胞毒性劑"用在本發(fā)明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞 死亡或破壞的物質(zhì)。細胞毒性劑包括、但不限于:放射性同位素(例如,At211,1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32, Pb212 和 Lu 的放射性同位素);化療劑或 藥物(例如,甲氨蝶呤(methotrexate),阿霉素(adriamicin),長春花生物堿(vinca alkaloids)(長春新喊(vincristine),長春喊(vinblastine),依托泊苷(etoposide)), 多柔比星(doxorubicin),美法侖(melphalan),絲裂霉素(mitomycin) C,苯丁酸氮芥 (chlorambucil),柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑);生長抑制劑;酶及其片段如核 酸水解酶;抗生素;毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素,包 括其片段和/或變體。
[0096] 試劑例如藥物制劑的"有效量"是指在需要的劑量和時間階段有效獲得所需的治 療或預(yù)防結(jié)果的量。
[0097] 術(shù)語"Fc區(qū)"在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域,所述區(qū)域包含恒定 區(qū)的至少一部分。Fc區(qū)包含免疫球蛋白的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。該術(shù)語包括天然序列Fc區(qū) 和變體Fc區(qū)。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或Pr 〇230延伸至重鏈的羧 基端。但是,F(xiàn)c區(qū)的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非另外說明,F(xiàn)c區(qū) 或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號是根據(jù)EU編號系統(tǒng),其也被稱為EU索引,如在Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列), 第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991 中 所述。"框架"或"FR"是指除高變區(qū)(HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基??勺兘Y(jié)構(gòu)域的FR 通常由以下四個FR結(jié)構(gòu)域組成:FR1,F(xiàn)R2, FR3和FR4。因此,HVR和FR序列通常以下列順 序出現(xiàn)在 VH(或 VL)中:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0098] 本文中使用的術(shù)語"CH2-CH3 Ig實體"是指從免疫球蛋白CH2或CH3結(jié)構(gòu)域衍生 出的蛋白實體。"CH2-CH3 Ig實體"包含2個形成二聚體的"CH2-CH3"多肽。所述免疫球 蛋白可以是186、1§4、1 §0、1§£或1§11。在一個實施方案中,所述〇12-〇13以實體衍生自 IgG免疫球蛋白,且在本文中被稱作"CH2-CH3 IgG實體"。該術(shù)語包括CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的 天然序列和變體CH2-CH3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中,所述"CH2-CH3 Ig實體"衍生自人 重鏈CH2-CH3 IgG結(jié)構(gòu)域,所述結(jié)構(gòu)域從Cys226或從Pr〇230延伸至重鏈的羧基端。但是, Fc區(qū)的C-端賴氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非在本文中另外說明,CH2-CH3 結(jié)構(gòu)域區(qū)域或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號是根據(jù)EU編號系統(tǒng),其也被稱為EU索引,如在 Kabat 等,Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì) 的序列),第 5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD,1991中所述。
[0099] "綴合物"是與一個或多個異源分子綴合的本發(fā)明的融合蛋白,所述異源分子包 括、但不限于標(biāo)記、神經(jīng)疾病藥物或細胞毒性劑。
[0100] 本文中使用的"接頭"是指化學(xué)接頭或單鏈肽接頭,其將血腦屏障穿梭體和/或融 合蛋白和/或本發(fā)明的綴合物的不同實體共價地連接。例如,所述接頭將腦效應(yīng)物實體與 單價結(jié)合實體連接。例如,如果單價結(jié)合實體包含CH2-CH3 Ig實體和針對血腦屏障受體的 sFab,那么所述接頭將sFab與CH3-CH2 Ig實體的C-末端連接。將腦效應(yīng)物實體與單價結(jié) 合實體連接的接頭(第一接頭)和將sFab與CH2-CH3 Ig結(jié)構(gòu)域的C-末端連接的接頭(第 二接頭)可以相同或不同。
[0101] 可以使用單鏈肽接頭,其包含1-20個通過肽鍵連接的氨基酸。在某些實施方案 中,所述氨基酸選自2種天然存在的氨基酸。在某些其它實施方案中,所述氨基酸中的一個 或多個選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。在其它實施方案中,所 述接頭是化學(xué)接頭。在某些實施方案中,所述接頭是具有至少25個氨基酸長度的氨基酸序 列的單鏈肽,優(yōu)選地具有32-50個氨基酸的長度。在一個實施方案中,所述接頭是(GxS)n, 其中G =甘氨酸,S =絲氨酸(x = 3、n = 8、9或10且m = 0、l、2或3)或(x = 4和n = 6、7或8且m = 0、1、2或3),優(yōu)選地,其中x = 4,n = 6或7且m = 0、1、2或3,更優(yōu)選地, 其中x = 4,n = 7且m=2。在一個實施方案中,所述接頭是(G4S)4(Seq. Id. No. 17)。在一 個實施方案中,所述接頭是(G4S)6G2(Seq. Id.No. 13)。
[0102] 可以使用多種化學(xué)接頭進行綴合。例如,使用多種雙功能的蛋白偶聯(lián)劑諸如N-琥 珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(STOP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基) 環(huán)己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞氨基硫雜環(huán)戊烷(IT)、亞胺酯的雙功能衍生物(諸如己二亞 氨酸二甲酯HC1)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、二-疊氮基化 合物(諸如雙(對疊氮基苯甲?;┘和槎罚?、二-重氮鎗衍生物(諸如二_(對重氮鎗 苯甲酰基)_乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6_二異氰酸酯)和雙活性的氟化合物(諸 如1,5-二氟-2,4-二硝基苯),可以綴合單價結(jié)合實體或融合蛋白和腦效應(yīng)物實體。所述接 頭可以是"可切割的接頭",從而促進效應(yīng)物實體在遞送至腦以后的釋放。例如,可以使用酸 不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、光不穩(wěn)定的接頭、二甲基接頭或含有二硫鍵的接頭(Chari 等,Cancer Res. 52 :127-131 (1992);美國專利號 5, 208, 020)。
[0103] 共價綴合可以直接進行或通過接頭進行。在某些實施方案中,直接綴合通過構(gòu)建 蛋白融合體進行(即,通過編碼針對R/BBB的單價結(jié)合實體和效應(yīng)物實體的兩種基因的基 因融合并且表達為單一蛋白)。在某些實施方案中,直接綴合通過在針對R/BBB的單價結(jié) 合實體的兩部分之一上的反應(yīng)基團與腦效應(yīng)物實體上的對應(yīng)基團或接受體之間形成共價 鍵進行。在某些實施方案中,直接綴合通過將要綴合的兩種分子中的一種進行修飾(即基 因修飾)而進行,從而包括在適當(dāng)條件下形成與要綴合的其它分子的共價連接的反應(yīng)基團 (作為非限制性例子,巰基或羧基)。作為一個非限制性例子,可以引入具有期望的反應(yīng)基 團(即,半胱氨酸殘基)的分子(即,氨基酸),例如,引入到針對R/BBB抗體的單價結(jié)合實 體中,并且與神經(jīng)藥物形成二硫鍵。使核酸與蛋白共價綴合的方法也是本領(lǐng)域已知的(即, 光交聯(lián),參見,例如,Zats印in等? Russ. Chem. Rev?(俄羅斯化學(xué)綜述)74 :77-95 (2005))。 還可以使用多種接頭進行綴合。例如,使用多種雙功能的蛋白偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞胺 基-3_(2-吡啶基二硫)丙酸酯(STOP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己 烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞氨基硫雜環(huán)戊烷(IT)、亞胺酯的雙功能衍生物(諸如己二亞氨酸 二甲酯HC1)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、二-疊氮基化合 物(諸如雙(對疊氮基苯甲?;┘和槎罚⒍?重氮鎗衍生物(諸如二_(對重氮鎗苯 甲?;乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6_二異氰酸酯)和雙活性的氟化合物(諸 如1,5-二氟-2,4-二硝基苯),可以綴合單價結(jié)合實體和效應(yīng)物實體。也可以使用包含通 過肽鍵連接的1-20個氨基酸的肽接頭。在某些這樣的實施方案中,氨基酸選自20種天然 存在的氨基酸。在某些其它這樣的實施方案中,一個或多個氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。接頭可以是"可切割的接頭",從而促進效應(yīng)物實體在 遞送至腦后的釋放。例如,可以使用酸不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、光不穩(wěn)定的接頭、 二甲基接頭或含有二硫鍵的接頭(Chari等,Cancer Res. 52 :127-131 (1992);美國專利號 5, 208, 020)。
[0104] "標(biāo)記"是與本文中的融合蛋白偶聯(lián)并被用于檢測或成像的標(biāo)志物。這樣的標(biāo)記的 例子包括:放射性標(biāo)記、熒光團、生色團或親和標(biāo)簽。在一個實施方案中,標(biāo)記是用于醫(yī)療成 像的放射性標(biāo)記,例如tc99m或1123,或用于核磁共振(NMR)成像(也被稱為磁共振成像, mri)的自旋標(biāo)記,如又有碘-123,碘-131,銦-111,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,釓,錳,鐵 等。"個體"或"受試者"是哺乳動物。哺乳動物包括、但不限于,家養(yǎng)動物(例如,牛,羊,貓, 狗和馬),靈長類動物(例如,人和非人靈長類動物如猴),兔,以及嚙齒類動物(例如,小鼠 和大鼠)。在某些實施方案中,個體或受試者是人。
[0105] "分離的"抗體是這樣的抗體,其已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分離。在某些實施方 案中,將抗體純化至超過95%或99%純度,如通過例如電泳(例如,SDS-PAGE,等電聚焦 (IEF),毛細管電泳)或?qū)游觯ɡ?,離子交換或反相HPLC)確定的。對于用于評估抗體純 度的方法的綜述,參見,例如,F(xiàn)latman 等,J. Chromatogr. B 848 :79_87 (2007)。
[0106] 術(shù)語"包裝說明書"用于指常規(guī)地包含在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書,其含 有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、組合療法、禁忌癥和/或關(guān)于使用此類治療性產(chǎn)品的警告 的信息。
[0107] 術(shù)語"藥物制劑"指這樣的制劑,其以允許包含在其中的活性成分的生物學(xué)活性 有效的形式存在,并且不包含對被施用所述制劑的受試者具有不可接受的毒性的另外的成 分。
[0108] "藥用載體"是指藥物制劑中不同于活性成分的成分,其對受試者是無毒的。藥用 載體包括、但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0109] 本文中使用的"治療(treatment)"(及其語法變化如"治療(treat)"或"治療 (treating) ")指在嘗試改變待治療的個體的天然進程中的臨床干預(yù),并且可以為了預(yù)防或 在臨床病理學(xué)的進程中進行。治療的理想效果包括、但不限于防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā),緩和征 狀,消除疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果,預(yù)防轉(zhuǎn)移,降低疾病進展速率,改善或減輕疾 病狀態(tài),和征狀緩解或改善的預(yù)后。在某些實施方案中,將本發(fā)明的抗體用于延緩疾病的發(fā) 生或減緩疾病的進展。
[0110] 組合物和方法
[0111] 本發(fā)明的方法和制品使用,或包括,結(jié)合R/BBB的血腦屏障穿梭體和/或融合蛋 白。要用于生產(chǎn)或篩選單價結(jié)合實體的R/BBB抗原可以是,例如,包含所需表位的可溶形式 的或其部分(例如胞外結(jié)構(gòu)域)。可替換地,或另外地,在其細胞表面表達BBB-R的細胞可 以用于產(chǎn)生或篩選單價結(jié)合實體??捎糜谏a(chǎn)單價結(jié)合實體的R/BBB的其它形式對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員將是明顯的。本文中的R/BBB的例子包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰 島素樣生長因子受體(IGF-R)、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白1(LRP1)和LRP8和結(jié)合肝素 的表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明,選擇針對R/BBB的"單價結(jié)合"實體(例如針對TfR的單價結(jié)合實 體),這基于本文中證實此種單價結(jié)合實體顯示提高的CNS(例如,腦)攝取的數(shù)據(jù)。為 了鑒別此種結(jié)合實體,用于測量單價結(jié)合模式的多種測定是可用的,其包括、但不限于: Scatchard測定和表面等離子體共振技術(shù)(例如使用B1ACORE? )和本文描述的體內(nèi)研 究。
[0113] 因而,本發(fā)明提供了制備可用于將腦效應(yīng)物實體(例如神經(jīng)疾病藥物)運輸穿過 血腦屏障的單價結(jié)合實體的方法,所述方法包括:從針對R/BBB的單價結(jié)合部分集合中選 擇單價結(jié)合實體,因為它具有對R/BBB的單價結(jié)合模式。所述單價結(jié)合模式確保某些R/BBB 的有效BBB穿過,但是不會干擾受體正常細胞內(nèi)篩選。
[0114]對于神經(jīng)病疾病,可以選擇作為鎮(zhèn)痛藥的神經(jīng)藥物,包括、但不限于,麻 醉藥/阿片類鎮(zhèn)痛藥(即,嗎啡,芬太尼(fentanyl),丙碘酮(hydrocodone),哌 替陡(meperidine),美沙酮(methadone),輕嗎啡酮(oxymorphone),噴他佐辛 (pentazocine),丙氧芬(propoxyphene),曲馬朵(tramadol),可待因(codeine)和 輕可酮(oxycodone)),非留類抗炎藥(NSAID)(即,布洛芬(ibuprofen),萘普生 (naproxen),雙氯芬酸(diclofenac),二氟尼柳(diflunisal),依托度酸(etodolac), 非諾洛芬(fenoprofen),氟比洛芬(flurbiprofen),卩引哚美辛(indomethacin),酮 咯酸(ketorolac),甲芬那酸(mefenamic acid),美洛昔康(meloxicam),萘 丁美酮 (nabumetone),奧沙普秦(oxaprozin),卩比羅昔康(piroxicam),舒林酸(sulindac)和托 美?。╰olmetin)),皮質(zhì)類甾醇(即,可的松(cortisone),潑尼松(prednisone),潑尼松 龍(prednisolone),地塞米松(dexamethasone),甲潑尼龍(methylprednisolone)和去 炎松(triamcinolone)),抗偏頭痛劑(即,sumatriptin,阿莫曲普坦(almotriptan),夫 羅曲普坦(frovatriptan),舒馬普坦(sumatriptan),利扎曲普坦(rizatriptan),依來 曲普坦(eletriptan),佐米曲普坦(zolmitriptan),雙氫麥角胺(dihydroergotamine), 依來曲普坦(eletriptan)和麥角胺(ergotamine)),醋氨酚(acetaminophen),水楊酸 鹽(即,阿司匹林(aspirin),水楊酸膽堿(choline salicylate),水楊酸鎂(magnesium salicylate),二氟尼柳(diflunisal)和雙水楊酯(salsalate)),抗驚厥藥(S卩,卡 馬西平(carbamazepine),氯硝西泮(clonazepam),加巴噴?。╣abapentin),拉莫三嗪 (lamotrigine),普瑞巴林(pregabalin),噻加賓(tiagabine)和托卩比酯(topiramate)), 麻醉藥(g 卩,異氟醚(isoflurane),三氯乙烯(trichloroethylene),氟焼(halothane), 七氣焼(sevof lurane),苯佐卡因(benzocaine),氣普魯卡因(chloroprocaine), 可卡因(cocaine),環(huán)美卡因(cyclomethycaine),二甲卡因(dimethocaine),丙 氧卡因(propoxycaine),普魯卡因(procaine),奴佛卡因(novocaine),丙美卡因 (proparacaine),丁卡因(tetracaine),|5可替卡因(articaine),布 t匕卡因(bupivacaine), 卡替卡因(carticaine),辛可卡因(cinchocaine),依替卡因(etidocaine),左布比 卡因(levobupivacaine),利多卡因(lidocaine),甲脈卡因(mepivacaine),脈羅 卡因(piperocaine),丙胺卡因(prilocaine),羅脈卡因(ropivacaine),三甲卡因 (trimecaine),始鮮毒素(saxitoxin)和河膝毒素(tetrodotoxin)),和 cox-2-抑制 劑(即,塞來昔布(celecoxib),羅非昔布(rofecoxib)和伐地考昔(valdecoxib))。對 于伴有眩暈的神經(jīng)疾病,可以選擇作為抗眩暈劑的神經(jīng)藥物,其包括、但不限于,美克 洛嗪(meclizine),苯海拉明(diphenhydramine),異丙嗪(promethazine)和地西泮 (diazepam)。對于伴有惡心的神經(jīng)疾病,可以選擇作為抗惡心劑的神經(jīng)藥物,其包括、但不 限于,異丙嗪(promethazine),氯丙嗪(chlorpromazine),丙氯拉嗪(prochlorperazine), 曲美節(jié)胺(trimethobenzamide)和甲氧氯普胺(metoclopramide)。對于神經(jīng)變性疾病, 可以選擇是生長激素或神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)藥物;實例包括、但不限于腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子(BDNF),神經(jīng)生長因子(NGF),神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5,成纖維細胞生長因子(FGF)-2和 其它FGF,神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)-3,促紅細胞生成素(EP0),肝細胞生長因子(HGF),表皮生 長因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-a,TGF-爲(wèi),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),白介素-1 受體拮抗劑(IL-lra),睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF),神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF), neurturin,血小板源性生長因子(PDGF),調(diào)蛋白(heregulin),神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白,artemin, persephin,白介素,膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GFR),粒細胞集落刺激因子(CSF),粒細 胞-巨嗤細胞-CSF,導(dǎo)蛋白(netrin),心肌營養(yǎng)蛋白-1,刺猬分子(hedgehogs),白血病 抑制因子(LIF),中期因子,多效營養(yǎng)因子,骨形成蛋白(BMP),導(dǎo)蛋白,皂化蛋白,腦信號 蛋白和干細胞因子(SCF)。對于癌癥,可以選擇是化療劑的神經(jīng)藥物。化療劑的例子包括 焼基化試劑,如塞替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide) (CYTOXAN?); 焼基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan) 和哌泊舒凡(piposulfan) ; B丫丙陡類(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡 波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa);乙撐亞胺類 (ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、曲 他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基憐酉先胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯 硫代憐酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylomelamine); 聚乙酸類(acetogenins)(特別是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone)) ; A-9-四氫大麻酌?(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酷 (dronabinol)、MAR1NOL? ); 6 -拉帕醌(beta-lapachone);拉帕醇(lapachol); 秋水仙喊(colchicines);禪木酸(betulinic acid);喜樹喊(camptothecin) (包括合成的類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN⑧)、CPT-11 (伊立替康 (irinotecan) CAMP10SAR? )、乙酉先喜樹喊(acetylcamptothecin)、東莫菪亭 (scopolectin)和 9_ 氨基喜樹喊(9-aminocamptothecin));苔蘚抑素(bryostatin);海 綿多烯酮類化合物(callystatin) ;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新 (carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼 臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別 是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他?。╠olastatin);倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成 的類似物、KW-2189 和 CB1-TM1);艾植素(eleutherobin);水鬼蕉堿(pancratistatin); 匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海綿素(spongistatin);氮芥(nitrogen mustards)如苯 丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽憐酸胺(chlorophosphamide)、 雌莫司?。╡stramustine)、異環(huán)憐酸胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽 酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥 (novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司?。╬rednimustine)、曲憐胺 (trofosfamide)、尿啼陡氮芥(uracil mustard);亞硝基脈類(nitrosoureas)如卡莫 司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司?。╢otemustine)、洛莫司汀 (lomustine)、尼莫司?。╪imustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素如烯二炔類 (enediyne)抗生素(例如加利車霉素(calicheamicin),尤其是加利車霉素Y II和加 利車霉素 coil (參見例如 Agnew,Chem. Intl.Ed.Engl.,33 :183-186(1994));烯二炔蒽 環(huán)類抗生素(dynemicin),包括烯二炔蒽環(huán)類抗生素A;埃斯波霉素(esperamicin);以 及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團和相關(guān)色素蛋白烯二炔類抗生素生色團)、 阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮 絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycins)、放線菌素 C(cactinomycin)、carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、 放線菌素 D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、 6_ 重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diaz〇-5-〇x〇-L_norleucine)、ADR1AMYCIN? 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、 氰基嗎啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2_卩比咯啉-多柔比 星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脫氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比 星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬塞羅霉素 (marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)如絲裂霉素 C、麥考酌?酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、 紫菜霉素(porfiromycin)、卩票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比 星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他?。▃inostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗 代謝物如甲氨碟呤(methotrexate)和5-氟尿啼陡(5-fluorouracil) (5-FU);葉酸類似物 如二甲葉酸(denopterin)、甲氨碟呤、碟羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate); 口票呤類似物如氟達拉濱(fludarabine)、6_巰卩票呤(6-mercaptopurine)、硫咪卩票呤 (thiamiprine)、硫鳥卩票呤(thioguanine);啼陡類似物如安西他濱(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷 (cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxif luridine)、依諾他 濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素類,諸如卡魯睪酮(calusterone)、 丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼 (mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氨魯米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補償劑如亞 葉酸(frolinic acid);醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);輕醒磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ;5_ 氨基酮戊酸(aminolevulinic acid);恩尿啼陡(eniluracil);安 R丫陡 (amsacrine) ;bestrabucil ; t匕生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate) ;defofamine ; 秋水仙胺(demecolcine);地卩丫醌(diaziquone) ;elfornithine ;依利醋銨(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸嫁(gallium nitrate); 輕基脲(hydroxyurea);香燕多糖(lentinan);氯尼達明(lonidainine);美登木素生 物喊類(maytansinoids)如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocins);米托 胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidanmol);尼曲卩丫陡 (nitraerine);噴司他丁(pentostatin);異丙嗪(phenamet);批柔比星(pirarubicin); 洛索蒽醌(losoxantrone) ;2_ 乙基酉先餅(2-ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine); PSK? 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products (JHS 天然產(chǎn)品),Eugene,OR);雷佐生 (razoxane);利索新(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);錯螺胺(spirogermanium);細 交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2, 2',2' -三氯三乙胺 (2,2',2"-trichlorotriethylamine);單端抱霉烯族化合物(trichothecenes)(特 別是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine));烏 拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) (ELD1SINE?、F1LDES1N?):達卡巴嗪 (dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露酉享(mitobronitol);二溴衛(wèi) 矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara-C");塞替哌(thiotepa);紫杉焼類化合物(taxoid),例如TAXOL?紫 杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、不含 Cremophor 的 ABRAXANETM(ABRAXANETM Cremophor-free),紫杉醇的白蛋白改造的 納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和 TAXOTERE? 多西他塞(docetaxel) ( Rlidne-Poillenc Rorer,Antony,法國)); 苯丁 酸氮芥(chloranbucil);吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR?); 6_ 硫鳥 P票呤(6-thioguanine);巰卩票呤(mercaptopurine);甲氨碟呤;鉬類似物如順鉬 (cisplatin)和卡鉬(carboplatin);長春喊(vinblastine) (VELBAN?);鉬;依托泊 苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新堿 (vincristine) (ONCOVIN?);與沙利鉬(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長春 瑞濱(vinorelbino) (NAVELB丨NE?);諾安托(novantrone);依達曲沙(edatrexate); 道諾霉素(daunomycin);氨基碟呤(aminopterin);伊班膦酸鹽(ibandronate);拓?fù)洚?構(gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO);類視黃酸類 (retinoids)如視黃酸(retinoic acid);卡培他濱(capecitabine) (XELODA?);以上 任何一種的藥用鹽、酸或衍生物;以及以上各項中的兩個以上的組合,CHOP,即環(huán)磷酰胺、多 柔比星、長春新堿、和潑尼松龍(prednisolone)的組合療法的縮寫;以及F0LF0X,即與5-FU 和亞葉酸(leucovorin)組合的奧沙利鉬(oxaliplatin) (ELOXATINTM)的治療方案的縮寫。
[0115] 同樣包括在對化療劑的該定義中的是抗激素劑,其作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制 可促進癌生長的激素效果,并且通常為系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實例 包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM),包括,例如,他莫昔芬(tamoxifen) (包括NOLVADEX?他莫昔芬),EV1STA⑧雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬 (droloxifene),4_ 輕基他莫西芬,曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene,LY117018,奧那司 酮(onapristone),和FARESTON?托瑞米芬(toremifene));抗黃體酮;雌激素受體下 調(diào)劑(ERDs);起作用抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑,例如,促黃體生成激素釋放素(leutinizing hormone-releasing hormone) (LHRH)激動劑如 LUPRON? 和 EL1G.ARD? 醋酸亮 丙立德(leuprolide acetate),醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林 (buserelin acetate)和tripterelin;其它抗雄激素類,如氟他胺(flutamide)、尼魯米 特(nilutamide)和比卡魯胺(bicalutamide);和抑制芳香酶的芳香酶抑制劑,其調(diào)節(jié)腎上 腺中的雌激素生產(chǎn),諸如例如,4(5)-咪唑、氨魯米特(3111;[11(^11^61:11;[1111(16)、1\4£0八8巳? 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMAS1N?依西美坦(exemestane)、福美坦 (formestanie),法倔唑(fadrozole)、RIVISOR? 伏氯唑(vorozole)、FEMARA? 來曲唑(letrozole)和AR1M丨DEX?阿那曲唑(anastrozole)。此夕卜,對化療齊 的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)如氯膦酸鹽(clodronate)(例如, BONEFOS? 或 OSTAC? )、DIDROCAL? 依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、 ZOMETA?唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)、FOSAMAX? 阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA? 帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID? 替 魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL?利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱 (troxacitabine) (1,3_二氧戊環(huán)核苷胞啼陡類似物);反義寡核苷酸,特別是抑制在涉 及異常細胞增殖的信號傳導(dǎo)途徑中基因的表達的那些,諸如例如,PKC-a、Raf、H-Ras 和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗諸如THERATOPE?疫苗和基因治療疫苗、例如, ALLOVECT1N?疫 m、LEUVECT1N?疫 m和 VAX1D?疫苗;LURTOTECAN?拓 撲異構(gòu)酶 1 抑制劑;ABARELIX?:rmRH;托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate) (ErbB-2 和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑,也已知為GW572016);和以上任何一種的藥用鹽、酸 或衍生物。
[0116] 可以被選作用于癌癥治療或預(yù)防的神經(jīng)藥物的另一組化合物是抗癌癥免疫球蛋 白(包括、但不限于,曲妥珠單抗(trastuzumab),貝伐珠單抗(bevacizumab),阿侖單抗 (alemtuxumab),西妥昔單抗(cetuximab),吉妥珠單抗(gemtuzumab ozogamicin),替尼莫 單抗(ibritumomab tiuxetan),帕尼單抗(panitumumab)和利妥昔單抗(rituximab))。在 一些情況中,與有毒的標(biāo)記結(jié)合的抗體可以用于靶向并殺死目的細胞(即,癌癥細胞),所 述抗體包括、但不限于,具有放射性標(biāo)記的托西莫單抗(tositumomab)。
[0117] 對于眼疾病或病癥,可以選擇是以下各項的神經(jīng)藥物:抗新生血管眼科試劑 (即,貝伐珠單抗(bevacizumab),蘭尼單抗(ranibizumab)和培加尼布(pegaptanib)), 眼科青光眼藥(即,卡巴膽堿(carbachol),腎上腺素(epinephrine),地美溴銨 (demecarium bromide),阿可樂定(apraclonidine),溴莫尼定(brimonidine),布林 唑胺(brinzolamide),左布諾洛爾(levobunolol),噻嗎洛爾(timolol),倍他洛爾 (betaxolol),多佐胺(dorzolamide),比馬前列素(bimatoprost),卡替洛爾(carteolol), 美替洛爾(metipranolol),地匹福林(dipivefrin),曲伏前列素(travoprost)和拉 坦前列素(latanoprost)),碳酸酐酶抑制劑(即,醋甲唑胺(methazolamide)和乙酰 唑胺(acetazolamide)),眼科抗組胺劑(S卩,萘甲唑啉(naphazoline),去氧腎上腺素 (phenylephrine)和四氫唑啉(tetrahydrozoline)),眼用潤滑劑,眼科甾類化合物(即, 氟米龍(fluorometholone),潑尼松龍(prednisolone),氯替潑諾(loteprednol),地塞 米松(dexamethasone),二氟潑尼酯(difluprednate),利美索龍(rimexolone),醋酸 氟輕松(fluocinolone),甲輕松(medrysone)和去炎松(triamcinolone)),眼科麻醉 劑(即,利多卡因(lidocaine),丙美卡因(proparacaine)和 丁卡因(tetracaine)), 眼科抗感染劑(即,左氧氟沙星(levofloxacin),加替沙星(gatifloxacin),環(huán)丙沙星 (ciprofloxacin),莫西沙星(moxifloxacin),氯霉素(chloramphenicol),桿菌膚 / 多粘 菌素 b (bacitracin/polymyxin b),橫胺醋酸(sulfacetamide),妥布霉素(tobramycin), 阿奇霉素(azithromycin),貝西沙星(besifloxacin),諾氟沙星(norfloxacin),橫 胺異 惡唑(sulfisoxazole),慶大霉素(gentamicin),碘苷(idoxuridine),紅霉素 (erythromycin),那他霉素(natamycin),短桿菌肽(gramicidin),新霉素(neomycin), 氧氟沙星(of loxacin),曲氟尿苷(trifluridine),更昔洛韋(ganciclovir),阿糖腺 苷(vidarabine)),眼科抗炎劑(S卩,奈帕芬胺(nepafenac),酮咯酸(ketorolac), 氟比洛芬(flurbiprofen),舒洛芬(suprofen),環(huán)孢菌素(cyclosporine),去炎松 (triamcinolone),雙氯芬酸(diclofenac)和溴芬酸(bromfenac)),和眼科抗組胺劑或 解充血藥(即,酮替芬(ketotifen),奧洛他定(olopatadine),依匹斯?。╡pinastine), 萘甲唑啉(naphazoline),色甘酸鈉(cromolyn),四氫唑啉(tetrahydrozoline),卩比啼 司特(pemirolast),貝他斯汀(bepotastine),萘甲唑啉(naphazoline),去氧腎上腺 素(phenylephrine),奈多羅米(nedocromil),洛度沙胺(lodoxamide),去氧腎上腺素 (phenylephrine),依美斯汀(emedastine)和氮卓斯?。╝zelastine))。對于發(fā)作疾病,可 以選擇是抗驚厥藥或抗癲癇藥的神經(jīng)藥物,其包括、但不限于,巴比妥酸鹽(barbiturate) 抗驚厥藥(即,撲米酮(primidone),美沙比妥(metharbital),甲苯比妥(mephobarbital), 阿洛巴比妥(allobarbital),異戊巴比妥(amobarbital),阿普比妥(aprobarbital), 苯烯比妥(alphenal),巴比妥(barbital),溴烯比妥(brallobarbital)和苯巴比妥 (phenobarbital)),苯并二氮卓類(benzodiazepine)抗驚厥藥(即,地西泮(diazepam), 氯硝西泮(clonazepam)和勞拉西泮(lorazepam)),氨基甲酸酯(carbamate)抗驚厥藥 (即非爾氨酯(felbamate)),碳酸酐酶(carbonic anhydrase)抑制劑抗驚厥藥(即,乙 酰唑胺(acetazolamide),托卩比酯(topiramate)和唑尼沙胺(zonisamide)),二苯并氮 卓(dibenzazepine)抗驚厥藥(即,盧非酸胺(rufinamide),卡馬西平(carbamazepine) 和奧卡西平(oxcarbazepine)),脂肪酸衍生物抗驚厥藥(即,雙丙戊酸鈉(divalproex) 和丙戊酸(valproic acid)),y-氨基丁酸類似物(即,普瑞巴林(pregabalin),加巴 噴?。╣abapentin)和氨己烯酸(vigabatrin)),Y-氨基丁酸再攝取抑制劑(即,噻加 賓(tiagabine)),Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑(即,氨己烯酸(vigabatrin),乙內(nèi)酰脲 抗驚厥藥(即苯妥英(phenytoin),乙苯妥英(ethotoin),磷苯妥英(fosphenytoin)和 美芬妥英(mephenytoin)),雜類抗驚厥藥(即,拉科酰胺(lacosamide)和硫酸鎂),孕 酮類(S卩,黃體酮(progesterone)),P惡唑焼二酮(oxazolidinedione)抗驚厥藥(即, 甲乙雙酮(paramethadione)和三甲雙酮(trimethadione)),卩比咯焼抗驚厥藥(SP,左乙 拉西坦(levetiracetam)),琥拍酰亞胺抗驚厥藥(即,乙琥胺(ethosuximide)和甲琥按 (methsuximide)),三嗪抗驚厥藥(即,拉莫三嗪(lamotrigine)),和尿素抗驚厥藥(即,苯 乙酰脲(phenacemide)和苯丁酰脲(pheneturide))。
[0118] 對于溶酶體貯積病,可以選擇這樣的神經(jīng)藥物,其自身或以其它方式模擬在疾病 中受損的酶的活性。用于治療溶酶體貯積病的示例性重組酶包括、但不限于在例如美國專 利申請
【發(fā)明者】貝恩德·博爾曼, 佩爾-奧拉·弗雷斯克加德, 彼得·邁爾, 延斯·尼韋納, 阿蘭·蒂索-達蓋特, 愛德華·烏里希 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司
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