一種用于分離純化凝血因子Ⅷ的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離純化凝血因子Ⅷ的方法，主要是將冷沉淀通過DEAE-Spherodex吸附，然后經(jīng)過免疫親和層析純化，DEAE瓊脂糖凝膠去除抗凝血因子Ⅷ抗體，本發(fā)明的特征之處在于親和層析柱上首先吸附2%的CaCO3，然后將抗凝血因子Ⅷ抗體吸附上去；親和層析時，凝血因子Ⅷ在親和緩沖液中攪拌均勻，用洗脫緩沖液洗脫得到純化的凝血因子Ⅷ。本發(fā)明能降低生產(chǎn)成本，而且還使得血漿中凝血因子Ⅷ的直接提取變?yōu)榭赡?，避免了原先低收率、低純度分離方法的使用。
【專利說明】—種用于分離純化凝血因子WI的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于分離純化凝血因子VDI的方法，屬于生物分離材料領域。
【背景技術】
[0002]生物分離配體是專門用于分離和提純生物相關產(chǎn)品的一類材料。這種工藝廣泛的應用于醫(yī)藥行業(yè)、發(fā)酵行業(yè)、生物制品、血液制品、疫苗等產(chǎn)品的分離。在純化產(chǎn)品時，利用生物分離配體工藝可以達到分離效果好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點。尤其是當需要從血漿中分離提純的目標產(chǎn)品含量較低時，這種分離技術就顯的尤為重要。
[0003]凝血因子珊由健康人血漿，經(jīng)分離、提純，并經(jīng)病毒去除和滅活處理、凍干制成。該制劑對缺乏人凝血因子VDI所致的凝血機能障礙具有糾正作用，主要用于防治甲型血友病和獲得性凝血因子VDI缺乏而致的出血癥狀及這類病人的手術出血治療。甲型血友病是一種伴性遺傳性疾病，人群中的發(fā)病率為0.01%。病人由于凝血機制的缺陷，在遇外傷后往往流血不止，需要輸注足量的凝血因子珊，但是該制劑在人體內的半衰期僅有8~12小時，因此病患需要大量的制劑來維持病情。目前國內國際的凝血因子珊制劑呈現(xiàn)出供不應求的局面。[0004]目前已有的技術中，親和效果最好的配基為Ca2+依賴型單克隆抗體，其結合-解離條件溫和，在含有Ca2+的緩沖溶液中抗體可以和抗原特異性結合，將淋洗液換成含有EDTA的緩沖液即可洗脫下抗原。但是，單克隆抗體造價昂貴，且穩(wěn)定性較差。肝素是另一種親和配基，它是一種帶負電荷的多聚體，是AT-1II的輔因子，優(yōu)勢許多凝血因子的抑制劑，可以通過靜電和親和相互作用可分離血漿中的很多凝血因子。肝素價格較便宜，但是親和的特異性較差。
[0005]因此，選擇合適的分離純化技術的不但能降低生產(chǎn)成本，而且還使得血漿中凝血因子珊的直接提取變?yōu)榭赡埽苊饬嗽鹊褪章省⒌图兌确蛛x方法的使用。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供一種用于分離純化凝血因子珊的方法，具體來說是一種提高從血漿中分離凝血因子VDI的方法，主要通過降低親和層析的負荷量，保持配基牢固的吸附能力來延長使用壽命，達到高效分離凝血因子珊的目的。
[0007]一種用于分離純化凝血因子VDI的方法，包括血漿的收集、處理以及冷沉淀中凝血因子VDI的分離純化，其中冷沉淀通過DEAE-Spherodex吸附,然后經(jīng)過免疫親和層析純化，DEAE瓊脂糖凝膠去除抗凝血因子珊抗體，其中:親和層析柱上首先吸附2%的CaCO3,然后將抗凝血因子VDI抗體吸附上去；親和層析時，凝血因子VDI在親和緩沖液中攪拌均勻，用洗脫緩沖液洗脫得到純化的凝血因子珊。
[0008]一種用于分離純化凝血因子VDI的方法，其中親和緩沖液為0.01mol/L Tris-HCl,pH7.0，3mmol/LCaCl2，所述的洗脫緩沖液為 0.05mol/L Tris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA。
【具體實施方式】[0009]免疫親和層析柱的制備:將2g CNBr-activated sepharose 4B Fast Flow 用400ml lOmmol/L的HCl洗滌，然后緩慢加入層析柱中，保持流出口開放，膠自然沉降；此時，緩慢加入2%的CaCO3,循環(huán)3次，將溶液排放干凈后將抗凝血因子VDI抗體用0.22um的細菌過濾器過濾后加入柱中，然后用0.lmol/L的NaHCO3充分透析；經(jīng)過充分偶聯(lián)后，沖洗至流出液OD28tl為0，再用200ml 0.01mol/L的Tris-HCl，pH7.0緩沖液充分洗柱，以封閉膠上未偶聯(lián)的活化位點；用3倍體積0.01mol/L Tris-HCl,pH7.0，3mmol/LCaCldP 3被體積0.05mol/L Tris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA循環(huán)洗滌層析柱，進行5個循環(huán)。
[0010]不同反應條件對分離效果的影響
將本發(fā)明的最終效果與傳統(tǒng)的兩步離子交換層析分離法相比較，結果如下表所示:
【權利要求】
1.一種用于分離純化凝血因子VDI的方法，包括血漿的收集、處理以及冷沉淀中凝血因子VDI的分離純化，其中冷沉淀通過DEAE-Spherodex吸附,然后經(jīng)過免疫親和層析純化，DEAE瓊脂糖凝膠去除抗凝血因子VDI抗體，其特征在于:親和層析柱上首先吸附2%的CaCO3,然后將抗凝血因子VDI抗體吸附上去；親和層析時，凝血因子VDI在親和緩沖液中攪拌均勻，用洗脫緩沖液洗脫得到純化的凝血因子珊。
2.如權利要求1所述的一種用于分離純化凝血因子VDI的方法，其特征在于:親和緩沖液為 0.01mol/L Tris-HCl，pH7.0，3mmol/LCaCl2，所述的洗脫緩沖液為 0.05mol/LTris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA`。
【文檔編號】C07K14/755GK103864919SQ201410045491
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權日:2014年2月8日
【發(fā)明者】呂獻忠, 蘇峰 申請人:新疆德源生物工程有限公司