活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，包括下列步驟：本發(fā)明先通過(guò)將待標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體片段與熒光染料偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；再使脂質(zhì)體與熒光標(biāo)記的抗體片段結(jié)合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物；最后將待標(biāo)記細(xì)胞與可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物一起在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，利用脂質(zhì)體可以與細(xì)胞膜相融合的特點(diǎn)，即可以透膜的性質(zhì)，將可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物運(yùn)至待標(biāo)記的細(xì)胞中，并通過(guò)上面的抗原結(jié)合片段與待標(biāo)記的細(xì)胞中的待標(biāo)記蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫結(jié)合，從而將熒光染料連接在待測(cè)蛋白質(zhì)上，最終實(shí)現(xiàn)免疫熒光標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]免疫熒光標(biāo)記法是特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的有效方法，它是以熒光染料標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)。這種方法標(biāo)記蛋白質(zhì)的特異性高，而且熒光染料往往是化學(xué)合成染料，有很高的量子效率。
[0003]但是,相關(guān)技術(shù)中的免疫突光標(biāo)記方法只能對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記(先將活細(xì)胞損壞再進(jìn)行標(biāo)記)，不能標(biāo)記活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因而無(wú)法采用這種方法觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，用于進(jìn)一步的生物學(xué)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，以解決上述的問(wèn)題。
[0005]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，包括下列步驟:
[0006]將待標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體片段與熒光染料偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；其中，所述抗體片段含有抗原結(jié)合片段；
[0007]將脂質(zhì)體與所述熒光標(biāo)記的抗體片段混合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物；
`述可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22_26h。
[0009]本發(fā)明上述實(shí)施例的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，先通過(guò)偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；再使所述脂質(zhì)體與所述熒光標(biāo)記的抗體片段結(jié)合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物；最后將待標(biāo)記細(xì)胞與可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物一起在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，利用脂質(zhì)體可以與細(xì)胞膜相融合的特點(diǎn)，即可以透膜的性質(zhì)，將可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物運(yùn)至待標(biāo)記的細(xì)胞中，并通過(guò)上面的抗原結(jié)合片段與待標(biāo)記的細(xì)胞中的待標(biāo)記蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫結(jié)合，從而將熒光染料連接在待測(cè)蛋白質(zhì)上，最終實(shí)現(xiàn)免疫熒光標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的目的。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1示出了本發(fā)明的試驗(yàn)例中對(duì)照組熒光標(biāo)記后的細(xì)胞熒光成像圖；
[0011]圖2示出了本發(fā)明的試驗(yàn)例中試驗(yàn)組熒光標(biāo)記后的細(xì)胞熒光成像圖；
[0012]圖3示出了本發(fā)明的試驗(yàn)例中對(duì)照組熒光漂白后的熒光淬滅趨勢(shì)圖；
[0013]圖4示出了本發(fā)明的試驗(yàn)例中試驗(yàn)組熒光漂白后的熒光淬滅趨勢(shì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過(guò)具體的實(shí)施例子并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0015]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，包括下列步驟:
[0016]步驟101:將待標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體片段與熒光染料偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；其中，所述抗體片段含有抗原結(jié)合片段(Fab段)。
[0017]步驟102:將脂質(zhì)體與所述熒光標(biāo)記的抗體片段混合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物。
[0018]步驟103:將待標(biāo)記細(xì)胞和所述可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22_26h。
[0019]上述方法中，通過(guò)所述步驟101的偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；再通過(guò)所述步驟102使所述脂質(zhì)體與所述熒光標(biāo)記的抗體片段結(jié)合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物；最后所述步驟103中，將待標(biāo)記細(xì)胞與可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物一起在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，利用脂質(zhì)體可以與細(xì)胞膜相融合的特點(diǎn)，即可以透膜的性質(zhì)，將可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物運(yùn)至待標(biāo)記的細(xì)胞中，并通過(guò)上面的抗原結(jié)合片段與待標(biāo)記的細(xì)胞中的待標(biāo)記蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫結(jié)合，從而將熒光染料連接在待測(cè)蛋白質(zhì)上，最終實(shí)現(xiàn)免疫熒光標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的目的。
[0020]上述方法中，步驟101的偶聯(lián)可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種偶聯(lián)方法，現(xiàn)有技術(shù)中的偶聯(lián)方法通常利用成共價(jià)鍵的結(jié)合原理，例如利用熒光素(即有機(jī)熒光染料)中的異硫氰基與抗體中的氨基結(jié)合將兩者偶聯(lián)，或者利用熒光量子點(diǎn)(即無(wú)機(jī)熒光染料)表面修飾的活性基團(tuán)(羧基、羥基等)與抗體共價(jià)結(jié)合完成偶聯(lián)。步驟102中脂質(zhì)體與熒光標(biāo)記的抗體片段結(jié)合的原理是:脂質(zhì)體利用其雙分子結(jié)構(gòu)將熒光標(biāo)記的抗體片段包裹在內(nèi)。
[0021]此外，由于完整的抗體分子分子量較大，不易運(yùn)輸至細(xì)胞體內(nèi)，因此上述標(biāo)記方法采用了抗體片段，并且該片段中包含了抗原結(jié)合片段，因此既容易運(yùn)輸至細(xì)胞體內(nèi)，有可以與細(xì)胞體內(nèi)的抗原結(jié)合。
[0022]其中，所述熒光染料可以為以下中的一種或幾種:`[0023]阿托488染料(ATT0488)，艾利克斯熒光染料(Alexa Fluor,例如AlexaFluor647, Alexa Fluor405等),羅丹明染料,德克薩斯染料(Texas red),青色素(例如青色素3，青色5等)。
[0024]所述脂質(zhì)體為以下中的一種或幾種:內(nèi)搬運(yùn)者化11(10-?0代虹)，脂質(zhì)體2000。
[0025]此外，上述活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法還可以進(jìn)一步改進(jìn)，以達(dá)到更多的技術(shù)效果:
[0026]優(yōu)選地，所述步驟C中，培養(yǎng)23_25h。該時(shí)長(zhǎng)可以保證抗原抗體充分結(jié)合。為達(dá)到更好的效果，還可以進(jìn)一步優(yōu)選為24h。
[0027]為了更進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的改進(jìn)點(diǎn)，以下還提供了具體試驗(yàn)例。
[0028]試驗(yàn)例
[0029]試驗(yàn)對(duì)象:INS_1細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白(tubulin)。
[0030]試驗(yàn)方法
[0031 ] 設(shè)置試驗(yàn)組和對(duì)照組。
[0032]對(duì)照組采用傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INS-1細(xì)胞鋪在適合細(xì)胞生長(zhǎng)與成像的蓋玻片上，待其生長(zhǎng)過(guò)夜，細(xì)胞伸展并密度合適時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(Iipofectamin) 2000并按照試劑說(shuō)明，用質(zhì)粒增強(qiáng)型綠色突光蛋白(EGFP) -tubulin轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，蛋白表達(dá)和亮度適中，此時(shí)觀察細(xì)胞的熒光成像情況，后進(jìn)行熒光漂白，觀察該組的熒光淬滅情況。
[0033]試驗(yàn)組采用本發(fā)明的方法:先將tubulin的抗體片段與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)偶聯(lián)，得到EGFP-抗體片段，再將脂質(zhì)體與EGFP-抗體片段在溶液中混合，得到載有EGFP-抗體片段的脂質(zhì)體。同時(shí)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INS-1細(xì)胞鋪在適合細(xì)胞生長(zhǎng)與成像的蓋玻片上，待其生長(zhǎng)過(guò)夜，細(xì)胞伸展并密度合適時(shí)，向其中加入載有EGFP-抗體片段的脂質(zhì)體，過(guò)夜培養(yǎng)，此時(shí)觀察細(xì)胞的熒光成像情況，后進(jìn)行熒光漂白，觀察該組的熒光淬滅情況。
[0034]試驗(yàn)結(jié)果
[0035]圖1為對(duì)照組熒光標(biāo)記后的細(xì)胞熒光成像圖，圖2為試驗(yàn)組熒光標(biāo)記后的細(xì)胞熒光成像圖，圖3為對(duì)照組熒光漂白后的熒光淬滅趨勢(shì)，圖4為試驗(yàn)組熒光漂白后的熒光淬滅趨勢(shì)。對(duì)比圖1和圖3可知，本發(fā)明的方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，標(biāo)記的熒光強(qiáng)度高，本發(fā)明標(biāo)記的熒光強(qiáng)度高達(dá)2000-3000au，而試驗(yàn)組只有600-700au。并且對(duì)比圖2和圖4可知，本發(fā)明的熒光標(biāo)記方法更抗漂白，漂白35min后仍有相當(dāng)高的熒光強(qiáng)度，利于長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀察。
[0036]綜上所述，本發(fā)明的方法不僅可以實(shí)現(xiàn)免疫熒光標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)蛋白的目的，而且相對(duì)于現(xiàn)有的活細(xì) 胞熒光成像方法，熒光標(biāo)記強(qiáng)度高，信噪比高，抗漂白，更利于長(zhǎng)時(shí)間追蹤，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0037]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，包括下列步驟: 將待標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體片段與熒光染料偶聯(lián)，得到熒光標(biāo)記的抗體片段；其中，所述抗體片段含有抗原結(jié)合片段； 將脂質(zhì)體與所述熒光標(biāo)記的抗體片段混合，得到可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物； 將待標(biāo)記細(xì)胞和所述可運(yùn)輸?shù)臉?biāo)記物放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22-26h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述熒光染料為: 阿托488染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述熒光染料為: 艾利克斯熒光染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述熒光染料為: 羅丹明染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述熒光染料為: 德克薩斯染料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)`胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述熒光染料為: 青色素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體為: 內(nèi)搬運(yùn)者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體為: 脂質(zhì)體2000。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為23-25h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為24h。
【文檔編號(hào)】C07K1/13GK103755778SQ201410061287
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】陳良怡, 袁天一 申請(qǐng)人:北京大學(xué)