用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的融合蛋白及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其在將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的用途。具體而言，本發(fā)明含有細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白和哺乳動(dòng)物YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段的融合蛋白、其編碼核苷酸序列、表達(dá)載體及組合物。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的融合蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
【專利說明】用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的融合蛋白及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的人工轉(zhuǎn)錄因子及其在體細(xì)胞重編程中的用途，本發(fā)明還涉及將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胚胎干細(xì)胞是來源于受精卵發(fā)育早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或著床后胚原始生殖細(xì)胞的一類未分化的全能性細(xì)胞，具有無限增殖和全向分化能力，可分化成人體幾乎所有組織類型的細(xì)胞。因此其在動(dòng)物克隆、發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究，尤其是人類再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用等方面具有十分誘人的廣闊前景。但是將胚胎干細(xì)胞真正應(yīng)用到臨床上人面臨著眾多障礙，特別是人類胚胎干細(xì)胞尤其是病人特異的干細(xì)胞的來源及相關(guān)的倫理問題成為了困擾科學(xué)界的一大難題。因此，能夠使用來源豐富的體細(xì)胞，通過重編程的方法，使終末分化的細(xì)胞重新獲得類似于胚胎干細(xì)胞的多能性細(xì)胞成為了眾多研究者的追求和奮斗目標(biāo)。
[0003]到目前為止，主要有三項(xiàng)技術(shù)能夠使體細(xì)胞發(fā)生重編程進(jìn)而獲得干細(xì)胞:核移植重編程技術(shù)(SCNT)、細(xì)胞融合重編程技術(shù)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程技術(shù)(iPS)。1952年，核移植首先在兩棲類中獲得成功(Briggs and King, 1952)，至1997年克隆羊Dolly的誕生(Wilmut et al.，1997)，體細(xì)胞克隆技術(shù)迅速發(fā)展并逐漸成熟。到目前為止，體細(xì)胞克隆已在大鼠、豬、牛、猴、狗等二十余種物種上取得了成功。通過核移植技術(shù)而產(chǎn)生的干細(xì)胞能夠避免細(xì)胞移植治療后的免疫排斥不良反應(yīng)。
[0004]但是該技術(shù)距離真正的臨床應(yīng)用也還是有很多問題存在的，首先核移植效率極低；其次，實(shí)驗(yàn)證明體細(xì)胞克隆動(dòng)物經(jīng)常存在發(fā)育異常的現(xiàn)象；以及最終運(yùn)用到人類疾病治療上所涉及到的人類卵子來源和人類胚胎使用的倫理爭議等一系列問題都成為了該技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題。同樣，細(xì)胞融合重編程技術(shù)也面臨著重編程效率極低、技術(shù)要求過高等眾多問題制約著其臨床應(yīng)用。以上兩種常規(guī)的重編程方法都存在著缺陷，因此各國的科學(xué)家都在探索其他的更為可行的重編程策略。2006年日本科學(xué)家Yamanaka研究組在研究中發(fā)現(xiàn)將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc通過病毒感染的方式轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細(xì)胞后就可以使成纖維細(xì)胞獲得具有類似于ES細(xì)胞的多能性(Takahashi andYamanaka, 2006)。隨后研究表明這種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stemcells, iPS細(xì)胞)與胚胎干細(xì)胞十分相似，并且能夠在注射至囊胚后形成嵌合鼠，尤其是2009年通過四倍體補(bǔ)償技術(shù)生成的小鼠的出生證明了這種細(xì)胞的多能性。2007年11月Yamanaka和Thomso n實(shí)驗(yàn)室分別宣布他們使用人類皮膚細(xì)胞成功地誘導(dǎo)出了人類iPS細(xì)胞(Takahashi et al., 2007; Yu et al.，2007)。同年 Jaenisch 研究組使用 iPS 技術(shù)在鍵刀型細(xì)胞貧血癥模型小鼠上進(jìn)行基因治療研究獲得了初步成功。簡而言之，該技術(shù)通過導(dǎo)入幾個(gè)簡單的轉(zhuǎn)錄因子就意想不到的可以使已分化的體細(xì)胞發(fā)生重編程并恢復(fù)多能性。這一簡單可行的技術(shù)突破可以很方便的獲取病人自身體細(xì)胞來源的多能性干細(xì)胞，不但輕易地解決了再生治療的細(xì)胞來源問題，而且能夠避免自身免疫排斥、規(guī)避了倫理道德的制約，為再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0005]但是，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的技術(shù)作為一項(xiàng)新生技術(shù)許多方面還并未完善。比如，其機(jī)理尚未研究透徹、潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，誘導(dǎo)效率低下、誘導(dǎo)耗時(shí)過長等。如果這些問題不能有效地解決，就不能使該技術(shù)成功的應(yīng)用到臨床上。因此科研界投入了巨大的精力去解決這些問題，到目前為止也取得了相當(dāng)多的進(jìn)展。
[0006]首先，世界范圍內(nèi)的科學(xué)家從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)的各個(gè)方面對iPS誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了充分的研究。例如在，科學(xué)家在單細(xì)胞水平、染色質(zhì)修飾酶(chromatinmodification enzyme)和 3D 染色質(zhì)調(diào)控(3D chromatin regulation)方面的文章使我們在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平、表觀遺傳學(xué)水平、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等層面對重編程的機(jī)制有了深入的認(rèn)識。尤其是北大鄧宏魁的“蹺蹺板模型(seesaw model)”使我們對iPS機(jī)制認(rèn)識更為全面。
[0007]其次，在iPS的安全性方面也進(jìn)行了眾多方面的改進(jìn)工作。首先c-Myc從四因子中去除使致瘤性風(fēng)險(xiǎn)大為降低。再者更為安全的誘導(dǎo)手段，如非病毒整合載體的應(yīng)用，mRNA、蛋白誘導(dǎo)方式，鄧宏魁的小分子化合物的誘導(dǎo)方式使iPS在安全性方面得到了巨大的提聞。
[0008]第三，常規(guī)的iPS誘導(dǎo)效率只有0.01%-2%左右，因此科學(xué)家采用各種方法去提高誘導(dǎo)效率。如添加小分子化合物如VPA、VC可以將誘導(dǎo)效率提升約100倍，優(yōu)化誘導(dǎo)因子組合，如mRNA誘導(dǎo)可以提升效率到5%左右。多能因子融合VP16或者M(jìn)yoD的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以大幅度的提升iPS誘導(dǎo)效率。[0009]第四，一般來講，小鼠細(xì)胞iPS誘導(dǎo)用時(shí)為兩周左右，人的iPS細(xì)胞用時(shí)更長。因此能夠在最短的時(shí)間獲得iPS對最終的臨床應(yīng)用也是很重要的一個(gè)因素，但目前來說誘導(dǎo)時(shí)間一般都在兩周時(shí)間左右。
[0010]申請?zhí)枮閃02011110051的專利申請通過將0CT4，S0X2, NANOG分別融合皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。將這三種人工轉(zhuǎn)錄因子和Klf4 一起感染MEF細(xì)胞，可以大幅度的提高重編程效率。但是該技術(shù)誘導(dǎo)的速度和效率仍未達(dá)到最理想狀態(tài)。比如其內(nèi)源多能基因如0ct4等的表達(dá)不夠迅速。
[0011]Hirai等人將0CT4與MyoD轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合,然后將融合了 MyoD的0ct4的人工因子(M30)和原始形態(tài)的S0X2，c-Myc, Klf4三種轉(zhuǎn)錄因子一起感染MEF細(xì)胞，可以大幅度的提高重編程效率。GFP陽性克隆計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，該誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法在dayl5可達(dá)到GFP陽性克隆的最高值，誘導(dǎo)效率可以達(dá)到約25%，但只比傳統(tǒng)的0ct4，S0X2, c-Myc,Klf4誘導(dǎo)方法高10倍左右。同時(shí)該方法仍然使用了原癌基因c-Myc，沒有消除安全隱患。相比較而言，本發(fā)明安全性較高，效率更高，時(shí)間上更為迅速。在未來再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用上本方法顯然更有優(yōu)勢。
[0012]iPS研究在過去的數(shù)年間取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，使我們?nèi)找婵吹搅似渥罱K走向臨床應(yīng)用的輝煌前景。但是總體說來，該技術(shù)當(dāng)前還存在誘導(dǎo)效率低，用時(shí)較長，安全性還有待提高等問題，阻礙了快速高效地獲得高質(zhì)量的臨床應(yīng)用級別iPS細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的常用的各種誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS的方法均誘導(dǎo)效率低下(0.01%-2%)、用時(shí)較長(10天至兩周左右時(shí)間)的缺點(diǎn)。提供一種快速、高效、安全地誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細(xì)胞的方法，并且該方法為iPS的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
[0014]一方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段，以及與所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段直接連接或通過連接序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段。
[0015]優(yōu)選地，所述連接序列為GGGGS。
[0016]優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段通過氨基端或羧基端與轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段連接；
[0017]優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自0CT4、S0X2、NANOG, SOXl、S0X3、S0X15、S0X18、STAT3、SMADU Sal4、Nr5a2、Daxl, Esrrb, UtfU MyoD, CEBPa、Pax5, PdxU Ngn3、MafA、Ascll、Brn2、Mytll、Gata4、Mef2c和Tbx5中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自 0CT4、S0X2、NANOG、MyoD、CEBP a、Pax5、Pdx1、Ngn3、MafA、Asc11、Brn2、Gata4、Mef2c和Tbx5中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自0CT4、S0X2和NANOG中的一種或多種，例如一種、兩種或三種。
[0018]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域?yàn)椴溉閯?dòng)物YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptional activity domain TAD)或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段。更優(yōu)選地,所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域選自小鼠、豬、羊、?；蛉说腨AP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域選自小鼠的YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段，優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0019]優(yōu)選地，所述融合蛋白選自以下的一種或多種:0CT4蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白，即0CT4-YAPtad(以下稱為0y)、S0X2蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白，即S0X2-YAPtad(以下稱為Sy)、NANOG蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白，即NANOG-YAPtad(以下稱為Ny)、MyoD蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋`白、CEBPa蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Pax5蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Pdxl蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Ngn3蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、MafA蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、AsclI蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Brn2蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Gata4蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白Mef2c蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白、Tbx5蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白。
[0020]優(yōu)選地，本申請的融合蛋白選自序列SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:38-48所示的氨基酸序列中的一種或多種。
[0021]另一方面，本發(fā)明提供了編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。
[0022]優(yōu)選地，所述核苷酸序列選自如SEQ ID NO:USEQ ID N0:3、SEQ ID NO:5和SEQID NO:49-59所不的核苷酸序列中的一種或多種。
[0023]優(yōu)選地,編碼所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0024]再一方面，本發(fā)明提供了表達(dá)上述融合蛋白的載體。優(yōu)選地，所述載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T細(xì)胞。[0025]本發(fā)明還提供了一種組合物，所述組合物含有上述融合蛋白、核苷酸序列和/或表達(dá)載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包括運(yùn)載體和賦形劑。
[0026]優(yōu)選地，所述組合物含有至少一種選自下組的融合蛋白:0CT4-YAPtad (Oy)、S0X2-YAPtad (Sy)、NANOG-YAPtad (Ny)。
[0027]優(yōu)選地，所述組合物還包括Klf4蛋白、編碼Klf4蛋白的核苷酸和/或表達(dá)載體。
[0028]優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的表達(dá)載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0029]優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0030]優(yōu)選地，所述編碼Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。 [0031]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請的組合物包括如SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
[0032]使用本發(fā)明的0CT4-YAPtad、S0X2_YAPtad、NANOG-YAPtad 并加上 KLF4 因子(以下稱為OySyNyK-1PS方法)比常規(guī)的0CT4、S0X2、NAN0G，、KLF4因子組合(以下稱為OSNK-1PS方法)能更加快速高效的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生。
[0033]本發(fā)明還提供了一種將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟:
[0034]I)用本發(fā)明所述的融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體或組合物處理體細(xì)胞，
[0035]2)經(jīng)過培養(yǎng)后，篩選出具有多能干細(xì)胞理化特征的細(xì)胞，從而獲得多能干細(xì)胞。
[0036]優(yōu)選地,所述體細(xì)胞為人或者其他物種的任何成體細(xì)胞。優(yōu)選地,所述體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的成體細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人或鼠。優(yōu)選地，所述成體細(xì)胞為:皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞和/或口腔上皮細(xì)胞。
[0037]優(yōu)選地，所述處理體細(xì)胞的方法包括通過病毒感染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或mRNA轉(zhuǎn)染將所述融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體和/或組合物導(dǎo)入體細(xì)胞中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0038]優(yōu)選地，所述病毒感染中，使用病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)大于等于10的逆轉(zhuǎn)錄病毒量去感染細(xì)胞。更優(yōu)選地，使用病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)等于10的逆轉(zhuǎn)錄病毒量去感染細(xì)胞。
[0039]在一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法的步驟I)包括以下步驟:
[0040]I)構(gòu)建含有本發(fā)明所述的細(xì)胞全能性相關(guān)的基因和所述哺乳動(dòng)物YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptional activity domain TAD)或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段的核苷酸序列的質(zhì)粒載體；優(yōu)選地，還構(gòu)建含有Klf4的核苷酸序列的質(zhì)粒載體；優(yōu)選地，所述核苷酸序列包括全長序列的0CT4，S0X2, NANOG,所述YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?yàn)樾∈骙AP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptional activity domain TAD);優(yōu)選地,所述質(zhì)粒為逆轉(zhuǎn)錄病毒PMXs載體；優(yōu)選地，所述pMXs載體的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0041]2)將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)之后，收集病毒上清液，過濾后，將病毒混合，加入聚凝胺(polybrene)，感染成體細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞重編程；
[0042]優(yōu)選地，所述過濾使用0.45 μ m PVDF濾器。
[0043]優(yōu)選地，所述病毒以1:1:1:1的比例混合。[0044]優(yōu)選地，所述加入聚凝胺后的終濃度為8μ g/μ I。
[0045]在本申請的一個(gè)具體實(shí)施例中，使用的體細(xì)胞為0G2-MEF，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將病毒液從0G2-MEF細(xì)胞移去當(dāng)做O小時(shí)算起，最快可在20小時(shí)看到0ct4_GFP的表達(dá)，提示此時(shí)內(nèi)源0ct4基因已經(jīng)起始表達(dá)，，重編程已經(jīng)快速啟動(dòng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖速度并沒有發(fā)生有差異的改變，RT-PCR的結(jié)果顯示p53的表達(dá)水平亦未有大幅度的變化。約在第四天就可以看到iPS克隆開始出現(xiàn)，約在第6-7天就可以挑去形態(tài)較好的單克隆進(jìn)行建系培養(yǎng)。
[0046]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明的融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體和/或組合物。
[0047]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體和/或組合物在制備用于將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)干細(xì)胞的試劑中的用途。
[0048]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體和/或組合物在再生醫(yī)學(xué)研究和臨床治療領(lǐng)域的用途。
[0049]本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)的0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc (下文中簡稱為0SMK)相比，由于去除了 c-Myc的使用，安全性得到了提高。和常規(guī)的0ct4、Sox2、Nanog、Klf4(下文中簡稱為0SNK)誘導(dǎo)方法相比，其誘導(dǎo)速度極大的加快，誘導(dǎo)效率得到了極大的提高。GFP熒光克隆計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在第7天，OSNK基本上沒有克隆形成，而利用0CT4-YAPTAD (Oy)，S0X2-YAPTAD(Sy)，NANOG-YAPTAD(Ny)和Klf4(即本申請的OySyNyK法)融合蛋白組合進(jìn)行iPS誘導(dǎo)，可約形成2500個(gè)熒光克隆。 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示在第7天約有40%的細(xì)胞是0ct4-GFP陽性表達(dá)的細(xì)胞。
[0050]對iPS誘導(dǎo)過程中不同時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析的結(jié)果也顯示，內(nèi)源多能相關(guān)基因，如0ct4、Sox2、Nanog、Daxl> Eras等，OySyNyK方法相對于常規(guī)OSNK誘導(dǎo)能夠快速高水平的進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用亞硫酸鹽對0ct4、Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行胞嘧啶甲基化狀態(tài)的分析也顯示相對于常規(guī)OSNK誘導(dǎo)方法，OySyNyK方法能夠在短至1_2天的時(shí)間內(nèi)使0ct4、Nanog的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生快速的去甲基化，使其從表達(dá)抑制狀態(tài)進(jìn)入到高水平的活性表達(dá)狀態(tài)。建系傳代后的iPS細(xì)胞系和0ct4、Sox2、Nanog、Klf4常規(guī)方法誘導(dǎo)建系成功的iPS細(xì)胞系一樣，多能相關(guān)基因高表達(dá)，外源基因沉默，AP染色呈陽性，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生EB，并且囊胚注射后可以生成嵌合鼠，并且可以進(jìn)行種系傳遞，證明了其雖然是快速誘導(dǎo)成功的，但是一樣具有良好的全能性。
[0051]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在兩個(gè)方面:相比較于常規(guī)低效耗時(shí)的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，本發(fā)明能在6-7天內(nèi)以極高的效率形成高質(zhì)量的iPS克隆。后續(xù)鑒定表明該方法產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在基因表達(dá)、增殖速度和發(fā)育多潛能性等各方面指標(biāo)都和胚胎干細(xì)胞極為相似，并能成功的進(jìn)行種系傳遞。因此，可以預(yù)期，本方法應(yīng)用于人類再生醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐當(dāng)中，能夠快速高效的誘導(dǎo)患者特異的自體多能干細(xì)胞，可以極大地節(jié)省治療時(shí)間和提高治療成功率，為實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)在臨床上的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。本發(fā)明能夠高效快速的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，可以為iPS機(jī)理的研究提供巨大的便利，可以發(fā)掘出原來被低iPS誘導(dǎo)效率掩蓋的有用信息。
[0052]本發(fā)明主要應(yīng)用于以成體細(xì)胞誘導(dǎo)生成多能干細(xì)胞，并用于再生醫(yī)學(xué)研究和臨床治療等領(lǐng)域。[0053]相比較于常規(guī)低效耗時(shí)的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，本發(fā)明能在6-7天內(nèi)以極高的效率形成高質(zhì)量的iPS克隆。后續(xù)鑒定表明該方法產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在基因表達(dá)、增殖速度和發(fā)育多潛能性等各方面指標(biāo)都和胚胎干細(xì)胞極為相似，并能成功的進(jìn)行種系傳遞。因此，可以預(yù)期，本方法應(yīng)用于人類再生醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐當(dāng)中，能夠快速高效的誘導(dǎo)患者特異的自體多能干細(xì)胞，可以極大地節(jié)省治療時(shí)間和提高治療成功率，為實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)在臨床上的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0054]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0055]圖1 為本申請的 0ct4-YAPTAD、S0X2_YAPtad、NANOG-YAPtad 載體構(gòu)建示意圖；
[0056]圖2為本申請的OySyNyK法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成時(shí)間示意圖；
[0057]圖3為使用GFP陽性克隆計(jì)數(shù)的結(jié)果，OySyNyK方法誘導(dǎo)iPS效率和OSNK方法誘導(dǎo)iPS效率的對比。其中，OSNK方法在第12天進(jìn)行計(jì)數(shù)，而OySyNyk方法在第7天進(jìn)行iPS的計(jì)數(shù)；
[0058]圖4為使用流式細(xì)胞儀分析GFP陽性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，OySyNyK誘導(dǎo)方法比OSNK誘導(dǎo)方法迅速且高效；
[0059]圖5為GFP熒光照片，用于比較傳統(tǒng)OSNK方法iPS誘導(dǎo)和本發(fā)明OySyNyK方法iPS誘導(dǎo)不同的速度和效率；
[0060]圖6為堿性磷酸酶染色(NAP)結(jié)果，該結(jié)果顯示在第7天，OySyNyK方法iPS誘導(dǎo)效率極高，而OSNK方法誘導(dǎo)產(chǎn)生極少的iPS克?。?br> [0061]圖7為OySyNyK方法誘導(dǎo)形成的克隆,建系傳代后形態(tài)和mES形態(tài)相似,且能夠長期傳代維持較好的狀態(tài)。A圖為建系后第1次傳代iPS克隆形態(tài)。B圖為建系后傳代10次以后iPS克隆形態(tài)。
[0062]圖8為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)鑒定，如圖所示，OySyNyK方法比OSNK方法能夠更迅速和更強(qiáng)的誘導(dǎo)內(nèi)源多能因子0CT4、S0X2、NANOG的表達(dá)；
[0063]圖9為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)鑒定，如圖所示，OySyNyK方法比OSNK方法能夠更迅速和更強(qiáng)的誘導(dǎo)內(nèi)源多能因子EraS、Daxl的表達(dá)；
[0064]圖10為使用本發(fā)明的OySyNyK方法誘導(dǎo)成功的iPSc，進(jìn)行建系傳代。如圖所示六種建系的細(xì)胞系，外源表達(dá)的誘導(dǎo)因子都沉默了 ；
[0065]圖11為使用本發(fā)明的OySyNyK方法進(jìn)行iPS誘導(dǎo)，其中，采用亞硫酸鹽測序的方法可以檢測到0ct4、Nanog細(xì)胞因子的啟動(dòng)子區(qū)域在第3天從表觀遺傳學(xué)抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)換成活性表達(dá)狀態(tài)；圖A為MEF樣品，圖B為OySyNyK方法誘導(dǎo)iPS第3天樣品FACS篩選GFP陽性細(xì)胞。圖C為OySyNyK方法誘導(dǎo)iPS第5天樣品FACS篩選GFP陽性細(xì)胞.圖D為OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS建系細(xì)胞樣品。圖F為mES陽性對照樣品。
[0066]圖12使用本發(fā)明的OySyNyK-1PSc注射到免疫缺陷小鼠上可以產(chǎn)生畸胎瘤，HE染色顯示三個(gè)胚層的結(jié)構(gòu)；
[0067]圖13使用本發(fā)明的OySyNyK-1PSc囊胚注射可以產(chǎn)生嵌合體小鼠(圖A)，并產(chǎn)生種系傳遞的小鼠(圖B)。
[0068]其中，本申請用到氨基酸序列和核苷酸序列如下所示:[0069]圖14為SEQ ID NO:1編碼0CT4和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0070]圖15為SEQ ID NO:20CT4和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0071]圖16為SEQ ID NO:3編碼S0X2和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0072]圖17為SEQ ID NO:4S0X2和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0073]圖18為SEQ ID NO:5編碼NANOG和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0074]圖19為SEQ ID NO:6NAN0G和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0075]圖20為SEQ ID NO:7編碼KLF4的核苷酸序列
[0076]圖21 為 SEQ ID NO:8KLF4 蛋白序列
[0077]圖22為SEQ ID NO:9編碼YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列
[0078]圖23為SEQ ID NO: 10YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域序列
[0079]圖24為SEQ ID NO:1 IpMXs載體核苷酸序列
[0080]圖25為SEQ ID NO:38M yoD和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0081]圖26為SEQ ID NO:39CEBP α和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0082]圖27為SEQ ID NO:40Pax5和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0083]圖28為SEQ ID NO:41Pdxl和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0084]圖29為SEQ ID NO:42Ngn3和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0085]圖30為SEQ ID NO:43MafA和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0086]圖31為SEQ ID NO:44Ascll和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0087]圖32為SEQ ID NO:45Brn2和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0088]圖33為SEQ ID NO:46Gata4和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0089]圖34為SEQ ID NO:47Mef2c和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列
[0090]圖35為SEQ ID NO:48Tbx5和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白序列[0091 ] 圖36為SEQ ID NO:49編碼MyoD和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0092]圖37為SEQ ID NO:50編碼CEBP α和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0093]圖38為SEQ ID NO:51編碼Pax5和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0094]圖39為SEQ ID NO:52編碼Pdxl和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0095]圖40為SEQ ID NO:53編碼Ngn3和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0096]圖41為SEQ ID NO:54編碼MafA和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0097]圖42為SEQ ID NO:55編碼Ascll和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列[0098]圖43為SEQ ID NO:56編碼Brn2和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0099]圖44為SEQ ID NO:57編碼Gata4和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0100]圖45為SEQ ID NO:58編碼Mef2c和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
[0101]圖46為SEQ ID NO:59編碼Tbx5和YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的核苷酸序列
【具體實(shí)施方式】
[0102]以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。
[0103]除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商購獲得。
[0104] 實(shí)施例1使用OySyNyK方法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
[0105]1.1豐要試劑與材料
[0106]HEK293T培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和終濃度100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素
[0107]MEF培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、0.055πιΜβ巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM的非必須氨基酸和終濃度100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素。
[0108]iPSC培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清，0.055πιΜβ巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM的非必須氨基酸，和終濃度100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，50 μ g/ml 維生素 C (Sigma), 1000U/ml LIF。
[0109]1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0110]使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中pMXs逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(購自addgene)質(zhì)粒，分別是 0ct4_YapTAD (Oy), Sox2_YapTAD (Sy), Nanog-YapTAD (Ny), Klf4 (K)和包裝質(zhì)粒，各11微克以磷酸鈣沉淀方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收取病毒上清液，并用0.45微米的PVDF過濾器過濾。0CT4-GFP MEF (從懷孕13.5天的0CT4-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(購自Jackson Laboratory)制備的原代胚胎成纖維細(xì)胞)以5 X IO4的密度提前16小時(shí)接種在十二孔板中。四種病毒以1:1:1:1的比例混合，并加入終濃度8 μ g/ml的聚凝胺，以2ml每孔的病毒量進(jìn)行感染.感染24小時(shí)后更換iPS培養(yǎng)基，此時(shí)定義為Ohr。大約24±6hr后能看到單個(gè)細(xì)胞0CT4-GFP開始表達(dá)，0CT4-GFP陽性iPSC克隆在day3開始出現(xiàn)。iPSC在第六或者第七天進(jìn)行計(jì)數(shù)或者挑取單克隆進(jìn)行傳代。
[0111]實(shí)施例2使用OSNK法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
[0112]HEK293T培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和終濃度100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素
[0113]MEF培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清，0.055πιΜβ巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM的非必須氨基酸，和終濃度100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。[0114]iPSC培養(yǎng)基配方:高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、0.055πιΜβ巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM的非必須氨基酸和終濃度100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、50 μ g/ml 維生素 C (Sigma)、1000U/ml LIF。
[0115]逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝:pMXs逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(購自addgene)質(zhì)粒，分別是0ct4(0)、Sox2 (S) ,Nanog(N)、Klf4 (K)和Ecopac包裝質(zhì)粒各11微克以磷酸鈣沉淀方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收取病毒上清液，并用0.45微米的PVDF過濾器過濾。0CT4-GFPMEF以5X 104的密度提前16小時(shí)接種在十二孔板中。四種病毒以1:1:1:1的比例混合，并加入終濃度8U g/ml的聚凝胺，以2ml每孔的病毒量進(jìn)行感染。感染24小時(shí)后更換iPS培養(yǎng)基，此時(shí)定義為Ohr。大約在第4天能看到0CT4-GFP開始表達(dá)，0CT4-GFP陽性iPSC克隆在第7天開始出現(xiàn)，iPS克隆在第12到14天進(jìn)行計(jì)數(shù)或者挑取單克隆進(jìn)行傳代。
[0116]實(shí)施例30ySyNyK法和OSNK法的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和GFP表達(dá)鑒定
[0117]0CT4-GFP為0ct4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的GFP報(bào)告質(zhì)粒整合到轉(zhuǎn)基因小鼠基因組上，其可以用來指示內(nèi)源0ct4基因表達(dá)，是iPS多能性的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。
[0118]由圖5所示，常規(guī)的OSNK誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的方法效率低、耗時(shí)長。其在第五天左右才開始有0CT4-GFP少量細(xì)胞表達(dá)，第七天還未見明顯的iPS克隆出現(xiàn)。而本發(fā)明方法在第一天就有0CT4-GFP表達(dá)，在第三天就開始有iPS克隆開始初步形成，到第七天已經(jīng)形成大量的狀態(tài)良好iPS克隆。本方法形成的iPS克隆經(jīng)過建系傳代以后形態(tài)上和傳統(tǒng)OSNK方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS克隆無明顯差別。
[0119]實(shí)施例40ySyNyK法和OSNK法的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色鑒定
[0120]堿性磷酸酶染色采用Millipore公司的試劑盒,具體步驟如下。
`[0121]吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS潤洗I次，用PFA固定I~2min。吸出固定液，用TBST潤洗一次；12孔板每孔加入堿性磷酸酶試劑1ml，室溫避光放置10~15min后，吸出染色液，用PBS緩沖液潤洗一次，最后保存于PBS溶液中。
[0122]由圖6所見，在第七天OSNK方法誘導(dǎo)的iPS未見明顯的染色出現(xiàn)，本發(fā)明所誘導(dǎo)的iPS可見大量的堿性磷酸酶染色呈陽性的克隆。
[0123]實(shí)施例50ySyNyK法誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS多有典型的多能干細(xì)胞生長特性
[0124]由圖7可見，OySyNyK法誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS克隆經(jīng)建系傳代培養(yǎng)后，可以很好的維持類似胚胎干細(xì)胞樣的克隆形態(tài)，經(jīng)過長期(連續(xù)10代)培養(yǎng)后仍然可以很好地維持典型的克隆形態(tài)。
[0125]實(shí)施例60ySyNyK法和OSNK法的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)鑒定
[0126]在OSNK方法和OySyNyK方法誘導(dǎo)iPS的過程中，在指定的天數(shù)消化收集細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞，然后提取RNA。取2微克RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后進(jìn)行realtimePCR分析。
[0127]引物序列如下:
[0128]0CT4:
[0129]正向:5’-TAGGTGAGCCGTCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO:12)
[0130]反向:5，-GCTTAGCCAGGTTCGAGGAT-3，(SEQID NO:13)
[0131]S0X2:[0132]正向:5’-AGGGCTGGGAGAAAGAAGAG-3’ (SEQ ID NO:14)
[0133]反向:5，-CCGCGATTGTTGTGATTAGT-3，(SEQID NO:15)
[0134]NAN0G2:
[0135]正向:5，-ATCCCTTCCCTCGCCATCAC-3，(SEQID NO:16)
[0136]反向:5，-GGCATTGATGAGGCGTTCC-3’(SEQ ID NO:17)
[0137]Daxl
[0138]正向:5’-TGCTGCGGTCCAGGCCATCAAGAG-3’ (SEQ ID NO:18)
[0139]反向:5，-GGGCACTGTTCAGTTCAGCGGATC-3’(SEQ ID NO:19)
[0140]Eras
[0141]正向:5，-TGCCTACAAAGTCTAGCATCTTG-3，(SEQID NO:20)
[0142]反向:5，-CTTTTACCAACACCACTTGCAC-3，(SEQID NO:21)
[0143]GAPDH:[0144]正向:5，-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3，(SEQID NO:22 )
[0145]反向:5’-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3’ (SEQ ID NO:23)
[0146]如圖8所示，OySyNyK方法比OSNK方法能夠更迅速和更強(qiáng)的誘導(dǎo)內(nèi)源多能因子0CT4、S0X2、NANOG的表達(dá)；如圖9為所示，OySyNyK方法比OSNK方法能夠更迅速和更強(qiáng)的誘導(dǎo)內(nèi)源多能因子Eras、Daxl的表達(dá)；
[0147]實(shí)施例7體外畸胎瘤形成試驗(yàn)
[0148]將OySyNyK方法誘導(dǎo)建系的iPS細(xì)胞去除feeder后，以2*106細(xì)胞量注射到SCID裸鼠(購自維通利華)后腿上部，約2月后取出畸胎瘤組織進(jìn)行蘇木精伊紅染色。由圖12結(jié)果所示，OySyNyK方法誘導(dǎo)建系的iPS產(chǎn)生的畸胎瘤當(dāng)中有三個(gè)胚層的結(jié)構(gòu)，證明了該iPS細(xì)胞系的全能性。
[0149]實(shí)施例8逆轉(zhuǎn)錄病毒外源某閔表汰沉默
[0150]取OySyNyK病毒感染MEF第三天的樣品，六株建系傳代的OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞系，MEF細(xì)胞進(jìn)行Trizol裂解，提取RNA。取2微克RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后進(jìn)行realtime PCR分析。引物序列如下:
[0151]0CT4:
[0152]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:24)
[0153]反向:5，-CCAGGTTCGAGAATCCAC-3，(SEQID NO:25)
[0154]S0X2:
[0155]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:26)
[0156]反向:5，-GGGCTGTTCTTCTGGTTG-3，(SEQID NO:27)
[0157]NANOG:
[0158]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:28)
[0159]反向:5，-GGCATTGATGAGGCGTTCC-3’(SEQ ID NO:29)
[0160]KLF4:
[0161]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:30)
[0162]反向:5，-GCTGGACGCAGTGTCTTCTC-3，(SEQID NO:31)
[0163]GAPDH:[0164]正向:5’-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3’ (SEQ ID NO:32)
[0165]反向:5’-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3’ (SEQ ID NO:33)
[0166]如圖10所示，六株建系傳代的OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞系中，外源表達(dá)的0y, Sy, Ny, K均已經(jīng)處于表達(dá)沉默狀態(tài)。
[0167]實(shí)施侈Il 90ct4矛口 Nanog promoter在OySyNyK方法誘導(dǎo)iPS I寸矛呈中十 諫.去甲基仆,
[0168]提取各樣品的基因組，然后進(jìn)行亞硫酸鹽處理。本實(shí)驗(yàn)是采用Millipore公司的試劑盒CpGenome?Turbo Bisulfite Modification Kit進(jìn)行樣品處理。然后對產(chǎn)物進(jìn)行0ct4和Nanog啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物平端連接pEASY_T3載體(購自全式金)，隨機(jī)挑去10個(gè)克隆進(jìn)行測序。引物信息如下: [0169]NANOG啟動(dòng)子的DNA甲基化分析
[0170]正向:5，-GATTTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAATTT-3，(SEQID NO:34)
[0171]反向:5，-ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATA-3’(SEQ ID NO:35)
[0172]0CT4啟動(dòng)子的DNA甲基化分析:
[0173]正向:5，-ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA-3’(SEQ ID NO:36)
[0174]反向:5，-CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC-3，(SEQID NO:37)
[0175]對0ct4、Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行胞嘧啶甲基化狀態(tài)的分析顯示，相對于常規(guī)OSNK誘導(dǎo)方法,OySyNyK方法能夠在短至1_2天的時(shí)間內(nèi)使0ct4、Nanog的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生快速的去甲基化，使其從表達(dá)抑制狀態(tài)進(jìn)入到高水平的活性表達(dá)狀態(tài)。
[0176]實(shí)施例1OOySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS可以生成嵌合體小鼠和進(jìn)行種系傳遞
[0177]OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS囊胚注射到ICR小鼠3.5天囊胚當(dāng)中，然后移植到代孕母鼠子宮里。生出的后代小鼠中后雜合毛色的嵌合體小鼠，然后將嵌合體公鼠和野生型ICR母鼠交配，出生的后代小鼠中有純黑色小鼠出生。
[0178]如圖左所示OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS能成功的生出嵌合體小鼠。如圖右所示，出生的嵌合體小鼠能成功的進(jìn)行種系傳遞。說明OySyNyK方法誘導(dǎo)的iPS多能性良好。
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段，以及與所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段直接連接或通過連接序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段； 優(yōu)選地，所述連接序列為GGGGS ； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因編碼的蛋白或其片段通過氨基端或羧基端與轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段連接；優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自 0CT4、S0X2、NANOG、SOXl、S0X3、S0X15、S0X18、STAT3、SMADl、Sal4、Nr5a2、Daxl、Esrrb、Utfl、MyoD、CEBPa、Pax5，Pdxl、Ngn3、MafA、Ascll、Brn2、Mytll、Gata4、Mef2c 和 Tbx5 中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自0CT4、S0X2、NANOG、MyoD、CEBP α、Pax5、Pdxl、Ngn3、MafA、Ascl1、Brn2、Gata4、Mef2c 和 Tbx5 中的一種或多種；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因選自0CT4、S0X2和NANOG中的一種或多種，例如一種、兩種或二種； 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域?yàn)椴溉閯?dòng)物YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段；更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域選自小鼠、豬、羊、牛或人的YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域選自小鼠的YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段；再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白選自以下的一種或多種:0CT4蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；S0X2蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；NAN0G蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；、MyoD蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；CEBPa蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Pax5蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Pdxl蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Ngn3蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；MafA蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Ascll蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Brn2蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Gata4蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Mef2c蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白；Tbx5蛋白與YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白； 優(yōu)選地，所述融合蛋白選自 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:38-48所示的氨基酸序列中的一種或多種。
3.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白； 優(yōu)選地，編碼所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 優(yōu)選地，所述核苷酸序列選自SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:49-59所不的核苷酸序列中的一種或多種。
4.一種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體表達(dá)如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白； 優(yōu)選地，所述載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體； 更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T細(xì)胞。
5.一種組合物，所述組合物含有如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列和/或如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述組合物含有至少一種選自下組的融合蛋白:0CT4-YAPtad、S0X2-YAPtad和NANOG-YAPtad ； 優(yōu)選地，所述組合物還包括Klf4蛋白、編碼Klf4蛋白的核苷酸和/或表達(dá)載體； 優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的表達(dá)載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； 優(yōu)選地，所述編碼Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
優(yōu)選地，所述組合物包括選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7 所示的核苷酸序列。
6.一種試劑盒，所述試劑盒含有如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列、如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體和/或如權(quán)利要求5所述的組合物； 優(yōu)選地，所述試劑盒含有至少一種選自下組的融合蛋白:0CT4-YAPtad、S0X2-YAPtad和NANOG-YAPtad ； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括Klf4蛋白、編碼Klf4蛋白的核苷酸和/或表達(dá)載體； 優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的表達(dá)載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； 優(yōu)選地，所述編碼Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 優(yōu)選地，所述試劑盒包括包括選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:8 所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
7.一種將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: 1)用權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、權(quán)利要求3所述的核苷酸序列、權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求5所述的組合物或權(quán)利要求6所述的試劑盒處理體細(xì)胞， 2)將上述步驟I)獲得的經(jīng)過處理后的體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出具有多能干細(xì)胞理化特征的細(xì)胞，從而獲得多能干細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述體細(xì)胞為人或者其他物種的任何成體細(xì)胞；更優(yōu)選地，所述體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的成體細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人或鼠；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述成體細(xì)胞為:皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞和/或口腔上皮細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述體細(xì)胞處理包括通過病毒感染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或mRNA轉(zhuǎn)染將所述融合蛋白、核苷酸序列、表達(dá)載體和/或組合物導(dǎo)入體細(xì)胞中； 優(yōu)選地，所述方法為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染；更優(yōu)選地，所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞為293T ； 優(yōu)選地，所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中，使用病毒感染復(fù)數(shù)大于等于10的逆轉(zhuǎn)錄病毒量去感染細(xì)胞；更優(yōu)選地，使用病毒感染復(fù)數(shù)等于10的逆轉(zhuǎn)錄病毒量去感染細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟I)是通過包括以下步驟的方法進(jìn)行的: a)構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述的細(xì)胞全能性相關(guān)的基因或其片段和哺乳動(dòng)物YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或其具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的片段的核苷酸序列的質(zhì)粒載體；優(yōu)選地，還構(gòu)建含有Klf4的核苷酸序列的質(zhì)粒載體； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞全能性相關(guān)的基因包括全長序列的0CT4、S0X2和NANOG，所述YAP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?yàn)樾∈骙AP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域； 優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為逆轉(zhuǎn)錄病毒pMXs載體； 優(yōu)選地，所述pMXs載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示； b)將上述步驟a)獲得的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)之后，收集病毒上清液，過濾后，將病毒混合，加入聚凝胺，感染成體細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞重編程； 優(yōu)選地，所述過濾使用0.45 μ m PVDF濾器； 優(yōu)選地，所述病毒以1:1:1:1的比例混合； 優(yōu)選地，所述加入聚凝胺后的終濃度為8 μ g/μ I。
9.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、權(quán)利要求3所述的核苷酸序列、權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求5所述的組合物或權(quán)利要求6所述的試劑盒在制備用于將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的 試劑中的用途。
【文檔編號】C07K19/00GK103739718SQ201410020902
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】陳大華, 金鵬, 孫欽秒, 夏來新, 朱庚振, 朱飛, 林蔚, 譚薇琦 申請人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所