一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，屬于動物病毒性疾病監(jiān)測和診斷試劑領(lǐng)域。該試劑盒包括包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體、酶標(biāo)鏈霉親和素、陽性對照、陰性對照、TMB顯色液、終止液、洗滌液和稀釋液。本發(fā)明試劑盒不僅利用多克隆抗體識別更多病毒抗原表位，而且利用生物素標(biāo)記單克隆抗體，通過酶標(biāo)酶標(biāo)鏈霉親和素的信號放大作用進(jìn)一步提高了本試劑盒的敏感性。同時本試劑盒與豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒無交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的快速診斷及研究工作。
【專利說明】一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物病毒性疾病監(jiān)測和診斷試劑領(lǐng)域，更具體地為一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙、仔豬出現(xiàn)呼吸道疾病為特征的傳染病。是世界動物衛(wèi)生組織(Office International DesEpizooties, 0IE)列入的93種法定報告的動物疫病之一。據(jù)統(tǒng)計，該病每年給美國的養(yǎng)豬業(yè)造成近5.6億美元的經(jīng)濟(jì)損失(Cho and Dee, 2006)。我國于1996年從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，證實我國也存在豬繁殖與呼吸綜合征。隨著病毒的遺傳和變異，2006年，我國又爆發(fā)了以變異美洲型病毒為病原的高致病性藍(lán)耳病(Tian K et al.，2007)，使我國養(yǎng)豬業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前檢測PPRSV的方法主要有RT-PCR法、病毒分離鑒定、免疫組化法、間接免疫熒光試驗和血清中和試驗等診斷方法，但這些方法要么需要操作活病毒，要么操作復(fù)雜、耗時長，要么特異性和敏感性不足，不利于基層的應(yīng)用和推廣。而現(xiàn)有ELISA方法主要以人工重組蛋白作為抗原，而且在用雙抗夾心法檢測抗原時很少用到酶標(biāo)鏈霉親和素放大信號的作用，從而使得特異性和敏感性都有所不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒在保證特異性、敏感性和重復(fù)性的前提下，能夠簡單快速準(zhǔn)確檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其組成包括包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體、酶標(biāo)鏈霉親和素、陽性對照、陰性對照、TMB顯色液、終止液、洗滌液和稀釋液。
[0007]所述的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備:利用Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)PPRSV JXAl-R株，以超速離心純化的PPRSV為抗原，與弗氏完全佐劑充分乳化后，免疫60日齡家兔，15天、30天分別用同樣抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后各加強(qiáng)免疫一次，45天后采血，分離血清；用Protein A親和層析純化得到抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體。
[0008]所述的包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備:將抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體用包被液以每孔100ng/100yL包被酶標(biāo)板，4°C包被過夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封閉2小時，再以pH 7.5的PBST洗滌3次，拍干備用；所述的包被液為0.1M、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液。
[0009]所述的生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體的濃度優(yōu)選為lmg/mL。生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備:
(1)用無水DMSO配制10mg/mL生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
(2)用0.lmol/L、pH 8.8的硼酸鹽緩沖液配制濃度至少為I~3mg/mL的抗體溶液；
(3)按25~100μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥拍酰亞胺酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h ；
(4)每250μ g生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯內(nèi)加入20 μ L lmol/L的氯化銨，室溫孵育IOmin ；
(5)將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。
[0010]所述的酶標(biāo)鏈霉親和素的濃度優(yōu)選為lmg/mL。
[0011]所述的酶標(biāo)鏈霉親和素優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備:稱取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混勻置冰箱4度反應(yīng)30分鐘，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，于室溫避光反應(yīng)30分鐘后加入含5mg鏈霉親和素的水溶液lmL，混勻并裝透析袋與0.05mol/L、pH 9.5的碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h或過夜，使之結(jié)合；然后吸出透析袋中溶液，再加入5mg/mL的NaBH4溶液0.2mL,置冰箱2h，取出加入等體積飽和硫酸銨；放冰箱30min后離心，將所得沉淀物溶于少量0.02mol/L,pH 7.4的PBS中，并透析過夜；次日再離心除去不溶物，即得酶標(biāo)鏈霉親和素。用0.02mol/L、pH 7.4的PBS加至5mL進(jìn)行測定后，冷凍干燥保存。
[0012]所述的陽性對照優(yōu)選為10ng/mL純化的PPRSV ;陰性對照為0.01 mol/L、pH 7.2的 PBS。
[0013]所述的TMB顯色液優(yōu)選為來自商用產(chǎn)品；終止液優(yōu)選為2M H2SO4溶液；洗滌液優(yōu)選為含有0.05% Tween-20的0.1 M PBS溶液，pH為7.2，使用時10倍稀釋；稀釋液優(yōu)選為含有 1% BSA 的 0.01 mol/L、pH 7.2 的 PBS。
[0014]上述檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，包括如下步驟:酶標(biāo)板每孔100 μ L加入待測樣品，37 °C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入100 μ L1:1000倍稀釋的生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體，37°C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入IOOyL 1:2000倍稀釋的酶標(biāo)鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入100 μ L TMB顯色液，37°C反應(yīng)10分鐘；每孔加入50 μ L終止液；用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值，計算S/P值并判定結(jié)果(當(dāng)S/P值≥0.18為陽性，當(dāng)S/P值< 0.18時為陰性)。S為待測樣品的0D450nm讀值，P為陽性對照的0D450nm讀值。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
(I)本發(fā)明不僅利用多克隆抗體識別更多病毒抗原表位，而且利用生物素標(biāo)記單克隆抗體，而且使用了 BAS (生物素-親和素檢測系統(tǒng))_Elisas檢測系統(tǒng)，通過酶標(biāo)酶標(biāo)鏈霉親和素的信號放大作用大大提高了試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性。
[0016](2)本發(fā)明通過采用即用型單一溶液TMB顯色液，較常規(guī)試劑盒所用雙組分顯色液使用更加便利，結(jié)果更穩(wěn)定。
[0017](3)本試劑盒操作簡單方便，與豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒無交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的快速診斷及研究工作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0020]本發(fā)明工藝流程圖如圖1所示。
[0021]實施例1酶標(biāo)板的制備
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的制備
復(fù)蘇Marc-145細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，倒掉上清，接種少量JXAl-R株，加維持液(2%胎牛血清，98% DMEM高糖培養(yǎng)基)，37°C吸附I小時后，添加維持液至原來培養(yǎng)細(xì)胞的體積，37°C、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞病變80%以上時，將細(xì)胞瓶置于_20°C冰箱中，反復(fù)凍融3次，收集病毒液。收集的病毒液5000r/min、4°C離心30min去沉淀。上清用27000r/min、4°C離心I小時，沉淀用少量pH 7.2,0.0lM PBS重懸。以PBS制備15%、25%、35%、45%和55%質(zhì)量體積比的不連續(xù)梯度蔗糖，加樣品至梯度界面上，4°C、35900r/min離心15h。收集25%濃度處的蛋白帶至離心管中，用PBS稀釋重懸，36000r/min離心3小時脫糖。最后用PBS懸浮沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]2、抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒多克隆抗體的制備
取適量純化的抗原(大約3mg左右)與弗氏完全佐劑充分乳化后，采用背部多點(diǎn)免疫60日齡家兔；15天、30天分別用同樣抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后各加強(qiáng)免疫一次；45天后收集全身血液，4°C靜置過夜后3000g離心15min,收集血清。用Protein A親和層析純化得到抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體。
[0023]3、包被多克隆抗體
以每孔100ng/100 μ L包被酶標(biāo)板，包被液為0.1Μ、pH 9.6碳酸鹽緩沖液，4°C包被過夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封閉2小時，再以pH 7.5的PBST洗滌3次，拍干備用。
[0024]實施例2抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體的制備
1、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
將BALB/c小鼠摘除眼球放血，并分離血清供陰性對照用，拉頸脫臼處死小鼠，浸泡于75%酒精溶液5min，隨即放入超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上固定于解剖板上。用鑷子提起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，然后用止血鉗向上下兩側(cè)方向撕拉皮膚，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取不完全高糖DMEM培養(yǎng)液5mL，注入小鼠腹腔.右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部I?2min，也可用該注射器在腹腔內(nèi)反復(fù)抽吸、注射數(shù)次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管。IOOOrpm離心5min，棄上清液。先用IOmL HAT培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，作細(xì)胞計數(shù)，然后根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為2X105/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.lmL，培養(yǎng)板置37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0025]2、脾細(xì)胞的制備
取合適濃度的純化豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原與等體積佐劑完全混勻，免疫6周齡Balb/c小鼠，注射劑量為60?100 μ g。每間隔三周皮下免疫一次、連續(xù)免疫三次后，融合前3天腹腔加強(qiáng)免疫。第一次免疫時使用弗氏完全佐劑，第二、三次使用弗氏不完全佐劑，加強(qiáng)免疫不使用佐劑。取最后一次加強(qiáng)免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球放血，分離陽性血清供檢測抗體用，并將小鼠處死，浸泡于75%酒精中5min，隨即放入超凈臺內(nèi)。用無菌手術(shù)開腹，取出脾臟，放入己盛有5?IOmL不完全培養(yǎng)液(無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Hyclone公司)的平皿中輕輕洗一次，細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入200目篩網(wǎng)，放入另一盛有IOmL不完全培養(yǎng)液的平皿中。用無菌的眼科剪和眼科鑷剪碎，完后晃動平皿2min，使未碾碎的組織結(jié)塊沉淀。吸出上清lOOOr/min離心lOmin，去上清后即為制備好的免疫脾細(xì)胞。
[0026]3、骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備
融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，于含10%的胎牛血清培養(yǎng)液(無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Hyclone公司)培養(yǎng)。選擇呈對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，于融合前于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，每瓶加IOmL培養(yǎng)液。置37°C、含5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)。融合當(dāng)天，用彎頭滴管將呈對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50mL離心管內(nèi)。并記下體積數(shù)，混勻。取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加臺盼蘭染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。
[0027]4、細(xì)胞融合
將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌兩次，同時對脾臟細(xì)胞也進(jìn)行同樣的洗滌，洗完后進(jìn)行計數(shù)。用于細(xì)胞融合的PEG溶液、無血清高糖DMEM培養(yǎng)液預(yù)熱至37°C。分別吸取含I X IO8個脾細(xì)胞和2?3X IO7個骨髓瘤細(xì)胞的懸浮液，加入50mL離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30mL，充分混勻。IOOOrpm離心lOmin，將上清液盡量棄去。輕輕彈擊管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻成糊狀，并將此離心管置于37°C水浴中。一手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一手用ImL吸管吸取1.0mL預(yù)熱的50%、pH 7.2的PEG溶液沿轉(zhuǎn)動的管壁(盡量接近細(xì)胞處)加入。從加入到加完的時間控制在60s左右，靜止I分鐘之后，加入不完全培養(yǎng)液(終止液)開始終止融合。具體加法是第Imin加lmL，第2min加2mL (均應(yīng)邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動離心管)，隨后的3min加3mL，隨后每增加I分鐘終止液多加ImL直至加完20mL終止液。IOOOrpm離心5min，棄去上清。加入HAT培養(yǎng)液(IOmL/板)，輕輕吹吸沉淀的細(xì)胞，使其懸浮并混勻。將細(xì)胞懸液加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.lmL。培養(yǎng)板置37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0028]5、陽性細(xì)胞的篩選和克隆
將Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，快長成單層時，一塊接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXAl-R株，另一塊不接種病毒。48小時后，當(dāng)出現(xiàn)病變時用丙酮固定。然后各加入待篩選的雜交瘤的培養(yǎng)上清，37°C溫育I小時，用pH 7.2,0.0lM PBS洗3次，再加入羊抗小鼠IgG-FITC，37°C避光反應(yīng)60min，洗滌3次后置熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)接種病毒株孔有熒光，而對應(yīng)未接種病毒沒有熒光時，此細(xì)胞孔內(nèi)細(xì)胞判定為陽性細(xì)胞。選取生長旺盛，形態(tài)良好的陽性細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行克隆，最終得到單克隆雜交瘤細(xì)胞株。[0029]6、單抗腹水的制備與純化
采用動物體內(nèi)誘生腹水生產(chǎn)單克隆抗體的方法。取健康Balb/c雌性小鼠5只.每只腹腔注射500 μ L液體降植烷，I~2周后備用。將培養(yǎng)的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞吹下下來，1000rpm離心lOmin，棄上清液，收集細(xì)胞。用不完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，混勻，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至IO6個/mL，每只預(yù)處理的小鼠腹腔注射500 μ L陽性克隆雜交瘤細(xì)胞；7~IOd后收集腹水，3000rpm離心lOmin，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間澄清層，純化后小管分裝，_20°C凍存。取1份預(yù)處理過的腹水加2份0.06mol/L、pH 5.0醋酸緩沖液，用lmol/L HCl調(diào)pH至
4.8 ;按每毫升稀釋腹水加11 μ L辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4°C靜置2小時，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125 μ m)，加入1/10體積的0.01mol/L PBS,用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.2 ;在4°C下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置I小時；1000Og離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS(含137mmol/L NaCl, 2.6mol/L KC1，0.2mmol/L EDTA)中，對 50-100 倍體積的 PBS 透析，4°C過夜，其間換水3次以上；取出1000Og離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩?br> [0030]實施例3生物素標(biāo)記豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體
(1)用無水DMSO配制10mg/mL生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(生物素酯)溶液；
(2)用硼酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH 8.8)配制濃度至少為I~3mg/mL的抗體溶液；
(3)按25~100μ g/mg的比率將生物素酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h ；
(4)每250μ g生物素酯內(nèi)加入20 μ L lmol/L的氯化銨，室溫孵育IOmin ；
(5)將抗體溶液用PBS或其他`所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。
[0031]實施例4 一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括已包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板(實施例1)、生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體(實施例3)、酶標(biāo)鏈霉親和素、陽性對照、陰性對照、TMB顯色液、終止液、洗滌液和稀釋液。陽性對照為10ng/mL純化的PPRSV ;陰性對照為0.01 mol/L、pH 7.2的PBS ；TMB顯色液為來自商用產(chǎn)品；終止液為2M H2SO4溶液；洗滌液為含有0.05% Tween-20的0.1 MPBS溶液，pH為7.2，使用時10倍稀釋；稀釋液為含有1% BSA的0.01 mol/L、pH 7.2的PBS。
[0032]酶標(biāo)鏈霉親和素的制備:稱取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水中，加入新鮮配制的
0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混勻置冰箱4度反應(yīng)30分鐘，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室溫避光反應(yīng)30分鐘后加入含5mg鏈霉親和素(Sti^pavidin)的水溶液ImL,混勻并裝透析袋與0.05mol/L、pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h或過夜,使之結(jié)合；然后吸出透析袋中溶液，再加入NaBH4溶液(5mg/mL)0.2mL,置冰箱2h，取出加入等體積飽和硫酸銨；放冰箱30min后離心，將所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH 7.4的PBS中，并透析過夜；次日再離心除去不溶物，即得酶標(biāo)鏈霉親和素。用0.02mol/L、pH 7.4的PBS加至5mL進(jìn)行測定后，冷凍干燥保存。
[0033]應(yīng)用豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的具體步驟:
(O從試劑盒中取出酶標(biāo)板，每孔100 μ L加入待測樣品，同時陽性對照和陰性對照各加2孔，每孔lOOyL。置37°C孵育30分鐘。
[0034](2)用PBST洗滌3次，每次加入350 μ L/孔，靜置3min。[0035](3)每孔加入100 μ L 1:1000倍用稀釋液稀釋的原濃度為lmg/mL的生物素化單抗，37 °C孵育30分鐘。
[0036](4)用PBST洗滌3次，每次加入200 μ L/孔，靜置3min。
[0037](5)每孔加入100 μ L 1:2000倍用稀釋液稀釋的原濃度為lmg/mL酶標(biāo)鏈霉親和素，37 °C孵育30分鐘。
[0038](6)用PBST洗滌5次，每次加入200 μ L/孔，靜置3min。
[0039](7)每孔加入100 μ L TMB顯色液，37°C反應(yīng)10分鐘后每孔加入50 μ L終止液。用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。計算S/P值并判定結(jié)果(當(dāng)S/P值≥0.18為陽性，當(dāng)S/P值< 0.18時為陰性)。S為待測血清樣品的0D450nm讀值，P為陽性對照的0D450nm讀值。
[0040]ELISA臨界值的判定:將50份陽性血清樣本和50份陰性血清樣本進(jìn)行ELISA檢測，計算S/P值(S為待測血清樣本的0D450nm讀值，P為陽性對照的0D450nm讀值)，利用SPSS軟件做二者S/P值的相關(guān)性分析，確定最大符合的臨界值為S/P=0.18，因此判定當(dāng)S/P值≥0.18為陽性，當(dāng)3外值< 0.18時為陰性。
[0041 ] 實施例5具體應(yīng)用效果
(1)交叉反應(yīng)試驗:
分別用豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性對照、豬繁殖與呼吸綜合征病毒陰性對照使用豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗。結(jié)果如表1所示，表明該試劑盒與豬其他病毒性疾病間不存在交叉反應(yīng)。
[0042]表1.交叉反應(yīng)試驗
【權(quán)利要求】
1.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括:包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體、酶標(biāo)鏈霉親和素、陽性對照、陰性對照、TMB顯色液、終止液、洗滌液和稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體通過包含如下步驟的方法制備:利用Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV JXAl-R株，以超速離心純化的PRRSV為抗原，與弗氏完全佐劑充分乳化后，免疫60日齡家兔，15天、30天分別用同樣抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后各加強(qiáng)免疫一次，45天后采血，分離血清；用Protein A親和層析純化得到抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體的酶標(biāo)板通過包含如下步驟的方法制備:將抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多克隆抗體用包被液以每孔lOOng/lOOy L包被酶標(biāo)板，4°C包被過夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封閉2小時，再以pH 7.5的PBST洗滌3次，拍干備用；所述的包被液為0.1Μ、ρΗ 9.6的碳酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體的濃度為lmg/mL ;生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體通過包含如下步驟的方法制備: (1)用無水DMSO配制10mg/mL生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液； (2)用0.lmol/L、pH 8.8的硼酸鹽緩沖液配制濃度至少為I~3mg/mL的抗體溶液； (3)按25~100μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥拍酰亞胺酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h ； (4)每250μ g生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯內(nèi)加入20 μ L lmol/L的氯化銨，室溫孵育IOmin ； (5)將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)鏈霉親和素的濃度為lmg/mL ;酶標(biāo)鏈霉親和素通過包含如下步驟的方法制備:稱取5mg HRP溶于0.5mL蒸懼水中，加入新鮮配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混勻置冰箱4度反應(yīng)30分鐘，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室溫避光反應(yīng)30分鐘后加入含5mg鏈霉親和素的水溶液lmL，混勻并裝透析袋與0.05mol/L、pH 9.5的碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h或過夜，使之結(jié)合；然后吸出透析袋中溶液，再加入5mg/mL的NaBH4溶液0.2mL,置冰箱2h，取出加入等體積飽和硫酸銨；放冰箱30min后離心，將所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH 7.4的PBS中，并透析過夜；次日再離心除去不溶物，即得酶標(biāo)鏈霉未和素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照為10ng/mL純化的PPRSV ;陰性對照為0.01 mol/L、pH 7.2的PBS0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的終止液為2M H2SO4溶液；洗滌液為含有0.05% Tween-20的0.1 M PBS溶液，pH為7.2，使用時10倍稀釋；稀釋液為含有1% BSA的0.01 mol/L、pH 7.2的PBS。
8.權(quán)利要求1-7任一項所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟:酶標(biāo)板每孔100 μ L加入待測樣品，37°C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入100 μ L 1:1000倍稀釋的生物素標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的單克隆抗體，37°C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入100 μ L 1:2000倍稀釋的酶標(biāo)鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘，PBST洗滌；每孔加入100 μ L TMB顯色液，37°C反應(yīng)10分鐘；每孔加入50 μ L終止液；用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值，計算S/P值并判定結(jié)果，其中S為待測樣品的0D450 nm讀值，P為陽性對照的0D450nm讀值，當(dāng)S/P值≥0.18為陽性，當(dāng)S/P值< 0.18時為陰性。
【文檔編號】C07K16/10GK103808927SQ201410039309
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】李建, 曹娟, 廖園園, 秦偉, 朱薇, 劉潔, 漆世華, 謝紅玲, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司