一種i型和v型膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種I型和V型膠原蛋白的制備方法。主要技術(shù)方法如下：將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，清洗，瀝干，剪碎，烘干，粉碎后浸泡于0.1MNaOH溶液，攪拌后離心取沉淀，洗至接近中性，然后置于預(yù)冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶后攪拌，離心取上清液，加入NaCl后鹽析，離心將沉淀溶解于含NaCl的Tris-HCl緩沖液中，離心后取上清液，再加入NaCl鹽析，離心后分別收集沉淀和上清液：（1）將沉淀溶解，透析，凍干，即得I型膠原蛋白；（2）上清液中再加入NaCl后鹽析，離心后取沉淀，溶解，透析，凍干，即得V型膠原蛋白，所有操作均在4°C下進(jìn)行。本發(fā)明利用分級鹽析的方法制備I型和V型膠原蛋白，工藝簡單，可操作性強(qiáng)，成本低，效率高。
【專利說明】一種I型和V型膠原蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種I型和V型膠原蛋白的制備方法。技術(shù)背景
[0002]我國是一個漁業(yè)大國，但加工技術(shù)水平較低，大量的加工廢棄物造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。膠原蛋白可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、材料等領(lǐng)域，但近年來瘋牛病、口蹄疫、豬鏈球菌、禽流感等傳染病的頻繁暴發(fā)，使傳統(tǒng)畜禽來源膠原蛋白的安全性越來越讓人擔(dān)心；同時，宗教習(xí)俗原因也使其應(yīng)用受到一定的限制。因此，利用水產(chǎn)品加工廢棄物生產(chǎn)可以替代畜禽來源的膠原蛋白，對于減少環(huán)境污染、提高漁業(yè)效益、促進(jìn)產(chǎn)品安全具有重要意義。
[0003]至今，研究人員已經(jīng)鑒定出了至少29種膠原蛋白(1-XXIX)。I型膠原蛋白在脊椎動物體內(nèi)含量最多，廣泛分布于機(jī)體的各個組織，也是當(dāng)前各領(lǐng)域應(yīng)用最多的一種。V型膠原蛋白常常伴隨著I型膠原蛋白表達(dá)，但含量較少，具有其獨(dú)特的生理功能，如抑制表皮、內(nèi)皮、平滑肌、癌細(xì)胞的粘附和增殖，結(jié)合肝素、胰島素、骨礦化結(jié)合素、血管內(nèi)皮抑制因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等生物活性物質(zhì)，可用于醫(yī)藥、材料和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
[0004]近年來，人們從多種水產(chǎn)品加工廢棄物(皮、鱗、骨、鰭)中提取出了膠原蛋白粗品，但由于膠原蛋白分子量大，溶液粘度高，各型分子特征又高度相似，所以膠原蛋白的純化相當(dāng)困難，也少有文獻(xiàn)報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明以水產(chǎn)品加工廢棄物(魚皮)為原料，利用生物酶解和分級鹽析的方法分離純化I型和V型膠原蛋白，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、生物材料等領(lǐng)域。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:
(I)原料的預(yù)處理:
將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，用自來水清洗，浙干，剪碎(約I Cm2)，烘干，粉碎，浸泡于NaOH溶液，攪拌，離心取沉淀，用自來水沖洗后烘干。
[0007](2)膠原蛋白的提取:
將預(yù)處理過的魚皮置于預(yù)冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶，攪拌后離心取上清液，緩慢加入NaCl粉末至混合液中，鹽析過夜，再次離心，所得白色沉淀即為膠原蛋白粗品。
[0008]( 3 )膠原蛋白的純化:
將上述膠原蛋白粗品充分溶解于含有NaCl的Tris-HCl緩沖液中，離心取上清液，加入NaCl至上清液中，鹽析，再次離心，分別收集沉淀和上清液:
A.將沉淀溶解于乙酸I中，用乙酸2透析后，冷凍干燥，即得I型膠原蛋白。
[0009]B.向上清液中再次加入NaCl至混合液中，鹽析，離心取沉淀，同步驟A中I型膠原蛋白操作，溶解，透析，干燥后即得V型膠原蛋白。
[0010]其中，步驟(1)中所述烘干條件均為50-60° C ;所述粉碎至20-100目；所述粉碎后的魚皮與NaOH溶液比例為lg:50-100mL，其中NaOH溶液濃度為0.lmol/L ;所述攪拌時間為24-36h ;所述用自來水洗至pH為6-8 ;所述離心為2, 500 g離心10min0
[0011]其中，步驟(2)中所述乙酸在水中的濃度為0.1-0.5 mol/L，所述胃蛋白酶在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% ;所述攪拌時間為36-48h ;所述加入NaCl粉末的混合液中NaCl的濃度為2.0 mol/L ;所述攪拌后離心為100，000 g離心60 min,所述再次離心為100，000 g離心 15 min。
[0012]其中，步驟(3)中所述Tris-HCl緩沖液濃度為0.05 mol/L并含有1.0 mol/LNaCl，pH 7.5 ;所述加入NaCl后的上清液中NaCl濃度為2.4 mol/L ;所述離心為100，000g離心60 min,所述再次離心為100,000 g離心15 min。
[0013]其中步驟(3)第A步中所述乙酸I濃度為0.1-0.5 mol/L ;所述乙酸2濃度為0.01-0.05 mol/L，所述透析時間為 48_72h。
[0014]其中步驟(3)第B步中所述加入NaCl后的混合液中NaCl濃度為4.0 mol/L ;所述離心為100, 000 g離心15 min。
[0015]上述技術(shù)方案中，所有提取和純化操作均在4° C下進(jìn)行。
[0016]上述技術(shù)方案中所述的魚皮包括所有用于加工生魚片、魚糜制品等的淡水魚和海水魚的魚皮。
[0017]此工藝適合批量生產(chǎn)，只需按比例放大即可。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
1.我國每年大量的水產(chǎn)品加工下腳料被用于飼料或肥料，甚至作為垃圾掩埋丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。本發(fā)明以水產(chǎn)品加工廢棄物(皮)為原料生產(chǎn)可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、生物材料等領(lǐng)域的膠原蛋白，既延伸產(chǎn)業(yè)鏈，提高產(chǎn)品附加值，又減少環(huán)境污染，增加經(jīng)濟(jì)和社會效益。
[0019]2.膠原蛋白在機(jī)體內(nèi)以膠原纖維的形式存在，具有較高的穩(wěn)定性。傳統(tǒng)膠原蛋白的提取大多采用鹽、酸、堿、熱水等方法，存在提取效率較低，環(huán)境污染大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。本發(fā)明利用限制酶解的方法提取膠原蛋白，不僅無環(huán)境污染，提取效率高，而且所得產(chǎn)品具有良好的生物學(xué)特性。
[0020]3.膠原蛋白分子量大，溶液粘度高，各型分子特征又高度相似，所以各型膠原蛋白的純化相當(dāng)困難。目前膠原蛋白的純化大多采用多級柱層析的方法，但流程復(fù)雜，效率低，成本高，并且難以產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明利用分級鹽析的方法純化出了I型和V型膠原蛋白，工藝簡單，操作性強(qiáng)，成本低，效率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:魚皮I型和V型膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜。泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:V型膠原蛋白；泳道3:1型膠原蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0022]結(jié)合以下實(shí)例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明:
實(shí)施例1:
將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，自來水清洗，浙干，剪碎(約I Cm2)，烘干(55° C)，粉碎(50目)，稱取200 g室溫浸泡于15 L 0.1 mol/L NaOH溶液中，連續(xù)攪拌30 h，離心(2，500g X 10 min)取沉淀，用自來水洗至pH為7.0，烘干(55° C)。
[0023]取100 g (以干基計(jì))預(yù)處理過的魚皮置于10 L預(yù)冷水中，加入150 mL冰乙酸和10 g胃蛋白酶，連續(xù)攪拌42 h后，離心(100，000 g X 60 min)后取上清，緩慢加入1.25Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L,鹽析過夜,離心(10，000 g X 15 min),所得沉淀即為膠原蛋白粗品。
[0024]將膠原蛋白粗品溶解于7.5 L 1.0 mol/L NaCl (0.05 mol/L Tris_HCl，pH 7.5)溶液中(用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5),離心(100，000 g X 60 min)取上清液,緩慢加入0.68 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，鹽析過夜，再次離心(100，000 g X 15 min)，分別
收集沉淀和上清液:
(1)將沉淀溶解于約5L預(yù)冷的0.25 mol/L乙酸中，裝入截留分子量為10 kDa的透析袋，對大量0.025 mol/L乙酸透析60 h脫鹽，真空冷凍干燥，所得無臭無味白色海綿狀固體即為I型膠原蛋白(約92.4 g)；
(2)向上清液中再次緩慢加入0.83Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，鹽析過夜，離心(100, 000 g X 15 min)后取沉淀，同I型膠原蛋白溶解,透析,干燥,所得無臭無味白色海綿狀固體即為V型膠原蛋白(約2.1 g)。
[0025]實(shí)施例2:
將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，自來水清洗，浙干，剪碎(約I cm2)，烘干(50° C)，粉碎(20目)，稱取200 g室溫浸泡于10 L 0.1 mol/L NaOH溶液中，連續(xù)攪拌36 h，離心(2，500g X 10 min)取沉淀，用自來水洗至pH為6.0，烘干(50° C)。
`[0026]取100 g (以干基計(jì))預(yù)處理過的魚皮置于7.5 L預(yù)冷水中，加入45 mL冰乙酸和7.5 g胃蛋白酶，連續(xù)攪拌48 h后，離心(100，000 g X 60 min)后取上清，緩慢加入1.0Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L,鹽析過夜,離心(10，000 g X 15 min),所得沉淀即為膠原蛋白粗品。
[0027]將膠原蛋白粗品溶解于5 L 1.0 mol/L NaCl (0.05 mol/L Tris_HCl，pH 7.5)溶液中(用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5),離心(100，000 g X 60 min)取上清液,緩慢加入0.45 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，鹽析過夜，再次離心(100，000 g X 15 min)，分別收
集沉淀和上清液:
(1)將沉淀溶解于約5L預(yù)冷的0.1 mol/L乙酸中，裝入截留分子量為30 kDa的透析袋，對大量0.01 mol/L乙酸透析48 h脫鹽，真空冷凍干燥，所得無臭無味白色海綿狀固體即為I型膠原蛋白(約90.8 g)；
(2)向上清液中再次緩慢加入0.55Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，鹽析過夜，離心(100, 000 g X 15 min)后取沉淀，同I型膠原蛋白溶解,透析,干燥,所得無臭無味白色海綿狀固體即為V型膠原蛋白(約2.0 g)。
[0028]實(shí)施例3:
將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，自來水清洗，浙干，剪碎(約I cm2)，烘干(60° C)，粉碎(100目)，稱取200 g室溫浸泡于20 L 0.1 mol/L NaOH溶液中，連續(xù)攪拌24 h，離心(2，500g X 10 min)取沉淀，用自來水洗至pH為8.0，烘干(60° C)。取100 g (以干基計(jì))預(yù)處理過的魚皮置于15 L預(yù)冷水中，加入450 mL冰乙酸和15 g胃蛋白酶，連續(xù)攪拌36 h后，離心(100，OOO g X 60 min)后取上清，緩慢加入1.85 Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L，鹽析過夜,離心(10，000 g X 15 min),所得沉淀即為膠原蛋白粗品。
[0029]將膠原蛋白粗品溶解于10 L 1.0 mol/L NaCl (0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.5)溶液中(用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5),離心(100，000 g X 60 min)取上清液,緩慢加入0.9 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，鹽析過夜，再次離心(100，000 g X 15 min)，分別收
集沉淀和上清液:
(1)將沉淀溶解于約5L預(yù)冷的0.5 mol/L乙酸中，裝入截留分子量為30 kDa的透析袋，對大量0.05 mol/L乙酸透析72 h脫鹽，真空冷凍干燥，所得無臭無味白色海綿狀固體即為I型膠原蛋白(約92.0 g)；
(2)向上清液中再次緩慢加入1.1 Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，鹽析過夜，離心(100，000g X 15 min)后取沉淀，同I型膠原蛋白溶解，透析，干燥，所得無臭無味白色海綿狀固體即為V型膠原蛋白(約2.1 g)。
[0030]實(shí)例1、2、3的所有提取和純化操作均在4° C下進(jìn)行。所制備的I型和V型膠原蛋白可通過SDS-PAGE圖譜鑒定其純度(見附圖)，從圖中可以看出，I型膠原蛋白至少含有a Al)、α2(Ι)兩條α鏈及其二聚體β鏈和三聚體Y鏈；V型膠原蛋白至少含有a i (V)、a2(V)、Q3(V)三條α鏈。若達(dá)不到應(yīng)用要求，可將其再次溶解于預(yù)冷的0.5 mol/L乙酸(1:100,w/v)中，高速離心(100，000 g X 60 min)后重復(fù)上述“膠原蛋白的純化”步驟,可顯著提高I型和V型膠原 蛋白的純度。
【權(quán)利要求】
1.一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行: (1)原料的預(yù)處理: 將去除魚鱗及皮下組織的魚皮，用自來水清洗，浙干，剪碎，烘干，粉碎，浸泡于NaOH溶液，攪拌，離心取沉淀，用自來水沖洗后烘干； (2)父原蛋白的提取: 將預(yù)處理過的魚皮置于預(yù)冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶，攪拌后離心取上清液，緩慢加入NaCl粉末至混合液中，鹽析過夜，再次離心，所得白色沉淀即為膠原蛋白粗品； (3)膠原蛋白的純化: 將上述膠原蛋白粗品充分溶解于含有NaCl的Tris-HCl緩沖液中，離心取上清液，加入NaCl至上清液中，鹽析，再次離心，分別收集沉淀和上清液: A.將沉淀溶解于乙酸I中，用乙酸2透析后，冷凍干燥，即得I型膠原蛋白； B.向上清液中再次加入NaCl至混合液中，鹽析，離心取沉淀，同步驟A中I型膠原蛋白操作，溶解，透析，干燥后即得V型膠原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述烘干條件均為50-60° C ;所述粉碎至20-100目；所述粉碎后的魚皮與NaOH溶液比例為lg:50-100mL，其中NaOH溶液濃度為0.lmol/L ;所述攪拌時間為24-36 h ;所述用自來水洗至pH為6-8 ;所述離心為2, 500g離心10min0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述乙酸在水中的濃度為0.1-0.5 mol/L，所述胃蛋白酶在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% ;所述攪拌時間為36-48h ;所述加入NaCl粉末的混合液中NaCl的濃度為2.0 mol/L ;所述攪拌后離心為100，OOOg離心60min,所述再次離心為100，OOOg離心15 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述Tris-HCl緩沖液濃度為0.05 mol/L并含有1.0 mol/L NaCl,pH 7.5 ;所述加入NaCl后的上清液中NaCl的濃度為2.4mol/L ;所述離心為100，OOOg離心60min，所述再次離心為100, OOOg 離心 15 min ； 其中步驟(3)第A步中所述乙酸I濃度為0.1-0.5mol/L ;所述乙酸2濃度為0.01-0.05mol/L，所述透析時間為48-72h ； 其中步驟(3)第B步中所述加入NaCl后的混合液中NaCl濃度為4.0moI/L ;所述離心為 100,000 g 離心 15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，上述技術(shù)方案中，所有提取和純化操作均在4° C下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種I型和V型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，上述技術(shù)方案中所述的魚皮包括所有用于加工生魚片、魚糜制品的淡水魚和海水魚的魚皮。
【文檔編號】C07K1/36GK103882082SQ201410064575
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】王林, 梁秋芳, 徐軍民, 王振斌, 馬海樂 申請人:江蘇大學(xué)