一種rhNGF成熟肽的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種rhNGF成熟肽的制備方法。步驟為表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建；包涵體表達(dá)，收集菌體；包涵體裂解、洗滌、溶解、復(fù)性，得到pro-rhNGF復(fù)性液；陽(yáng)離子交換層析初步純化pro-rhNGF復(fù)性液；疏水作用層析二次純化pro-rhNGF；胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前導(dǎo)肽獲得rhNGF成熟肽；rhNGF成熟肽的第三次純化得到純化的rhNGF成熟肽。本發(fā)明的方法可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)rhNGF成熟肽，純度高，得率高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種rhNGF成熟肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及rhNGF成熟肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)作用廣泛，其中β亞單位是NGF的活性區(qū)。目前商品化的β -mNGF如恩經(jīng)復(fù)? CN0BEX),是從成年雄性小鼠頜下腺分離和純化獲得。廣泛應(yīng)用眼科、神經(jīng)外科、骨科、神經(jīng)內(nèi)科、兒科、內(nèi)分泌科神經(jīng)萎縮、神經(jīng)變性、外傷修復(fù)等疾病的治療。
[0003]正因?yàn)樽⑸溆檬笊窠?jīng)生長(zhǎng)因子的需求不斷擴(kuò)大，而現(xiàn)今的NGF產(chǎn)品存在兩個(gè)潛在的瑕疵:第一，因?yàn)槭鞘笤搭M下腺中提取的蛋白質(zhì)，具有潛在的免疫原性。第二，隨著需求的擴(kuò)大，需要大量的合格的小鼠頜下腺，成為擴(kuò)大規(guī)模的瓶頸。因此，重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的開(kāi)發(fā)迫在眉睫。近年來(lái)，已有大量的重組表達(dá)β-hNGF的報(bào)道，包括在原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)里的表達(dá)，但仍未有研究成果應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化。究其原因，其中大部分表達(dá)策略是直接將編碼IlSaa的成熟肽基因直接進(jìn)行重組表達(dá)，而沒(méi)有考慮到成熟肽形成過(guò)程中，N端上游的導(dǎo)肽在成熟肽的表達(dá)過(guò)程中具有促進(jìn)其正確折疊的作用，從而影響其產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。
[0004]通常所說(shuō)的β-hNGF是118個(gè)氨基酸成熟肽。在人體內(nèi)，從編碼基因到成熟肽經(jīng)歷下列過(guò)程:①prepro-hNGF編碼序列(723bp)翻譯成prepro-hNGF (241aa),prepro-hNGF 包括信號(hào)妝(prepeptide, aa:1-18)、導(dǎo)妝(propeptide, aa:19-121)、妝(peptide, aa: 122-241)；②prepro-hNGF在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上被信號(hào)肽酶水解形成pro-hNGF,pro-hNGF包括導(dǎo)肽和肽 。導(dǎo)肽末端帶有4個(gè)氨基酸殘基(aa: 118-121)Arg-Ser-Lys_Arg,該4個(gè)氨基酸序列為哺乳動(dòng)物前體蛋白加工酶(proprotein convatases)的識(shí)別位點(diǎn)，導(dǎo)肽可被高爾基體中的前體蛋白加工酶-弗林蛋白酶(fur in)識(shí)別并切除，形成hNGF (120aa)；③hNGF在7S hNGF中的Y -亞基作用下切除C端的ArgAla形成hNGF成熟肽(118aa)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)hNGF成熟肽的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種rhNGF成熟肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟，
[0007]I)表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建:
[0008]人工合成SEQ ID NO:3序列，NdeI和BamHI雙酶切后克隆入pETlla空載體中得到構(gòu)建好的融合表達(dá)載體pETlla-pro-hNGF ;將所述融合表達(dá)載體pETlla-pro-hNGF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)得到表達(dá)工程菌；
[0009]2) pro-rhNGF的包涵體表達(dá),收集菌體；
[0010]3) pro-rhNGF的包涵體裂解、洗滌、溶解、復(fù)性，得到pro-rhNGF復(fù)性液；
[0011]4)陽(yáng)離子交換層析初步純化pro-rhNGF ；
[0012]5)疏水作用層析二次純化pro-rhNGF ；[0013]6)胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前導(dǎo)肽獲得rhNGF成熟肽；
[0014]7)陽(yáng)離子交換層析第三次純化得到rhNGF成熟肽。
[0015]所述步驟2)為將步驟1)所得表達(dá)工程菌劃線于瓊脂板上，在37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株；挑取單菌落接種于100mL液體含50 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)約10_12h ;按1:50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ 1.0-1.2 ;立即加入IPTG至終濃度為ImM，37°C，250rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h, 8000rpm, 4°C離心20min收集菌體。
[0016]所述步驟3)的裂解為將步驟2)所得菌體添加Lysis buffer,重懸菌體；再分別按照終濃度為10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ;在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎菌體，超聲波處理Is,停止2s,共處理IOmin,收集沉淀；所述Lysis buffer為0.1M Tris-HCl, ImMEDTA, pH7.0 ；Lysis buffer 添加量按照 5ml Lysis buffer/g 菌體的比例添加；
[0017]所述步驟3)的洗漆為加入步驟2)中Lysis buffer的1/2體積的Triton buffer到上述沉淀即包涵體中，室溫振蕩30min ;12000rpm4°C離心10min,去上清；用等體積的Lysis buffer 重懸沉淀，添加 1/2 體積 Triton buffer,室溫振蕩 30min ; 12000rpm4°C離心lOmin,去上清；用等體積的IB wash buffer重懸沉淀，12000rpm4°C離心10min,去上清；重復(fù)洗滌包涵體3-4次，洗滌后的包涵體可保存于_80°C中；
[0018]所述Triton buffer 為 6%Triton X-100,1.5M NaCl,60mM EDTA,所述 IB washbuffer 為 0.1M Tris-HCl,20mM EDTA,pH7.0 ；
[0019]所述步驟3)的溶解為按5mL/g洗滌后的包涵體的比例添加溶解buffer，室溫溶解包涵體；待沉淀全部溶后，12000rpm，4°C離心10min，取上清；
[0020]所述溶解buffer為6M鹽酸胍，IOOmM DTT ；
[0021]所述步驟3)的復(fù)性為使用6M鹽酸胍溶液透析溶解步驟所得上清，室溫透析3h后更換透析緩沖液，于4°C透析過(guò)夜；再將其添加至復(fù)性液中，逐滴添加，每30min添加500 yL ;直至蛋白樣品中鹽酸胍終濃度降至200mM;將復(fù)性液于4°C過(guò)夜得到復(fù)性液，所述復(fù)性液為 0.1M Tris-HCl, IM L-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L OxidizedGlutathione, 1.53g/L Reduced Glutathione。
[0022]所述步驟4)為使用buffer A透析步驟3)所得復(fù)性液，更換buffer A3-4次；Akta PuriferlOO 層析系統(tǒng)色譜柱為 SP Sepharose Fast Flow5mL ;A1 泵為 buffer A, BI泵為buffer B ;更換之前,先用純水洗泵,換上buffer A、B后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵,管路走100%A1相；基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0-100%buffer B，梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分；洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min ；
[0023] 所述buffer A 為 50mM PBS，pH=7, buffer B 為 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
[0024]所述步驟5)為使用Akta PuriferlOO層析系統(tǒng)進(jìn)行疏水層析純化，色譜柱為:HiTrapCapto Phenyl Sepharose6Fast Flow High SubSmT, ；A1 泵為 buffer AMS, BI 泵為buffer A ;更換之前,先用純水洗泵,換上buffer AMS、buffer A后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵，管路走100%A1相；添加硫酸銨至步驟4)分離收集得到的蛋白樣品中，使其終濃度為IM ;基線沖平后，buffer AMS至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer AMS沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0_100%，梯度長(zhǎng)度為6個(gè)柱體積；收集相應(yīng)吸收峰下的餾分；
[0025]所述buffer AMS 為 50mM PBS，IM 硫酸銨，pH=7，buffer A 為 50mM PBS，pH=7。
[0026]所述步驟6)為使用buffer A透析疏水層析分離得到的蛋白樣品，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品緩沖液為buffer A，使樣品濃度約為0.5mg/mL ;按25011^ hpro_NGF添加Img Trypsin的比例,添加Trypsin, 4°C處理14_16h,可緩慢攪拌,50rpm ;得到rhNGF成熟肽；
[0027]所述buffer A 為 5OmM PBS，pH=7。
[0028]所述步驟7)為使用AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行步驟6)所得rhNGF成熟肽的再次純化，色譜柱為SP Sepharose Fast Flow5mL ；A1泵為buffer A, BI泵為bufferB ;更換之前，先用純水洗泵，換上buffer A、B后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵，管路走100%A1相；基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0-100%buffer B，梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分即可；洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min ；
[0029]還可以使用buffer A透析分離得到的餾分，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品buffer A ；
[0030]所述buffer A 為 50mM PBS, pH=7，buffer B 為 50mM PBS, IM NaCl, pH=7。
[0031]本發(fā)明包括了導(dǎo)肽序列，在最后的切除步驟時(shí)才去掉導(dǎo)肽序列；導(dǎo)肽對(duì)hNGF成熟肽的正確折疊起到輔助作用，在復(fù)性過(guò)程中能大大提高得率。與此同時(shí)，重組表達(dá)時(shí)引入導(dǎo)肽可在下游純化中增加一個(gè)純化步驟，提高純度。
[0032]從實(shí)施例可以看出，本發(fā)明最后得到的rhNGF純度可達(dá)99% ;得率為70%。本發(fā)明的方法可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)rhNGF成熟肽。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1SDS-PAGE檢測(cè)pro-rhNGF重組菌破碎產(chǎn)生的上清及包涵體的電泳圖。
[0034]圖2 AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)陽(yáng)離子交換純化pro-rhNGF (第一步純化)圖。
[0035]圖3SDP-PAGE分析AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)陽(yáng)離子交換純化收集的pro-rhNGF樣品電泳圖。
[0036]圖4 AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)疏水層析純化pro-rhNGF (第二步純化)。
[0037]圖5SDP-PAGE分析AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)疏水層析純化收集的pro-rhNGF樣品電泳圖。
[0038]圖6SDP-PAGE分析胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前導(dǎo)肽的電泳圖。
[0039]圖7 AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)陽(yáng)離子交換層析純化rhNGF成熟肽(第三次純化)。
[0040]圖8SDP-PAGE分析?ΚΤΑ PuriferlOO層析系統(tǒng)陽(yáng)離子交換層析純化rhNGF成熟肽的電泳圖。
[0041]圖9雞胚背 根神經(jīng)節(jié)法檢測(cè)rhNGF的生物活性光學(xué)顯微鏡圖(200倍)。
【具體實(shí)施方式】[0042]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0043]實(shí)施例1:pETlla-pro-rhNGF表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建和包涵體表達(dá)
[0044]1.表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建
[0045]pro-hNGF的編碼序列如SEQ ID N0.1所示，翻譯所得的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。通過(guò)化學(xué)合成的辦法合成SEQ ID N0.3序列，序列的上下游分別引入NdeI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。其中，CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)，GGAATTC為保護(hù)堿基。GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)，CG為保護(hù)堿基，利用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI分別對(duì)合成的SEQ ID N0.3序列和pETlla空載體(novagen)分別進(jìn)行雙酶切；然后將酶切產(chǎn)物分別用乙醇沉淀純化；用T4DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物和原核表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)得到構(gòu)建好的融合表達(dá)載體(pETlla-pro-hNGF);將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體(pETlla-pro-hNGF)轉(zhuǎn)化到E.coli TOPlO (novagen)中，經(jīng)菌液PCR鑒定和測(cè)序鑒定后，將鑒定正確的pET-1 la-pro-hNGF 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Rosetta (DE3)(或 Rosetta (DE3) pLysS)(novagen)表達(dá)菌株中，工程菌保存于_80°C。
[0046]2.pro-rhNGF的包涵體表達(dá)
[0047](I)用滅菌接菌環(huán)刮取_80°C凍存的甘油菌(步驟I所得)，劃線于瓊脂板上，在37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株； [0048](2)挑取單菌落接種于IOOmL液體LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL Amp)中，37°C, 180rpm條件下振蕩培養(yǎng)約10_12h ；
[0049](3)按1:50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至 0D600 ^ 1.0-1.2 (約 3hr)；
[0050](4)立即加入IPTG至終濃度為ImM，37°C，250rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h，8000rpm, 4 V離心20min收集菌體，菌體可保存于-80°C冰箱中。
[0051]實(shí)施例2:pro-rhNGF包涵體的復(fù)性
[0052]1.pro-rhNGF 包涵體裂解
[0053](I)按5ml buffer/g菌體(實(shí)施例1所得)的比例添加Lysis buffer (0.1MTris-HCl, ImM EDTA, ρΗ7.0)，重懸菌體；
[0054](2)分別按照終濃度為10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ；
[0055](3)在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎菌體，超聲波處理ls，停止2s，共處理lOmin，SDS-PAGE檢測(cè)上清及包涵體(沉淀)，泳道I和泳道2為菌體超聲破碎后的上清，泳道3和泳道4為菌體超聲破碎后的沉淀，可以看出裂解的沉淀中可見(jiàn)pro-rhNGF，大小約為30KDa。
[0056]2.pro-rhNGF 包涵體洗漆
[0057](I)加入 I (I)中添加的 Lysis buffer 的 1/2 體積的 Triton buffer (6%TritonX-100,1.5M NaCl,60mM EDTA)到上述沉淀即包涵體中，室溫振蕩30min ；
[0058](2) 12000rpm4°C離心 lOmin,去上清；
[0059](3)用等體積的 Lysis buffer (0.1M Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ7.0)重懸沉淀(可使用超聲波破碎儀進(jìn)行)，添加 1/2 體積 Triton buffer(6%Triton X-100,1.5M NaCl,60mMEDTA)，室溫振蕩30min ；
[0060](4) IZOOOrpmfC離心 lOmin,去上清；
[0061](5)用等體積的 IB wash buffer (0.1M Tris-HCl, 20mM EDTA，ρΗ7.0)重懸沉淀，12000rpm4°C離心 lOmin,去上清；
[0062](6)重復(fù)步驟(1) - (5)洗滌包涵體3-4次，洗滌后的包涵體可保存于_80°C中。
[0063]3.pro-rhNGF 包涵體溶解
[0064](1)按5mL/g洗滌后的包涵體的比例添加溶解buffer (6M鹽酸胍，IOOmM DTT),室溫溶解包涵體，可使用超聲波破碎儀輔助溶解；
[0065](2)待沉淀全部溶(渾池狀)，12000rpm,4°C離心10min,取上清(會(huì)有白色沉淀)；
[0066](3)使用6M鹽酸胍溶液透析包涵體溶液，可室溫透析3h后更換透析緩沖液，于4°C透析過(guò)夜。
[0067]4.pro-rhNGF 包涵體復(fù)性
[0068]緩慢添加包涵體溶解液(上述步驟3 (3)所得)至復(fù)性液(0.1M Tris-HCl, IML-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L Oxidized Glutathione, 1.53g/L Reduced Glutathione)中，逐滴添加,每30min添加500 μ L ;直至蛋白樣品中鹽酸胍終濃度降至200mM。將復(fù)性液于4°C中過(guò)夜得到復(fù)性液。
[0069]實(shí)施例3:pro-rhNGF的分離純化
[0070]1.陽(yáng)離子交換層析初步純化pro-rhNGF
[0071](I)使用buffer A (50mM PBS, pH=7)透析復(fù)性液，更換bufTer3_4次；每次透析2h。
[0072](2)使用AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行(I)所得的初步純化，色譜柱為SPSepharose Fast Flow5mL ；
[0073](3)儀器操作完全按照 protocol 進(jìn)行,Al 泵為 buffer A (50mM PBS,pH=7),BI 泵為buffer B (50mM PBS, IM NaCl, pH=7);更換之前，先用純水洗泵(每次換buffer均要進(jìn)行此操作)，換上buffer A、B后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵,管路走100%A1相；
[0074](4)基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min,上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；
[0075](5)設(shè)置梯度洗脫，0_100%buffer B，梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分。洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min。
[0076]該步驟純化色譜圖見(jiàn)圖2，SDS-PAGE檢測(cè)圖見(jiàn)圖3。其中泳道I為純化前樣品，泳道2為流穿液，泳道3為峰形I收集樣，泳道4為峰形2收集樣；從色譜圖可知，所獲得收集樣，對(duì)稱(chēng)性較好，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，泳道3、4中的主帶大小與pro-rhNGF預(yù)期的大小相符，可確定為pro-rhNGF。
[0077]2.疏水作用層析二次純化pro-rhNGF
[0078](I)使用AlCTA PuriferlOO層析系統(tǒng)進(jìn)行疏水層析純化,色譜柱為:HiTrapCaptoPhenyl Sepharose6Fast Flow(High Sub)5mL ；
[0079](2) Al 泵為 buffer AMS (50mM PBS, IM 硫酸銨，pH=7)，BI 泵為 buffer A (50mMPBS，pH=7);更換之前，先用純水洗泵(每次換buffer均要進(jìn)行此操作)，換上buffer AMS、buffer A (50mM PBS, pH=7)后，Al、BI 分別進(jìn)行洗泵，管路走 100%A1 相；
[0080](3)添加硫酸銨至步驟I分離收集得到的蛋白樣品中，使其終濃度為1M?；€沖平后,buffer AMS至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣,流速設(shè)置:上樣為10mL/min,上完樣后，buffer AMS沖洗至無(wú)紫外吸收；
[0081](4)設(shè)置梯度洗脫，0-100%，梯度長(zhǎng)度為6個(gè)柱體積。收集相應(yīng)吸收峰下的餾分。
[0082]該步驟純化色譜圖見(jiàn)圖4，SDS-PAGE檢測(cè)圖見(jiàn)圖5。其中泳道I為收集樣品1，泳道2為收集樣品2，從圖中可以看出，經(jīng)疏水層析后獲得純度較高的pro-rhNGF。
[0083]實(shí)施例4:rhNGF成熟肽的分離純化及生物學(xué)活性檢測(cè)
[0084]1.胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前導(dǎo)肽獲得rhNGF成熟肽
[0085](1)使用buffer A (50mM PBS, pH=7)透析疏水層析分離得到的蛋白樣品，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品緩沖液為buffer A，使樣品濃度約為0.5mg/mL。使用紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算公式為1.45*A280-0.74*A260 ；
[0086](2)按 250mg hpro-NGF 添加 Img Trypsin 的比例，添加 Trypsin, 4°C處理 14_16h,可緩慢攪拌(50rpm)。Trypsin可切割去除Mature-NGF上游的導(dǎo)肽。酶切的結(jié)果見(jiàn)圖6,其中泳道I為酶切前的pro-rhNGF，泳道2為酶切后的獲得的樣品，如圖中箭頭所示。理論預(yù)測(cè)的pro-hNGF大小為24.7KD，理論預(yù)測(cè)的hNGF大小為13.2KD，圖中所示大小與之相符，可確定所獲樣品為rhNGF。
[0087]2.rhNGF成熟肽的制備
[0088](1)使用AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行rhNGF成熟肽(也即上述所得酶切后的rhNGF)進(jìn)行再次純化，色譜柱為SP Sepharose Fast Flow5mL ；
[0089](2)儀器操作完全按照 protocol 進(jìn)行,Al 泵為 buffer A (50mM PBS,pH=7),BI 泵為buffer B (50mM PBS, IM NaCl, pH=7);更換之前，先用純水洗泵(每次換buffer均要進(jìn)行此操作)，換上buffer A、B后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵,管路走100%A1相；
[0090](3)基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min,上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；
[0091](4)設(shè)置梯度洗脫，0-100%buffer B，梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分。洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min。收集相應(yīng)吸收峰下的餾分。
[0092](5)使用buffer A透析分離得到的蛋白樣品(即(4)所收集到的餾分)，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品buffer為buffer A,紫外吸收法測(cè)定濃度，冷凍離心濃縮并保存于-20 °C。
[0093]該步驟純化色譜圖見(jiàn)圖7，SDS-PAGE檢測(cè)圖見(jiàn)圖8。泳道I為蛋白marker，泳道I即為rhNGF成熟肽。從圖中可以看出經(jīng)過(guò)三步純化獲得的rhNGF純度可達(dá)99%。得率為70%。
[0094]3.rhNGF成熟肽生物學(xué)活性檢測(cè)
[0095]取9d齡雞胚(白殼蛋雞)，顯微解剖鏡下，剝離背根神經(jīng)節(jié)，分散接種在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組中加入純化的rhNGF成熟肽，37°C培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察突起生長(zhǎng)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9，其中1為6ng-恩經(jīng)復(fù)原液處理(廈門(mén)北大之路生物工程有限公司上市產(chǎn)品)的神經(jīng)節(jié)，2為6ng-rhNGF處理的神經(jīng)節(jié)，3為陰性對(duì)照(PBS);結(jié)果表明利用本方案表達(dá)、純化獲得的rhNGF成熟肽與恩經(jīng)復(fù)具有相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?，2均為神經(jīng)纖維長(zhǎng)滿四周，按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是一致的。
[0096]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范 圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種rhNGF成熟肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟， 1)表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建: 人工合成SEQ ID NO:3序列，NdeI和BamHI雙酶切后克隆入pETlla空載體中得到構(gòu)建好的融合表達(dá)載體pETlla-pro-hNGF ;將所述融合表達(dá)載體pETlla-pro-hNGF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)得到表達(dá)工程菌； 2)pro-rhNGF的包涵體表達(dá)，收集菌體； 3)pro-rhNGF的包涵體裂解、洗滌、溶解、復(fù)性，得到pro-rhNGF復(fù)性液； 4)陽(yáng)離子交換層析初步純化pro-rhNGF； 5)疏水作用層析二次純化pro-rhNGF； 6)胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前導(dǎo)肽獲得rhNGF成熟肽； 7)陽(yáng)離子交換層析第三次純化得到rhNGF成熟肽。
2.權(quán)利要求1所述rhNGF成熟肽的制備方法，其特征在于，所述步驟2)為將步驟O所得表達(dá)工程菌劃線于瓊脂板上，在37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株；挑取單菌落接種于IOOmL液體含SOyg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37 °C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)約10-12h ;按1:50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ 1.0-1.2 ;立即加入IPTG至終濃度為ImM，37°C，250rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h，8000rpm, 4°C離心20min收集菌體。
3.權(quán)利要求1所述rhNGF 成熟肽的制備方法，其特征在于，所述步驟3)的裂解為將步驟2)所得菌體添加Lysis buffer,重懸菌體；再分別按照終濃度為10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ;在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎菌體，超聲波處理ls，停止2s，共處理lOmin，收集沉淀；所述 Lysis buffer 為 0.1M Tris-HCl, ImM EDTA, pH7.0 ；Lysis buffer 添加量按照5ml Lysis buffer/g菌體的比例添加； 所述步驟3)的洗漆為加入步驟2)中Lysis buffer的1/2體積的Triton buffer到上述沉淀即包涵體中，室溫振蕩30min ;12000rpm4°C離心10min,去上清；用等體積的Lysisbuffer 重懸沉淀，添加 1/2 體積 Triton buffer,室溫振蕩 30min ; 12000rpm4°C離心 IOmin,去上清；用等體積的IB wash buffer重懸沉淀，I^OOOrpmfC離心10min,去上清；重復(fù)洗漆包涵體3-4次，洗滌后的包涵體可保存于_80°C中；
所述Triton buffer 為 6%Triton X-100,1.5Μ NaCl,60mM EDTA,所述 IB wash buffer為 0.1M Tris-HCl,20mM EDTA, pH7.0 ； 所述步驟3)的溶解為按5mL/g洗漆后的包涵體的比例添加溶解buffer,室溫溶解包涵體；待沉淀全部溶后，12000rpm，4°C離心10min，取上清； 所述溶解buffer為6M鹽酸胍，IOOmM DTT ； 所述步驟3)的復(fù)性為使用6M鹽酸胍溶液透析溶解步驟所得上清，室溫透析3h后更換透析緩沖液，于4°C透析過(guò)夜；再將其添加至復(fù)性液中，逐滴添加，每30min添加500 μ L ;直至蛋白樣品中鹽酸胍終濃度降至200mM ;將復(fù)性液于4°C過(guò)夜得到復(fù)性液，所述復(fù)性液為 0.1M Tris-HCl, IM L-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L Oxidized Glutathione, 1.53g/LReduced Glutathione。
4.權(quán)利要求1所述rhNGF成熟肽的制備方法,其特征在于,所述步驟4)為使用bufferA透析步驟3)所得復(fù)性液,更換buffer A3-4次；AKTA PuriferlOO層析系統(tǒng)色譜柱為SPSepharose Fast Flow5mL ;A1 泵為 buffer A,BI 泵為 buffer B ;更換之前,先用純水洗泵,換上buffer A、B后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵，管路走100%A1相；基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0-100%bufTer B,梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分；洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min ；
所述 buffer A 為 50mM PBS，pH=7，buffer B 為 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
5.權(quán)利要求1所述rhNGF成熟肽的制備方法，其特征在于，所述步驟5)為使用AKTAPuriferlOO層析系統(tǒng)進(jìn)行疏水層析純化,色譜柱為:HiTrapCapto Phenyl Sepharose6FastFlow High Sub5mL ；A1泵為buffer AMS,BI泵為buffer A ;更換之前,先用純水洗泵，換上buffer AMS、buffer A后，Al、BI分別進(jìn)行洗泵,管路走100%A1相；添加硫酸銨至步驟4)分離收集得到的蛋白樣品中，使其終濃度為IM ;基線沖平后，buffer AMS至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer AMS沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0-100%，梯度長(zhǎng)度為6個(gè)柱體積；收集相應(yīng)吸收峰下的餾分； 所述 buffer AMS 為 50mM PBS，IM 硫酸銨，pH=7，buffer A 為 50mM PBS，pH=7。
6.權(quán)利要求1所述rhNGF成熟肽的制備方法,其特征在于,所述步驟6)為使用bufferA透析疏水層析分離得到的蛋白樣品，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品緩沖液為bufferA,使樣品濃度約為0.5mg/mL ;按250mg hpro-NGF添加Img Trypsin的比例，添加Trypsin,4°C處理14-16h,可緩慢攪拌，50rpm ;得到rhNGF成熟肽； 所述 buffer A 為 50mM PBS，pH=7。
7.權(quán)利要求1所述rhNGF成熟肽的制備方法，其特征在于，所述步驟7)為使用AKTAPuriferlOO層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行步驟6)所得rhNGF成熟肽的再次純化,色譜柱為SP SepharoseFast Flow5mL ;A1泵為buffer `A, BI泵為buffer B ;更換之前,先用純水洗泵,換上bufferA、B后，A1、B1分別進(jìn)行洗泵，管路走100%A1相；基線沖平后，buffer A至少平衡5個(gè)柱體積后開(kāi)始上樣，流速設(shè)置:上樣為10mL/min，上完樣后，buffer A沖洗至無(wú)紫外吸收；設(shè)置梯度洗脫，0-100%bUffer B，梯度長(zhǎng)度為20個(gè)柱體積，收集相應(yīng)吸收峰下的餾分即可；洗脫緩沖液流速設(shè)置為5mL/min ； 還可以使用buffer A透析分離得到的餾分，或使用3KD的超濾濃縮管置換樣品bufferA；
所述 buffer A 為 50mM PBS，pH=7，buffer B 為 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103880943SQ201410024115
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】張文宇, 章永壘, 陳星 , 黃奮飛, 白羊, 阮卡, 陳勝亮 申請(qǐng)人:廈門(mén)北大之路生物工程有限公司