一種熒光染料化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光染料化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下結(jié)構(gòu)通式I：式中，X為C(CH3)2，S或O；n為3或4；m為2或3。本發(fā)明還公開了制備所述的熒光染料化合物的方法。本發(fā)明還公開了上述熒光染料化合物的應(yīng)用。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，在基礎(chǔ)上改進(jìn)，提供了一類結(jié)構(gòu)簡單，靈敏度高，長波長，且具有良好的細(xì)胞膜通透性的新化合物。本發(fā)明的熒光染料化合物主要體現(xiàn)于有非常好的水溶性，且結(jié)構(gòu)簡單，原料易得，毒性小，一般通過4到5步反應(yīng)即可合成目標(biāo)分子，易產(chǎn)業(yè)化。
【專利說明】一種熒光染料化合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于精細(xì)化工【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種熒光染料化合物及其制備方法和應(yīng)用。主要是含氮的菁類熒光染料的制備和應(yīng)用以及利用這種熒光染料或其組合物在生物染色方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光染料作為功能性色素在科學(xué)技術(shù)的各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在生命科學(xué)，臨床醫(yī)藥診斷，棉衣分析檢測等方面的研究在全世界大受矚目。目前，菲啶類(EP、PI)、吖啶類(A0)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和菁家族類(Cy、Τ0Τ0、SYTO)等商品化熒光染料在基因組學(xué)技術(shù)、核酸定量檢測、血細(xì)胞分析等領(lǐng)域中都起到了重要的作用。然而，這些染料都各自存在著應(yīng)用的局限性。其一表現(xiàn)為大多熒光染料受限于固定細(xì)胞樣品。例如T0PR0、TOTO家族染料、溴乙錠(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通過增大細(xì)胞膜的通透性或類似使膜崩解的方法才能對生物樣品進(jìn)行有效的熒光標(biāo)記。然而，這種固定方法往往對細(xì)胞核生物組織真實(shí)形態(tài)的觀察有負(fù)面影響(Kozubek S, Lukasova E, AmrichovaJ, Kozubek M, Liskova A, Slotva J.Anal Biochem2000; 282:2938)。同時溴乙淀等口丫啶，菲啶類染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相當(dāng)一部分熒光染料的激發(fā)光處在紫外光區(qū)，如能夠?qū)Ｒ蛔R別脫氧核糖核酸(DNA)的熒光染料4，6_ 二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258, Hoechst34580等，與DNA結(jié)合后，在紫外激發(fā)放射下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。由于紫外光對細(xì)胞內(nèi)的核酸，蛋白等組分會造成嚴(yán)重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術(shù)中的使用受到光激發(fā)時間限制(Davis SK, Bardeen CJ.PhotochemPhotobiol2003; 77:675-679)，此外，在紫外區(qū)進(jìn)行熒光檢測時，生物樣品在這個區(qū)間的吸收使光進(jìn)入生物組織內(nèi)部變得困難，同時生物樣品中某些成分的自發(fā)熒光形成很強(qiáng)的背景干擾，使檢測效率大大降低，因此，研究開發(fā)出具有良好熒光光譜性能，毒性小，活細(xì)胞通透性的新型熒光染料仍然是推動`熒光分析技術(shù)和生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵和核心。
[0003]在眾多種類的熒光染料中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率適中等優(yōu)點(diǎn)，作為生物分子熒光探針、⑶和V⑶記錄材料、感光材料光敏劑、光電轉(zhuǎn)換材料等已被廣泛的應(yīng)用。其中喹啉類不對稱菁類熒光染料與核酸有高度親和力，而與其他生物大分子基本不結(jié)合的特異性使其在基因組學(xué)技術(shù)、核酸定量檢測、血細(xì)胞分析等領(lǐng)域的應(yīng)用中脫穎而出。該類化合物與核酸的結(jié)合方式包括經(jīng)典吸弓丨、堿基對嵌入及溝槽結(jié)合。具體的結(jié)合方式與結(jié)合能力取決于該標(biāo)識物的結(jié)構(gòu)及其與核酸濃度的比例。不對稱菁類化合物中最典型的為TOTO及其類似物YOYO和衍生物T0PRP0。TOTO (噻唑橙二聚體)、YOYO (惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開發(fā)的一類對核酸具有高度親和力的多正電荷不對稱菁類染料，通過改變多亞基鏈的長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結(jié)構(gòu)可以得到不同的異二聚體類似物的衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾，與核酸結(jié)合后熒光增強(qiáng)。Jason等用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡解釋了 TOTO和YOYO與DNA的雙嵌入作 M (J- A.Bordelon, K.J.Feierabend, S.A.Siddiqui, L.Wright.J.Phys.Chem.B.2002, 106，4838-3843)。Furstenberg等利用超快速熒光轉(zhuǎn)換和時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法進(jìn)一步述了突光增強(qiáng)的動力學(xué)機(jī)理。[A.Furstenberg, M.D.Julliard, T.G.Deligeorgiec, N.1.Gadjev.J.AM.CHEM.S0C.，2006，128，7661-7669]此類染料中的有些品種已經(jīng)商品化了，如:SYT0XBlue，Τ0Τ0, Ρ0Ρ0, BOBO, YO-PRO等，但這些商品化的染料大部分分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，屬活細(xì)胞非通透性，只能應(yīng)用于活體外核酸的識別與檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對上述現(xiàn)有方案存在的問題和不足，本發(fā)明的第一個目的是提供了一種熒光染料化合物。本發(fā)明的第二個目的是提供上述熒光染料化合物的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供了上述熒光染料化合物的應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種熒光染料化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下結(jié)構(gòu)通式1:
[0006]
【權(quán)利要求】
1.一種熒光染料化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下結(jié)構(gòu)通式1:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光染料化合物，其特征在于:所述化合物選自:
3.—種權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的熒光染料化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將式II化合物苯并噻唑芳香雜環(huán)化合物和丙磺酸內(nèi)酯或丁磺酸內(nèi)酯反應(yīng)制得第一季銨鹽中間體III ； 2)將第一季銨鹽中間體III與N，N-二苯甲脒縮合，得到式IV化合物； 3)將式IV化合物與式V化合物反應(yīng)得到式VI化合物； 各化合物結(jié)構(gòu)式如下:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光染料化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟I)的反應(yīng)溫度為10-200°C，反應(yīng)時間為1-48小時，反應(yīng)溶劑選自:二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯，式II化合物與丙磺酸內(nèi)酯或丁磺酸內(nèi)酯的摩爾比為1:1-1:5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光染料化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)的反應(yīng)溫度為10-200°C，反應(yīng)時間為1-48小時，反應(yīng)溶劑為醋酐，醋酸為質(zhì)子酸催化劑，第一季銨鹽中間體III與N，N-二苯甲脒的摩爾比為3:1-1:3。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光染料化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟3)反應(yīng)溫度為10-200°C，反應(yīng)時間為1-48小時，反應(yīng)溶劑為醋酐，醋酸為質(zhì)子酸催化劑，或者反應(yīng)溶劑為乙醇，三乙胺為堿催化劑，式IV化合物與式V化合物的摩爾比為3:1-1:3。
7.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的熒光染料化合物在含氮的菁類熒光染料的制備和生物染色方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C07D417/06GK103804370SQ201410045536
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】李忠, 顧玉龍, 馬飛飛, 金智成, 周國巖 申請人:南京博炫生物科技有限公司