一種從血漿中提取人凝血因子Ⅷ的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高凝血因子Ⅷ分離效率、活性、比活、回收率經(jīng)濟、簡單的方法。此方法將冷沉淀先進行兩次肝素鈉洗滌，再通過一次離子交換層析，洗脫液洗脫最后得到較純的凝血因子Ⅷ。和傳統(tǒng)方法比較，本發(fā)明的優(yōu)勢在于操作簡便，成本低，與此同時，還提高了分離效率、活性、比活和回收率。
【專利說明】—種從血漿中提取人凝血因子WI的工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人凝血因子VDI的制備工藝，屬生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]凝血因子VDI是治療甲型血友病唯一的特效藥，在臨床上有巨大的應用價值，病人由于凝血機制有缺陷，偶遇外傷往往流血不止，需要輸入足量的凝血因子珊制劑，加上凝血因子VDI在人體內(nèi)的半衰期只有8~12個小時，雖然效果顯著，但是不能持久，一旦患病，終身需要此藥。雖然這類人人數(shù)不多，但是需求量大，所以在全球形成供不應求的局面。
[0003]出于對安全的考慮，我國尚無對血液進口解禁的打算，中國市場完全為國內(nèi)生產(chǎn)商生產(chǎn)，均為從血液中提取，在現(xiàn)階段研發(fā)出安全性高、產(chǎn)品比活性好、造價低廉的人凝血因子珊有著積極意義。
[0004]發(fā)展到現(xiàn)在，國內(nèi)外已經(jīng)有多種從血液中提取純化因子珊的方法，現(xiàn)有的多步離子交換層析法雖然純化率高，但步驟繁瑣，需要耗費大量時間；近年來單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，免疫親和層析法得到應用，但單克隆抗體造價昂貴，且穩(wěn)定性較差，有可能對血漿造成二次污染，難以大規(guī)模的運用到工業(yè)生產(chǎn)中；肝素作為另一種親和配基，可以利用靜電和親和相互作用分離血漿中很多凝血因子，肝素價格便宜，但親和特異性差。本次技術(shù)方案采用先進行兩次肝素鈉洗滌法分離提取凝血因子，再用離子交換層析法進行針對性洗脫，純化，以達到更好的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供回收效率和活性高，并且生產(chǎn)成本低的一種人凝血因子VDI的制備工藝。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)效果是通過以下步驟得以實現(xiàn)的:
1、將新鮮血漿進行一次沉淀:將新鮮冷凍血漿通過O~4°C水浴融化，并控制血漿溫度在O~4°C，進行離心分離得到一次沉淀，離心時的進液速度≤2000mL/min，分離出液溫度應不聞于4.0°C ；
2、將步驟I得到的一次沉淀進行懸浮:將一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0~29.(TC，攪拌溶解0.5小時，用濃度為0.25~0.3mol/L鹽酸調(diào)pH為6.80~7.00，調(diào)整后加入2500IU/L的肝素鈉溶液，速度200~400mL/分鐘，使之終含量為60IU/L，向溶液中以500~600mL/min的速度加入溶液A(含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸櫞酸鈉，用1.0mol/L鹽酸調(diào)pH為6.20~6.60，溫度25.0 ± 5.(TC )使制品中聚乙二醇濃度達到3.0 %~5.0 %，用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)調(diào)整制品pH至6.50±0.20，降溫至10.0~20.(TC后反應30分鐘，靜置I~2小時；
3、將步驟2得到的懸浮液進行離心分離出上清液:虹吸靜置后的制品上清液進行離心分離，出液速度控制在1000~1500mL/min，溫度控制在12.0~18.(TC，收集離心出液，離心出液應澄清，使用0.15~0.45mol鹽酸調(diào)整制品pH至7.00±0.20，過濾離心后的上清，過濾制品壓力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分鐘，檢查出液應澄清，濾液溫度12.0 ~18.(TC ；
4、將步驟3中的上清液進行病毒滅活:根據(jù)過濾后制品體積加入10%S/D溶液，至終溶液含S/D濃度為1.2%，終溶液含Triton X-100為1.2%，含磷酸三丁酯0.4% ;攪拌均勻后升溫至23~25°C，連續(xù)攪拌3~5小時；
5、將步驟4滅活后的制品進行懸浮:滅活結(jié)束前使用平衡液(配方:0.02mol/L三羥甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸櫞酸鈉，pH為6.40~6.60)平衡裝有澄清濾材的濾器及制品輸送管道，將滅活后的制品澄清過濾入制作罐，濾液溫度應在16~25°C。開啟攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速控制在40~80轉(zhuǎn)/分鐘(頻率為30%~50%)，加入溶液IIK配方:含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸櫞酸鈉，pH 5.60~5.80)，添加速度在500~600mL/min，使制品中聚乙二醇濃度達到12.0±1.0%，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)調(diào)整制品pH至5.80±0.10，再降溫制品至7.0±2.(TC后攪拌反應30~60分鐘，關(guān)閉攪拌靜置60~90分鐘；
6、將步驟5中的懸浮液進行離心分離出二次沉淀:離心分離蛋白沉淀，離心進出液速度控制在1000~2500mL/min，溫度保持在6~9 °C，收集沉淀，上清液廢棄；
7、將步驟6離心分離出的二次沉淀物進行兩次洗滌，兩次離心分離出三次沉淀:用注射用水配制甘氨酸洗滌液，(配制量為冷沉淀量的0.5~I倍體積)內(nèi)含甘氨酸13.14%，枸櫞酸鈉?.53%，肝素鈉80.5 μ g/L,用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為6.65~6.75，降溫至-1.0~1.(TC備用，進行兩次洗滌(加11~14倍沉淀量的洗滌液溶解沉淀，將沉淀切碎，切割攪拌速度控制在3000~4500rpm，臺式離心機轉(zhuǎn)速在3000~4000rpm，溫度為0.0~
4.5°C，分離時間為20分鐘)，得三次沉淀；
8、將步驟7中分離出的三次沉淀進行溶解分離:將三次沉淀加入溶解液(0.15mol/LNaCL)，攪拌至完全溶解，并離心分離出上清液；
9、將步驟8得到的上清液進行一次層析純化精制，得到用于制備人凝血因子珊制品的人凝血因子VDI精制液:將溶解液上DEAE-Fractogel TSK 650M柱，再經(jīng)平衡液(0.1lMNaCl)、洗滌液(0.15M NaCl)、洗脫液(0.25M NaCl)洗滌；
10、將步驟9得到的人凝血因子VDI精制液透析、超濾、配液、分裝。 【具體實施方式】
[0007]在本發(fā)明【具體實施方式】在
【發(fā)明內(nèi)容】
中得以體現(xiàn)，
【發(fā)明內(nèi)容】
可以直接用于實施例。
[0008]實施例1:不同分離方法對人凝血因子VDI最終產(chǎn)品參數(shù)比較:
【權(quán)利要求】
1.一種從血漿中提取人凝血因子珊的工藝，其特征在于:包括以下步驟: ①將新鮮血漿進行一次沉淀:將新鮮冷凍血漿通過O~4°C水浴融化，并控制血漿溫度在O~4°C，進行離心分離得到一次沉淀，離心時的進液速度≤2000mL/min，分離出液溫度應不高于4.(TC ； ②將步驟①得到的一次沉淀進行懸浮:將一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0~`29.(TC，攪拌溶解0.5小時，用濃度為0.25~0.3mol/L鹽酸調(diào)pH為6.80~7.00，調(diào)整后加入2500IU/L的肝素鈉溶液，速度200~400mL/分鐘，使之終含量為60IU/L，向溶液中以500~600mL/min的速度加入溶液A(含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸櫞酸鈉，用1.0mol/L鹽酸調(diào)pH為6.20~6.60，溫度25.0 ± 5.(TC )使制品中聚乙二醇濃度達到3.0 %~5.0 %，用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)調(diào)整制品pH至6.50±0.20，降溫至10.0~20.(TC后反應30分鐘，靜置I~2小時； ③將步驟②得到的懸浮液進行離心分離出上清液:虹吸靜置后的制品上清液進行離心分離，出液速度控制在1000~1500mL/min，溫度控制在12.0~18.(TC，收集離心出液，離心出液應澄清，使用0.15~0.45mol鹽酸調(diào)整制品pH至7.00 ±0.20，過濾離心后的上清，過濾制品壓力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分鐘，檢查出液應澄清，濾液溫度`12.0 ~18.(TC ； ④將步驟③中的上清液進行病毒滅活:根據(jù)過濾后制品體積加入10%S/D溶液，至終溶液含S/D濃度為1.2%，終溶液含Triton X-100為1.2%，含磷酸三丁酯0.4% ;攪拌均勻后升溫至23~25°C，連續(xù)攪拌3~5小時； ⑤將步驟④滅活后的制品進行懸浮:滅活結(jié)束前使用平衡液(配方:0.02mol/L三羥甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸櫞酸鈉，pH為6.40~6.60)，平衡裝有澄清濾材的濾器及制品輸送管道，將滅活后的制品澄清過濾入制作罐，濾液溫度應在16~25°C;開啟攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速控制在40~80轉(zhuǎn)/分鐘(頻率為30%~50%)，加入溶液III (配方:含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸櫞酸鈉，pH 5.60~5.80)，添加速度在500~600mL/min，使制品中聚乙二醇濃度達到12.0±1.0%，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)，調(diào)整制品pH至5.80±0.10，再降溫制品至7.0±2.(TC后攪拌反應30~60分鐘，關(guān)閉攪拌靜置60~90分鐘； ⑥將步驟⑤中的懸浮液進行離心分離出二次沉淀:離心分離蛋白沉淀，離心進出液速度控制在1000~2500mL/min，溫度保持在6~9 °C，收集沉淀，上清液廢棄； ⑦將步驟⑥離心分離出的二次沉淀物進行兩次洗滌，兩次離心分離出三次沉淀:用注射用水配制甘氨酸洗滌液(配制量為冷沉淀量的0.5~I倍體積)，內(nèi)含甘氨酸13.14%，枸櫞酸鈉?.53%，肝素鈉80.5 μ g/L，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為6.65~6.75，降溫至-1.0~1.(TC備用，進行兩次洗滌(加11~14倍沉淀量的洗滌液溶解沉淀，將沉淀切碎，切割攪拌速度控制在3000~4500rpm，臺式離心機轉(zhuǎn)速在3000~4000rpm，溫度為0.0~`4.5°C，分離時間為20分鐘)，得三次沉淀； ⑧將步驟⑦中分離出的三次沉淀進行溶解分離:將三次沉淀加入溶解液(0.15mol/LNaCL)，攪拌至完全溶解，并離心分離出上清液； ⑨將步驟⑧得到的上清液進行一次層析純化精制，得到用于制備人凝血因子珊制品的人凝血因子VDI精制液:將溶解液上DEAE-Fractogel TSK 650M柱，再經(jīng)平衡液(0.1lMNaCl)、洗滌液(0.15M NaCl)、洗脫液(0.25M NaCl)洗滌；⑩將步驟⑨得到的人凝血因子珊精制液透`析、超濾、配液、分裝。
【文檔編號】C07K14/755GK103864920SQ201410045492
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】呂獻忠, 蘇峰 申請人:新疆德源生物工程有限公司