容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】提供了給予分離容易性的雙特異性抗體形式，其包含有在CH3結(jié)構(gòu)域中經(jīng)差別修飾的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述差別修飾就CH3修飾而言是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，并且所述修飾中的至少一個(gè)導(dǎo)致所述雙特異性抗體對(duì)于親和試劑例如A蛋白的差別親和力，并且所述雙特異性抗體能夠基于其對(duì)于A蛋白的親和力而從破裂的細(xì)胞中、從培養(yǎng)基中或從抗體混合物中分離。
【專利說明】容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01080032565.8、申請(qǐng)日為2010年6月25日、發(fā)明名稱為“容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)為國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT / US2010 / 040028的國家階段申請(qǐng)，該國際申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2009年6月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?1 / 220，687的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及具有重鏈異源二聚體(即相差至少一個(gè)氨基酸的兩個(gè)免疫球蛋白重鏈)的抗原結(jié)合蛋白或抗體，其允許基于免疫球蛋白重鏈和經(jīng)修飾或經(jīng)突變的免疫球蛋白重鏈對(duì)于親和試劑的差別親和力來進(jìn)行該抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的分離。本發(fā)明還涉及抗原結(jié)合蛋白(包括雙特異性抗體)，其具有有著不同的關(guān)于A蛋白的親和力的IgG CH2和CH3區(qū)，這允許通過所述IgG區(qū)對(duì)于A蛋白的差別結(jié)合來進(jìn)行快速分離。[0003]背景
[0004]抗體是多功能分子，其攜帶有獨(dú)特的對(duì)于靶抗原的結(jié)合特異性以及通過不依賴于抗原的機(jī)制與免疫系統(tǒng)相互作用的能力。許多目前所使用的用于癌癥的生物學(xué)治療劑是針對(duì)通常在所靶向的癌細(xì)胞上過表達(dá)的抗原的單克隆抗體。當(dāng)此類抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞時(shí)，它們可以觸發(fā)依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。不幸地，癌性細(xì)胞經(jīng)常發(fā)展出抑制這些正常免疫應(yīng)答的機(jī)制。
[0005]近年來，已經(jīng)進(jìn)行了努力以開發(fā)出具有超過一種抗原結(jié)合特異性的抗體樣治療劑，例如雙特異性抗體。在癌癥療法的情況下，多特異性形式可以允許這樣的可能性，即使用例如，一種特異性來將該分子靶向腫瘤細(xì)胞抗原，和另一種特異性來觸發(fā)通常對(duì)于免疫系統(tǒng)不可用的應(yīng)答。雙特異性抗體也可以用作雙組分異源二聚受體系統(tǒng)的替代配體，所述雙組分異源二聚受體系統(tǒng)通常在當(dāng)其天然配體與該兩個(gè)組分結(jié)合并將該兩個(gè)組分帶到一起時(shí)而被其天然配體激活。
[0006]在本領(lǐng)域中已開發(fā)了許多形式以處理由具有多種結(jié)合特異性的分子所提供的治療機(jī)會(huì)。理想地，此類分子應(yīng)當(dāng)是表現(xiàn)良好的蛋白質(zhì)，其易于生產(chǎn)和純化，并且具有有利的體內(nèi)特性，例如，適合于所希望的目的的藥物動(dòng)力學(xué)，最小的免疫原性，和如果希望，常規(guī)抗體的效應(yīng)子功能。
[0007]產(chǎn)生雙特異性抗體的最直接的方式(在單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩種不同的抗體)引起多個(gè)種類，因?yàn)楦髯缘闹劓溞纬赏炊垠w和異源二聚體，但是只有異源二聚體是所希望的。此外，輕鏈和重鏈可能不適當(dāng)?shù)嘏鋵?duì)。下面描述了試圖以不同的方式解決這些問題的形式的幾個(gè)實(shí)例。
[0008]用于雙特異性T細(xì)胞募召劑(Bispecific T cell Engager, BiTE)分子的一種形式(參見例如，Wolf, E.等人，(2005) Drug Discovery TodaylO: 1237-1244)基于單鏈可變區(qū)片段(scFv)模塊。scFv由通過柔性連接體相融合的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)構(gòu)成，這樣的輕鏈和重鏈可變區(qū)通常可以合適地折疊從而這些區(qū)域可以結(jié)合關(guān)聯(lián)抗原AiTE將兩個(gè)具有不同特異性的scFv串聯(lián)連接在單鏈上(參見圖1A)。這種構(gòu)造排除了具有兩個(gè)拷貝的相同重鏈可變區(qū)的分子的產(chǎn)生。此外，設(shè)計(jì)連接體構(gòu)造以確保各自輕鏈和重鏈的正確配對(duì)。
[0009]BiTE形式具有幾個(gè)缺點(diǎn)。首先，scFv分子在其聚集傾向方面是眾人皆知的。并且，盡管據(jù)說scFv連接體的免疫原性低，但不能排除產(chǎn)生針對(duì)BiTE的抗體的可能性。BiTE形式中Fe部分的不存在也使得其血清半壽期非常短，并且這不得不要求頻繁的重復(fù)施用或通過泵的連續(xù)輸注這樣的復(fù)雜化。最后，F(xiàn)e的不存在也意味著由Fe介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的缺失，所述由Fe介導(dǎo)的效應(yīng)子功能在某些情況下可能是有益的。
[0010]第二種形式(圖1B)為小鼠和大鼠單克隆抗體的雜合體，并且依賴于常規(guī)的A蛋白親和層析的改進(jìn)(參見例如，Lindhofer, H.等人，(1995) J.1mmunol.155:219-225)。在該形式中，在同一細(xì)胞中(例如，要么作為兩個(gè)雜交瘤的四源雜交瘤(quadroma)融合物，要么在經(jīng)改造的CHO細(xì)胞中)一起產(chǎn)生小鼠IgG2a和大鼠IgG2b抗體。由于每個(gè)抗體的輕鏈優(yōu)先地與其關(guān)聯(lián)種類的重鏈相聯(lián)合，因此僅可以裝配出三種不同的抗體種類:兩種親本抗體，以及通過其Fe部分相聯(lián)合的各包含一個(gè)重鏈/輕鏈對(duì)的兩個(gè)抗體的異源二聚體。所希望的異源二聚體可以容易地從該混合物中純化出來，因?yàn)槠渑cA蛋白的結(jié)合特性不同于親本抗體的結(jié)合特性:大鼠IgG2b不與A蛋白結(jié)合，而小鼠IgG2a結(jié)合。因此，該小鼠-大鼠異源二聚體與A蛋白結(jié)合，但在比小鼠IgG2a同源二聚體高的pH處洗脫出來，并且這使得可能選擇性地純化該雙特異性異源二聚體。與使用BiTE形式一樣，這種雜合體形式具有兩個(gè)單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)。 [0011]所述小鼠/大鼠雜合體的缺點(diǎn)在于:由于它是非人的，因而它可能在患者中引起免疫應(yīng)答，這可能具有有害的副作用(例如，“HAMA”或“HARA”反應(yīng))，和/或中和該治療劑。
[0012]被稱為“杵-臼(knobs-1nto-holes) ”的第三種形式(圖1C)已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了討論，其被認(rèn)為潛在地可用于產(chǎn)生雙特異性抗體(US專利號(hào)7，183，076)。在該策略中，將兩個(gè)抗體的Fe部分進(jìn)行改造以給予一個(gè)抗體以凸出的“杵”，和給予另一個(gè)抗體以互補(bǔ)的“臼”。當(dāng)在同一細(xì)胞中生產(chǎn)時(shí)，據(jù)稱重鏈優(yōu)先地通過經(jīng)改造的“杵”與經(jīng)改造的“臼”的聯(lián)合而形成異源二聚體而不是同源二聚體。正確的輕鏈-重鏈配對(duì)的問題通過選擇具有不同特異性但是采用相同輕鏈的抗體而得到解決。
[0013]這種形式的缺點(diǎn)在于，“杵-臼”策略可以導(dǎo)致大量不希望的同源二聚體的產(chǎn)生，因而不得不需要進(jìn)一步的純化步驟。這種困難通過下述事實(shí)而加重:污染性種類在許多其特性方面與所希望的種類幾乎相同。所述經(jīng)改造的形式還可能是潛在地免疫原性的，因?yàn)楫a(chǎn)生“杵”和“臼”的突變引入了外源序列。
[0014]仍然存在有對(duì)于使上面所提及的某些或所有缺點(diǎn)最小化的雙特異性抗體形式的需要，特別是對(duì)于治療應(yīng)用。
[0015]附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1圖解說明了三種雙特異性抗體形式:(A)雙特異性T細(xì)胞募召劑(BiTE) ； (B)小鼠-大鼠雜合體；和(C)具有共同輕鏈的杵-臼。
[0017]圖2 圖解說明了 Fe Λ Adp 修飾:(A)人 IgGl (SEQ ID NO: I)和 IgG3 (SEQ ID NO:3)的Fe區(qū)的比對(duì),顯示了加框的FcAAdp修飾；(B) Fe AAdp雙特異性抗體的示意性表示。
[0018]圖3圖解說明了 IgGl、IgG2和IgG4(有和沒有AAdp 二肽修飾)以及IgG3的人CH3結(jié)構(gòu)域的比對(duì)(采用MGT外顯子編號(hào)和EU編號(hào))。[0019]圖4顯示了關(guān)于雙特異性抗體的分離的A蛋白柱描記圖，顯示了使用階梯式梯度的洗脫譜。
[0020]圖5顯示了來自層析分離的經(jīng)洗脫的柱級(jí)分(在圖4中所顯示的)的IL4_Ra和IL-6Ra BIAC0RE?結(jié)合譜。用固定化的抗-Fe抗體來捕獲級(jí)分中的抗體，然后就與所捕獲的抗體的結(jié)合來對(duì)可溶性IL_4Ra或IL-6Ra進(jìn)行檢定。
[0021]圖6顯示了 FcAAdp雙特異性抗體(IL-6RA / IL-4R)、Fe AAdp同源二聚體(IL-6RA / IL-6RA)、具有野生型CH3序列的IgGl抗體(IL-4R / IL-4R)和對(duì)照單特異性抗體的藥物動(dòng)力學(xué)譜。
[0022]圖7圖解說明了在Raii細(xì)胞殺傷測(cè)定法中⑶20x⑶3 Δ Adp雙特異性抗體的效力。
[0023]圖8圖解說明了使用⑶20x⑶3 AAdp雙特異性抗體的旁觀細(xì)胞(293)殺傷測(cè)定法。
[0024]圖9顯示了使用不同mFc異源二聚體的表達(dá)試驗(yàn)的結(jié)果。圖版A:異源二聚mIgG2a / mIgG2aPTTTK 與同源二聚 mIgG2a 和同源二聚 IgG2aPTTTK 的 pH 分離的 Western印跡；圖版B:異源二聚mIgG2a / mIgG2aTTTK與同源二聚mIgG2a和同源二聚IgG2aTTTK的pH分離的Western印跡；IP=輸入；FT=流過(flow through) ;W2=第二次洗漆(lx PBSpH7.2) ;E1=第一次洗脫(20mM檸檬酸鈉，IM NaCl pH5.5) ;E2=第二次洗脫(20mM檸檬酸鈉，IM NaCl ；57% ρΗ5.5+43% ρΗ2.6) ;Ε3=第三次洗脫(20mM檸檬酸鈉，IM NaCl ρΗ2.6)。
[0025]圖10圖解說明了相對(duì)于混合的同種型(例如，mIgG2a和mlgGl)的異源二聚體的形成而言突變型IgG2a的異源二聚體的優(yōu)先形成，其中使用4:1的IFNARl構(gòu)建體:IFNAR2構(gòu)建體比例。
`[0026]泳道1:1FNARl_IgG2a:1FNAR2_IgGl ；
[0027]泳道2:INFARl-1gG2a:1FNAR2_IgG2aTTT ；
[0028]泳道3:IFNARl-1gG2a:1FNAR2_IgG2aTTTK ；
[0029]泳道4:IFNARl-1gG2a:1FNAR2_IgG2aPTTTK ；
[0030]泳道5:IFNARl-1gG2a:1FNAR2_IgG2aRF。
[0031]概述
[0032]本發(fā)明至少部分地基于在雙特異性抗原結(jié)合蛋白中采用兩個(gè)相差至少一個(gè)氨基酸的免疫球蛋白CH3重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列。所述至少一個(gè)氨基酸的差異導(dǎo)致經(jīng)改善的分離該蛋白質(zhì)的能力，因?yàn)樵摬町悓?dǎo)致有差別的所述CH3結(jié)構(gòu)域序列結(jié)合親和試劑的能力。
[0033]在一個(gè)方面，提供了抗原結(jié)合蛋白，其包含第一和第二多肽，所述第一多肽從N-末端至C-末端包含選擇性地結(jié)合第一抗原的第一抗原結(jié)合區(qū)，隨后為包含第一 CH3區(qū)的恒定區(qū)，該第一 CH3 區(qū)為選自 IgGl (SEQ ID NO:1)、IgG2 (SEQ ID NO:3)、IgG4 (SEQ ID NO:5)及其組合的人IgG的CH3區(qū)；并且，所述第二多肽從N-末端至C-末端包含選擇性地結(jié)合第二抗原的第二抗原結(jié)合區(qū)，隨后為包含第二 CH3區(qū)的恒定區(qū)，該第二 CH3區(qū)為選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人IgG的CH3區(qū)，其中所述第二 CH3區(qū)包含減少或消除該第二 CH3結(jié)構(gòu)域與A蛋白的結(jié)合的修飾。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)包含95R修飾(根據(jù)MGT外顯子編號(hào)；435R，根據(jù)EU編號(hào))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)還包含96F修飾(MGT ;436F，根據(jù)EU)。在特別的實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgGl (SEQ ID N0:2)，并且還包含選自 D16E、L18M、N44S、K52N、V57M 和 V82I (IMGT ;D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I，根據(jù)EU)的修飾。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgG2 (SEQ ID N0:4)，并且還包含選自 N44S、K52N 和 V82I(MGT ;N384S、K392N 和 V422I，根據(jù) EU)的修飾。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgG4 (SEQ ID N0:6)，并且還包含選自 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (IMGT ;Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I，根據(jù) EU)的修飾。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CH3結(jié)構(gòu)域是嵌合的結(jié)構(gòu)域，其包含人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4之中兩個(gè)或更多個(gè)的序列。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CH3結(jié)構(gòu)域來自人IgGl、人IgG2或人IgG4，并且所述抗原結(jié)合蛋白還包含CHl結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，其中所述CHl結(jié)構(gòu)域和所述CH2結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自人IgGlCHl或CH2結(jié)構(gòu)域，人IgG2CHl或CH2結(jié)構(gòu)域，或者嵌合的人/人IgGl / IgG2或嵌合的人/人IgGl / IgG3或嵌合的人/人IgG2 / IgG3結(jié)構(gòu)域或嵌合的人/人IgGl /IgG4或嵌合的IgG3 / IgG4或嵌合的IgG2 / IgG4結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述嵌合的 IgGl / IgG2、IgGl / IgG3、IgG2 / IgG3、IgGl / IgG4、IgG3 / IgG4 和 IgG2 /IgG4結(jié)構(gòu)域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白還包含免疫球蛋白輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白輕鏈選自人λ和人K輕鏈。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二抗原結(jié)合區(qū)各包含至少一個(gè)⑶R，在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)CDR，在另一個(gè)實(shí)`施方案中，各包含三個(gè)CDR。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述CDR來自免疫球蛋白重鏈。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述重鏈為人重鏈。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一抗原結(jié)合區(qū)包含第一免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且所述第二抗原結(jié)合區(qū)包含第二免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、猿和人的結(jié)構(gòu)域。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地包含人⑶R、小鼠⑶R、大鼠⑶R、兔⑶R、猴⑶R、猿⑶R和人源化的⑶R。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR是人的，并且是經(jīng)體細(xì)胞突變的。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含人構(gòu)架區(qū)(FR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人FR是經(jīng)體細(xì)胞突變的人FR。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過就對(duì)于目的抗原的反應(yīng)性來篩選包含抗體可變區(qū)的噬菌體文庫而獲得所述第一和/或第二抗原結(jié)合區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過用目的抗原免疫接種非人動(dòng)物例如小鼠、大鼠、兔、猴或猿并且鑒定編碼對(duì)于目的抗原特異性的可變區(qū)的抗體可變區(qū)核酸序列來獲得所述第一和/或第二抗原結(jié)合區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物包含一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白可變區(qū)基因。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白可變區(qū)基因以染色體外的形式，作為在內(nèi)源性免疫球蛋白基因座處的替換，或者作為隨機(jī)整合入該非人動(dòng)物的基因組中的轉(zhuǎn)基因而存在于所述非人動(dòng)物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和/或第二抗原結(jié)合區(qū)從雜交瘤或四源雜交瘤獲得，在另一個(gè)實(shí)施方案中，從使用細(xì)胞分選來篩選經(jīng)免疫接種的非人動(dòng)物的免疫細(xì)胞而獲得。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白為雙特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是完全人的雙特異性抗體并且具有獨(dú)立地在μ Μ、ηΜ或ρΜ范圍內(nèi)的對(duì)于每個(gè)表位的親和力。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白缺乏非天然的人T-細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CH3區(qū)的修飾在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述CH3區(qū)的修飾不導(dǎo)致非天然的人T-細(xì)胞表位。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白包含重鏈，其中所述重鏈在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈具有不包含非天然的T細(xì)胞表位的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列的蛋白水解不能形成在人中具有免疫原性的大約9個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述人為用所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)行治療的人。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列的蛋白水解不能形成在人中具有免疫原性的大約13至大約17個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述人為用所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)行治療的人。
[0050]在一個(gè)方面，提供了包含如在本文中所描述的CH2和/或CH3修飾的雙特異性結(jié)合蛋白，其中所述雙特異性結(jié)合蛋白包含特異性地識(shí)別B細(xì)胞上的抗原的第一結(jié)合部分，和特異性地識(shí)別T細(xì)胞上的抗原的第二結(jié)合部分。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白為雙特異性抗體。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含人IgGl重鏈和人IgGl AAdp重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合部分為特異性地識(shí)別CD20的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二結(jié)合部分為特異性地識(shí)別CD3的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體在Raji殺傷測(cè)定法中展示出大約2.8-3.2Χ 10_12Μ或大約2.8-3.0XlO^12M的EC50，并且在旁觀細(xì)胞殺傷測(cè)定法中展示出不大于大約1-10%或1-5%的旁觀細(xì)胞殺傷,其中所述旁觀細(xì)胞不包含CD20表位。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述旁觀細(xì)胞為293細(xì)胞。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，在大約10_8Μ至大約10_14Μ的雙特異性抗體濃度范圍內(nèi)，測(cè)量在該測(cè)定法中的旁觀細(xì)胞殺傷。
[0052]在一個(gè)方面，提供了制備雙特異性抗體的方法，其包括:獲得核酸序列，其編碼包含識(shí)別第一表位的第一可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恒定結(jié)構(gòu)域，或者它們的嵌合的同種型恒定結(jié)構(gòu)域；獲得第二核酸序列，其編碼包含識(shí)別第二表位的第二可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第二免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恒定結(jié)構(gòu)域，或者它們的嵌合的同種型恒定結(jié)構(gòu)域，所述IgGl、IgG2或IgG4同種型恒定結(jié)構(gòu)域或者它們的嵌合的同種型恒定結(jié)構(gòu)域在其CH3結(jié)構(gòu)域中包含根除或減少與A蛋白的結(jié)合的修飾；獲得第三核酸序列，其編碼與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈相配對(duì)的免疫球蛋白輕鏈；將所述第一、第二和第三核酸序列引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中；允許所述細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白；和，使用A蛋白來分離所述免疫球蛋白。[0053]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和表達(dá)病毒核酸序列的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，PERC.6?細(xì)胞)。
[0054]在一個(gè)方面，提供了雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含結(jié)合抗原的第一特異性和激活受體的第二特異性，其中所述雙特異性抗原結(jié)合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含含有A蛋白結(jié)合決定子的第一 IgGl、IgG2或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域，并且所述第二多肽包含缺乏A蛋白結(jié)合決定子的第二 IgGl、IgG3或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域。
[0055]在一個(gè)實(shí)施方案中，激活受體的所述第二特異性以在M、mM、口]?、11]\1或？]\1范圍內(nèi)的Kd結(jié)合所述受體。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二特異性結(jié)合選自G蛋白偶聯(lián)受體、受體酪氨酸激酶、整聯(lián)蛋白和Toll-樣受體的受體。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二特異性與所述受體接觸，并且引起該受體或亞基或蛋白質(zhì)與其物理地相聯(lián)合從而進(jìn)行絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的磷酸化；引起核苷酸的環(huán)化(例如，cAMP、cADP或cGMP);引起磷脂酰肌醇或其衍生物(例如，IP3或PIP3)的產(chǎn)生；弓丨起脂質(zhì)第二信使(例如，二酰甘油、神經(jīng)酰胺、溶血磷脂酸、類二十烷酸)的產(chǎn)生；引起去磷酸化(例如，磷酸酶活性)；引起脂質(zhì)的磷酸化從而形成第二信使；引起第二信使的水解；引起蛋白水解；引起氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)；引起蛋白質(zhì)向細(xì)胞器(例如，向細(xì)胞核)的轉(zhuǎn)運(yùn)；引起所述受體(與自身)聚集從而形成同源多聚體，或(與其他受體)聚集從而形成異源多聚體；或者引起跨膜通道的打開或關(guān)閉。
[0058]在一個(gè)方面，提供了制備雙特異性抗體的方法，其包括:從四源雜交瘤中分離目的雙特異性抗體，其中所述目的雙特異性抗體包含第一重鏈、第二重鏈，所述第一重鏈為IgGU IgG2或IgG4同種型，和所述第二重鏈為具有這樣的恒定結(jié)構(gòu)域的IgGl、IgG2或IgG4同種型，所述恒定結(jié)構(gòu)域在其CH3結(jié)構(gòu)域中包含根除或減少與A蛋白的結(jié)合的修飾，其中使用A蛋白來分離所述目的雙特異性抗體。
[0059]在一個(gè)方面，提供了制備雙特異性抗體的方法，其包括從破裂的細(xì)胞或抗體混合物中分離具有經(jīng)差別修飾的IgGl、IgG2或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體的步驟，其中所述經(jīng)差別修飾的CH3結(jié)構(gòu)域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，并且其中所述修飾導(dǎo)致具有異源二聚重鏈的雙特異性抗體，所述異源二聚重鏈的單體具有對(duì)于A蛋白的差別親和力，并且使用A蛋白從所述破裂的細(xì)胞或混合物中分離所述雙特異性抗體。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用A蛋白親和支持物來分離所述雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體在大約3.9至大約4.4，大約4.0至大約4.3，大約4.1至大約4.2的pH處，或者在大約PH4.2處洗脫下來。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體在大約4、4.1,4.2、
4.3,4.4或4.5的pH處洗脫下來。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用A蛋白親和支持物和pH梯度或階梯來分離所述雙特異性抗體，其中所述PH梯度或階梯包含離子改性劑。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑以大約0.5至大約1.0M的濃度存在。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑為鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子改性劑選自乙酸的鈹、鋰、鈉和鉀鹽；碳酸氫鈉和碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫和氯化鎂；氟化鈉和氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸鈣；磷酸鈉和磷酸鉀；以及硫酸鈣和硫酸鎂。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑為堿金屬或堿土金屬的鹵化物鹽。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑為氯化鈉。
[0062]在一個(gè)方面，結(jié)合蛋白包含F(xiàn)e，其中所述Fe包含如本文所描述的那樣進(jìn)行修飾的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和未修飾的第二 CH3，從而形成異源二聚Fe，其中該差別修飾導(dǎo)致所述結(jié)合蛋白在比缺乏差別修飾的相應(yīng)結(jié)合蛋白高0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.2、1.3或1.4個(gè)pH單位處從A蛋白親和材料上洗脫下來。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)差別修飾的結(jié)合蛋白在大約4.2的pH處洗脫下來，而未修飾的結(jié)合蛋白在大約3的pH處洗脫下來。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)差別修飾的結(jié)合蛋白在大約4.5的pH處洗脫下來，而未修飾的結(jié)合蛋白在大約3.5的pH處洗脫下來。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)差別修飾的結(jié)合蛋白在大約4的pH處洗脫下來，而未修飾的結(jié)合蛋白在大約
2.8-3.5,2.8-3.2或2.8-3的pH處洗脫下來。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)差別修飾的結(jié)合蛋白在大約4.2的pH處洗脫下來，而未修飾的結(jié)合蛋白在大約2.8的pH處洗脫下來。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)差別修飾的結(jié)合蛋白在大約4.4的pH處洗脫下來，而未修飾的結(jié)合蛋白在大約3.6的pH處洗脫下來。在這些實(shí)施方案中，“未修飾的”是指在所述CH3結(jié)構(gòu)域兩者上都缺乏在435 (EU編號(hào))處的修飾，或缺乏在435和436 (EU編號(hào))處的修飾。
[0064]在本文中所描述的實(shí)施方案和方面中的任一個(gè)可以彼此結(jié)合使用，除非另外指明或從上下文中顯而易見。從對(duì)于隨后的描述所進(jìn)行的研究中，其他實(shí)施方案將會(huì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說變得顯而易見。
[0065]詳細(xì)描述
[0066]本發(fā)明不限于所描述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@樣的方法和條件可以變動(dòng)。也要理解，本文中所使用的術(shù)語僅是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而并不旨在是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍由權(quán)利要求書來定義。
`[0067]除非另外定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的那樣相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與在本文中所描述的那些相似或等價(jià)的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述特定的方法和材料。所有述及的出版物特此通過提及而合并。
[0068]在本文中所使用的術(shù)語“抗體”包括由四條多肽鏈(通過二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)(稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR))，其點(diǎn)綴有更為保守的區(qū)域(稱為構(gòu)架區(qū)(FR))。每個(gè)VH和VL由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，所述三個(gè)⑶R和四個(gè)FR從氨基末端至羧基末端以下述順序布置:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鏈CDR可以縮寫為HCDR1、HCDR2和HCDR3 ;輕鏈CDR可以縮寫為L(zhǎng)CDR1、LCDR2和LCDR3)。術(shù)語“高親和力”抗體是指具有至少10_9M，至少KTkiM,至少10_nM，或至少10_12M(如通過表面等離子共振(例如BIAC0RE?)或溶液親和ELISA所測(cè)量的)的與其靶的結(jié)合親和力的那些抗體。
[0069]短語“抗原結(jié)合蛋白”包括這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)⑶R并且能夠選擇性地識(shí)別抗原，即能夠以至少在μΜ范圍內(nèi)的Kd結(jié)合抗原。治療性抗原結(jié)合蛋白(例如，治療性抗體)常常要求位于ηΜ或ρΜ范圍內(nèi)的KD?！翱乖Y(jié)合蛋白”還包括這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含如本文中所描述的第一和第二 CH3結(jié)構(gòu)域以及第一蛋白或配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域和第二蛋白或配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域，其中所述第一蛋白或配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域和所述第二蛋白或配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域每個(gè)獨(dú)立地識(shí)別相同的蛋白或配體，或一起識(shí)別相同的蛋白或配體，或者每個(gè)獨(dú)立地識(shí)別不同的蛋白或配體。此類蛋白質(zhì)的一個(gè)實(shí)例是免疫粘附素，其包含融合蛋白(異源或同源)二聚體，其中該二聚體的多肽為包含受體組分或配體組分的融合多肽，其中所述配體組分包含結(jié)合受體的氨基酸序列。
[0070]短語“雙特異性抗體”包括能夠選擇性地結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)表位的抗體。雙特異性抗體通常包含兩條不同的重鏈，每條重鏈特異性地結(jié)合不同的表位一要么在兩個(gè)不同的分子(例如，抗原)上，要么在同一個(gè)分子(例如，同一個(gè)抗原)上。如果雙特異性抗體能夠選擇性地結(jié)合兩個(gè)不同的表位(第一表位和第二表位)，那么第一重鏈對(duì)于第一表位的親和力通常將會(huì)比第一重鏈對(duì)于第二表位的親和力低至少一個(gè)或兩個(gè)或三個(gè)或四個(gè)數(shù)量級(jí)，反之亦然。被雙特異性抗體所識(shí)別的表位可以在相同的或不同的靶上(例如，在相同或不同的蛋白質(zhì)上)。可以例如通過將識(shí)別相同抗原的不同表位的重鏈相組合來制備雙特異性抗體。例如，可以將編碼識(shí)別相同抗原的不同表位的重鏈可變序列的核酸序列與編碼不同重鏈恒定區(qū)的核酸序列相融合，并且可以在表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的細(xì)胞中表達(dá)這樣的序列。典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，每條重鏈具有三個(gè)重鏈⑶R，隨后為(N-末端至C-末端)CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域；以及免疫球蛋白輕鏈，其要么不賦予抗原結(jié)合特異性但可以與每條重鏈相聯(lián)合，要么可以與每條重鏈相聯(lián)合并且可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)被重鏈抗原結(jié)合區(qū)所結(jié)合的表位，要么可以與每條重鏈相聯(lián)合并且使得一條或兩條所述重鏈能夠與一個(gè)或兩個(gè)表位結(jié)合。
[0071]術(shù)語“細(xì)胞”包括適合 于表達(dá)重組核酸序列的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞包括原核生物和真核生物(單細(xì)胞或多細(xì)胞)的細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)、鏈霉菌屬物種(Streptomyces spp.)的菌株,等等)、分支桿菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、甲醇畢赤酵母(P.methanolica)等)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如，SF-9、SF-21、被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)等)、非人動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、或者細(xì)胞融合物例如雜交瘤或四源雜交瘤。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核的并且選自下列細(xì)胞:CH0(例如，CHO KU DXB-1ICH0, Veggie-CHO)、C0S(例如，C0S-7)、視網(wǎng)膜細(xì)胞、Vero,CV1、腎細(xì)胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK, HaK、BHK)、HeLa, H印G2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60 (例如，BHK21)、Jurkat, Daud1、A431 (表皮的)、CV-1、U937、3T3、L細(xì)胞、C127細(xì)胞、SP2 / 0、NS-0、MMT060562、塞托利細(xì)胞、BRL3A細(xì)胞、HT1080細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及源自上面提及的細(xì)胞的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)病毒基因，例如表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，PER.C6?細(xì)胞)。
[0072]短語“互補(bǔ)性決定區(qū)”或術(shù)語“⑶R”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列所編碼的氨基酸序列，其通常(即，在野生型動(dòng)物中)出現(xiàn)在免疫球蛋白分子(例如，抗體或T細(xì)胞受體)的輕鏈或重鏈的可變區(qū)中的兩個(gè)構(gòu)架區(qū)之間。CDR可以由例如種系序列或者經(jīng)重排或未重排的序列編碼，和例如由幼稚或成熟的B細(xì)胞或T細(xì)胞編碼。在某些情況下(例如，對(duì)于CDR3)，CDR可以由不是鄰接的(例如，在未重排的核酸序列中)但在B細(xì)胞核酸序列中是鄰接的(例如，由于剪接或連接所述序列(例如，V-D-J重組從而形成重鏈CDR3))兩個(gè)或更多個(gè)序列(例如，種系序列)編碼。
[0073]短語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包含來自任何生物的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列，并且，除非另外說明，包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域。重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)重鏈CDR和四個(gè)FR區(qū)，除非另外說明。重鏈的片段包括CDR，CDR和FR，以及其組合。典型的重鏈在可變結(jié)構(gòu)域之后(從N-末端至C-末端)具有CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。重鏈的功能性片段包括這樣的片段，所述片段能夠特異性地識(shí)別抗原(例如，以在μΜ、ηΜ或ρΜ范圍內(nèi)的Kd識(shí)別抗原)，能夠從細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和分泌，并且包含至少一個(gè)CDR。
[0074]短語“包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)”包括抗體、雙特異性抗體、免疫粘附素以及其他至少包含免疫球蛋白CH2和CH3區(qū)的功能性部分的結(jié)合蛋白?！肮δ苄圆糠帧笔侵缚梢越Y(jié)合Fe受體(例如，F(xiàn)e Y R ;或FcRn,即新生Fe受體)和/或可以參與補(bǔ)體激活的CH2或CH3區(qū)。如果CH2和CH3區(qū)包含致使其不能結(jié)合任何Fe受體并且也不能激活補(bǔ)體的缺失、置換和/或插入或者其他修飾，那么該CH2和CH3區(qū)就不是功能性的。[0075]包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)可以在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中包含修飾，包括所述修飾影響該結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子功能(例如，影響Fe Y R結(jié)合，F(xiàn)cRn結(jié)合和因此半壽期，和/或⑶C活性的修飾)的情況。此類修飾包括但不限于下列修飾及其組合(參考免疫球蛋白恒定區(qū)的 EU 編號(hào)):238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438 和 439。
[0076]例如，但非限制性地，所述結(jié)合蛋白為包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)并展示出增加的血清半壽期(相比于沒有所描述的修飾的相同的包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)而言)，并且具有在位置250 (例如，E 或 Q) ;250 和 428(例如，L 或 F) ;252(例如，L / Y / F / W 或 Τ)、254(例如，S 或Τ)和256 (例如，S/R/Q/E/D或Τ)處的修飾；或者在428和/或433 (例如，L /R / SI / P / Q或K)和/或434 (例如，H / F或Y)處的修飾；或者在250和/或428處的修飾；或者在307或308(例如，308F、V308F)和434處的修飾。在另一個(gè)實(shí)例中，所述修飾可以包括428L (例如，M428L)和434S (例如，N434S)修飾；428L、259I (例如，V259I)和308F (例如，V308F)修飾;433K (例如，H433K)和 434 (例如，434Υ)修飾；252、254 和 256 (例如，252Υ、254Τ 和 256Ε)修飾；250Q 和 428L 修飾(例如，T250Q 和 M428L) ；307 和 / 或 308修飾(例如，308F或308P)。
[0077]短語“離子改性劑”包括這樣的部分，其減少蛋白質(zhì)之間的非特異性(即，非親和力)離子相互作用的影響，或者破壞蛋白質(zhì)之間的非特異性(即，非親和力)離子相互作用。“離子改性劑”包括，例如，I族和II族金屬與乙酸根、碳酸氫根、碳酸根、鹵素(例如，負(fù)氯離子或負(fù)氟離子)、硝酸根、磷酸根或硫酸根的鹽，離子組合?！半x子改性劑”的非限制性的舉例說明性的列表包括乙酸的鈹、鋰、鈉和鉀鹽；碳酸氫鈉和碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫和氯化鎂；氟化鈉和氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸鈣；磷酸鈉和磷酸鉀；以及硫酸鈣和硫酸鎂。“離子改性劑”包含影響離子相互作用的那些部分，其在加入至PH梯度或階梯之后，或者在“離子改性劑”中平衡A蛋白支持物和應(yīng)用PH階梯或梯度之后，導(dǎo)致在同源二聚IgG和異源二聚IgG(例如，野生型人IgG和相同的但攜帶一個(gè)或多個(gè)本文中所描述的其CH3結(jié)構(gòu)域的修飾的IgG)的洗脫之間的pH單位距離的變寬?！半x子改性劑”的合適的濃度可以由采用相同的柱子、PH階梯或梯度的其濃度來確定，其中增加“離子改性劑”的濃度直至在給定的PH階梯或pH梯度下達(dá)到最大pH距離。
[0078]短語“輕鏈”包含來自任何生物的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)序列，并且，除非另外說明，包含人K和λ輕鏈。輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域通常包含三個(gè)輕鏈CDR和四個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，除非另外說明。通常，全長(zhǎng)輕鏈從氨基末端至羧基末端包含VL結(jié)構(gòu)域(其包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明中可使用的輕鏈包括，例如不選擇性地結(jié)合被所述抗原結(jié)合蛋白選擇性地結(jié)合的第一或第二抗原的那些。合適的輕鏈包括可以通過在現(xiàn)有的抗體文庫(濕文庫或計(jì)算機(jī)文庫)中就最經(jīng)常采用的輕鏈進(jìn)行篩選而鑒定出的那些，其中所述輕鏈基本上不干擾所述抗原結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力和/或選擇性。合適的輕鏈包括可以結(jié)合一個(gè)或兩個(gè)被所述抗原結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合的表位的那些。
[0079]短語“μ M范圍”意指1-999 μ M ;短語“ηΜ范圍”意指1_999ηΜ ;短語“ρΜ范圍”意指 1-999ρΜ。
[0080]短語“經(jīng)體細(xì)胞突變的”包括涉及來自經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞的核酸序列，其中在經(jīng)類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞中的免疫球蛋白可變區(qū)(例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域，或包括重鏈CDR或FR序列)的核酸序列與在類別轉(zhuǎn)換之前的B細(xì)胞中的該核酸序列是不同的，例如在未經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞與經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞之間CDR或構(gòu)架核酸序列的差異?！敖?jīng)體細(xì)胞突變的”包括涉及來自經(jīng)親和力成熟的B細(xì)胞的核酸序列，其與在未經(jīng)親和力成熟的B細(xì)胞中的相應(yīng)序列(即，在種系細(xì)胞的基因組中的序列)是不同的。短語“經(jīng)體細(xì)胞突變的”還包括涉及來自在將B細(xì)胞暴露于目的抗原之后的該B細(xì)胞的核酸序列,其中所述核酸序列不同于在將該B細(xì)胞暴露于目的抗原之前的相應(yīng)核酸序列。短語“經(jīng)體細(xì)胞突變的”涉及來自抗體的序列，所述抗體已在動(dòng)物(`例如具有人免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列的小鼠)中作為對(duì)于抗原攻擊的應(yīng)答而產(chǎn)生，并且由于在這樣的動(dòng)物中固有地運(yùn)作的選擇過程而引起。
[0081]短語“可變結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈(其如所希望的那樣進(jìn)行修飾)的氨基酸序列，其從N-末端至C-末端(除非另外指明)順次包含下列氨基酸區(qū)域:FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4?！翱勺兘Y(jié)構(gòu)域”包括能夠折疊成具有雙β片層結(jié)構(gòu)的規(guī)范結(jié)構(gòu)域(VH或VL)的氨基酸序列，其中所述β片層通過在第一 β片層和第二 β片層之間的二硫鍵相連接。
[0082]具有經(jīng)修飾的IgG CH3區(qū)的雙特異性抗體
[0083]發(fā)明人已開發(fā)了一種新的形式，其將常見的輕鏈策略與選擇性A蛋白純化方案(其可以用于人抗體組分)的實(shí)施相組合。
[0084]先前已注意到(Lindhofer,H.等人，(1995) J.1mmunol.155:219-225),由于人IgG3不與A蛋白結(jié)合，因而潛在地可以將它與任何其他三種人IgG亞類一起在與用于小鼠-大鼠雜合體的純化策略相似的純化策略中使用。然而，盡管所有四種人IgG亞類是高度同源的，但并不知道IgGl、IgG2和IgG4的Fe部分如何容易地與IgG3形成異源二聚體；甚至僅優(yōu)先形成同源二聚體都將可能在某些情況下(例如，從四源雜交瘤中分離)對(duì)于所希望的異源二聚體的總產(chǎn)量具有負(fù)面影響。還可能需要額外的修飾以補(bǔ)償IgG3的鉸鏈區(qū)與其他亞類的鉸鏈區(qū)之間的差異。還優(yōu)選的是，在某些情況下，不需要存在完全的IgG3Fc，因?yàn)閷?duì)于效應(yīng)子功能的潛在影響。
[0085]因此，發(fā)明人設(shè)計(jì)出了采用幸運(yùn)地簡(jiǎn)單的A蛋白結(jié)合決定子的“最小”形式。已報(bào)道(Jendeberg,L.等人，(1997) J.1mmunological Meth.201:25-34), IgG3 不能結(jié)合 A 蛋白是由單個(gè)氨基酸殘基，Arg435 (EU編號(hào)；Arg95，根據(jù)MGT)(在其他IgG亞類中的這一相應(yīng)位置被組氨酸殘基占據(jù))所決定的。因此，可能的是，使用其中His435突變?yōu)锳rg的IgGl序列，以代替IgG3。因此，IgGl中的單個(gè)點(diǎn)突變應(yīng)當(dāng)足以產(chǎn)生順應(yīng)于新純化方案的不同的結(jié)合親和力。這種修飾將被稱為IgGlAA,以表示其不能結(jié)合A蛋白(和，類似地，IgG2AA和IgG4 Δ A——或更一般地，F(xiàn)e Λ A)。
[0086]然而，特定的點(diǎn)突變通過所述突變而引入新的肽序列，其可能潛在地是免疫原性的。在理論上，點(diǎn)突變可以加載到MHC II類分子上并呈遞給T細(xì)胞，并因此引起免疫應(yīng)答。為了避免該缺陷，可以使用二肽突變，H435R / Y436F(EU編號(hào)；H95R / Y96F，根據(jù)MGT)。所得的序列在所述改變附近與IgG3的序列相同(參見，圖2A)，并因此預(yù)期是免疫學(xué)上“不可見的”，因?yàn)閷]有非天然的短肽可用于呈遞給T細(xì)胞。已報(bào)道，該雙突變體仍然不結(jié)合A 蛋白(Jendeberg, L.等人，(1997) J.1mmunological Meth.201:25-34)。最后，該雙妝突變不包括任何形成Fe 二聚體界面的殘基，因此不可能干擾異源二聚體的形成。該二肽突變被稱為“IgGl AAdp” (和，類似地，IgG2AAdp、IgG4AAdp 和 Fe ΔAdp)。IgGl、IgG2 和 IgG4中該二肽修飾的布置在圖3中在標(biāo)示為IgGlAAdp、IgG2AAdp和IgG4AAdp的序列(其與野生型人IgG CH3結(jié)構(gòu)域序列以及hIgG3—起顯示)中指明，其中顯示了 MGT外顯子編號(hào)和EU編號(hào)。
[0087]所述Fe AAdp修飾不包括任何據(jù)信形成Fe 二聚體界面的殘基，因此所述Fe AAdp修飾不可能干擾異源二聚體的形成。由于所述Fe Λ Adp是如此地最小，因而它也可能摻入到其他經(jīng)改造的Fe形式中。IgG2AAdp和IgG4 AAdp在其中希望與它們中的每一個(gè)相關(guān)的效應(yīng)子功能(或其缺乏)的情況下可以是有利的。
`[0088]總之，上面所描述的雙特異性抗體形式包括使用相同輕鏈的具有不同特異性的兩個(gè)抗體，其中它們中之一的Fe區(qū)被修飾為Fe AAdp形式(參見，圖2B)。它的構(gòu)型為天然的人抗體的構(gòu)型，并因此應(yīng)當(dāng)共享其有利的特性，包括低的聚集傾向，體內(nèi)穩(wěn)定性，最小的免疫原性，與抗體相似的生物分布特性，良好的藥物動(dòng)力學(xué)，和可選地，效應(yīng)子功能。提供了用于分離此類雙特異性抗體的方法，其在實(shí)施中是相對(duì)快速和簡(jiǎn)單的。
[0089]具有經(jīng)修飾的小鼠IgG CH區(qū)的雙特異性結(jié)合蛋白
[0090]發(fā)明人已設(shè)計(jì)出了用于容易地分離結(jié)合蛋白的方法，所述結(jié)合蛋白包含關(guān)于在CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而言為異源二聚的免疫球蛋白重鏈(或其功能性的包含CH2和CH3的片段)。仔細(xì)選擇小鼠IgG CH結(jié)構(gòu)域的修飾和應(yīng)用特定的分離技術(shù)賦予了從同源二聚體中和從不包含所述修飾的異源二聚體中容易地分離包含兩個(gè)經(jīng)差別修飾的小鼠CH區(qū)的結(jié)合蛋白的能力。
[0091]在247處包含脯氨酸，在252、254和256處包含蘇氨酸，和在258處包含賴氨酸的小鼠IgGl僅微弱地與A蛋白結(jié)合。然而，小鼠IgG2a和IgG2b在那些位置(IgG2b位置256和258除外)處包含不同的殘基，并且小鼠IgG2a和2b與A蛋白很好地結(jié)合。在制備對(duì)于重鏈而言為異源二聚的抗體的方法中差別修飾兩個(gè)小鼠IgG的CH區(qū)將會(huì)賦予這樣的抗體以有區(qū)別的A蛋白結(jié)合特征。以這樣的方式，設(shè)計(jì)出了有區(qū)別的A蛋白分離方案，其允許簡(jiǎn)便地將經(jīng)修飾的異源二聚體與任何小鼠IgG同源二聚體(無論其是IgGl (其將會(huì)僅十分弱地與A蛋白結(jié)合，如果從根本上來說)的同源二聚體，還是小鼠IgG2a的同源二聚體、小鼠IgG2b的同源二聚體或者IgG2a / IgG2b的異源二聚體)相分開。例如，具有兩個(gè)不同的重鏈可變結(jié)構(gòu)域但相同的同種型(例如IgG2a)的雙特異性抗體可以在采用重鏈序列的合適的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，其中僅修飾IgG2a CH區(qū)中的一個(gè)以減少或消除A蛋白結(jié)合決定子。以這樣的方式，IgG2a CH區(qū)中僅一個(gè)將會(huì)展示出實(shí)質(zhì)的對(duì)于A蛋白的親和力，并且將會(huì)容易地從經(jīng)修飾的異源二聚體中分離任何從未修飾的IgG2a和經(jīng)修飾的IgG2a的二聚體形成的抗體。
[0092]在各種實(shí)施方案中，涉及這樣的抗體，其中Fe 二聚體的單個(gè)CH區(qū)包含經(jīng)修飾的CH區(qū)，而Fe二聚體的另一CH缺乏它們。修飾小鼠IgG CH區(qū)以便在選自下列的特定位置(EU編號(hào))處包含特定的氨基酸:252T、254T 和 256Τ ;252Τ、254Τ、256Τ 和 258Κ ;247Ρ、252Τ、254Τ、256Τ 和 258Κ ;435R和 436F ;252T、254T、256T、435R和 436F ;252T、254T、256T、258K、435R和436F ;24tP、252T、254T、256T、258K、435R 和 436F ;和 435R。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，進(jìn)行特定的成組修飾，其選自下列:M252T、S254T、S256T ;M252T、S254T、S256T、I258K ;I247P、M252T、S254T、S256T、I258K ;H435R、H436F ;M252T、S254T、S256T、H435R、H436F ;M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F ;I247P、M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F ;和H435R。
[0093]可以將異源二聚的基于小鼠IgG的結(jié)合蛋白用于各種各樣的應(yīng)用。例如，它們?cè)试S用于分離具有小鼠恒定結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體的方法，其中所述修飾不干擾或基本上不干擾該抗體與一個(gè)或多個(gè)小鼠Fe受體的結(jié)合，從而該抗體可以參與例如ADCC或CDC，并且也結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)在相同或不同靶上的表位。
[0094]在一個(gè)方面，提供了用于分離包含第一小鼠IgG CH區(qū)和第二小鼠IgG CH的結(jié)合蛋白的方法，其中修飾所述第一 IgG `CH區(qū)(但不修飾所述第二 IgG CH區(qū))以便減少或消除所述第一小鼠IgG CH區(qū)而不是所述第二小鼠IgG CH區(qū)的A蛋白結(jié)合親和力，并且其中所述結(jié)合蛋白包含結(jié)合第一表位的第一結(jié)合部分和結(jié)合第二表位的第二結(jié)合部分。
[0095]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾不改變或基本上不改變所述結(jié)合蛋白與Fe受體的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白包含增加或降低該結(jié)合蛋白與Fe受體的親和力的修飾。
[0096]在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于缺乏所述修飾的相應(yīng)的結(jié)合蛋白而言，所述修飾不改變或基本上不改變所述結(jié)合蛋白在包含天然小鼠Fe Y R受體和/或天然小鼠FcRn的小鼠中的血清半壽期。
[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于缺乏所述修飾的相應(yīng)的結(jié)合蛋白而言，所述修飾不改變或基本上不改變所述結(jié)合蛋白在包含天然小鼠高和低親和力Fe Y R受體和/或FcRn受體的替換的小鼠中的血清半壽期。
[0098]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表位和所述第二表位是不同的，并且在不同的細(xì)胞上或在不同的蛋白質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表位和所述第二表位是不同的，并且在相同的細(xì)胞上或在相同的蛋白質(zhì)上。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fe受體選自高親和力Fe受體、低親和力Fe受體和FcRn。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述Fe受體選自下列中的一個(gè)或多個(gè):小鼠FcRn、小鼠Fe Y R、小鼠Fe Y RIIB、小鼠Fe Y RII1、小鼠Fe y RIV及其組合。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述Fe受體選自下列中的一個(gè)或多個(gè):人FcRn、人Fe YR、人Fe yRIIB、AFcyRIIC、AFe Y RIIIB、人 Fe y RIIIA、人 Fe y RIIA 及其組合。
[0100]免疫原性
[0101]本發(fā)明的許多實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠采用修飾來制備雙特異性抗體，所述雙特異性抗體不僅基于與A蛋白的差別結(jié)合而為可容易分離的，并且還在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。該特征使得這樣的實(shí)施方案特別可用于制備用于人治療用途的雙特異性抗體中，和可用于制備免疫粘附素，其例如是非免疫原性的或基本上非免疫原性的(采用人結(jié)合部分，即人受體組分和/或人配體)。該特征與這樣的雙特異性抗體相關(guān)，所述雙特異性抗體具有IgGl、IgG2和IgG3的具有H95R / Y96F(IMGT編號(hào))修飾的CH3結(jié)構(gòu)域，和包含進(jìn)一步修飾(其導(dǎo)致該位置被修飾從而反映不同IgG同種型的野生型序列)的那些CH3結(jié)構(gòu)域。因此，盡管在自然界中未發(fā)現(xiàn)所述修飾與特定的IgG同種型相關(guān)，但經(jīng)修飾的序列局部地與不同IgG同種型的野生型序列相同，并且并不預(yù)期所述修飾是免疫原性的或基本上免疫原性的。還可能的是，即使其序列不與任何天然序列局部相同，修飾也是非免疫原性的；此類修飾將會(huì)是同樣有用的。如果是非免疫原性的，那么最小的點(diǎn)突變H95R(IMGT編號(hào))因而將會(huì)是本發(fā)明的合適的實(shí)施方案。
[0102]因此，提供了雙特異性抗體，所述雙特異性抗體關(guān)于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域而言在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，然而攜帶一個(gè)或多個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的差別修飾，包括導(dǎo)致重鏈恒定結(jié)構(gòu)域?qū)τ谟H和試劑(例如，A蛋白)的差別親和力的修飾。所述修飾包括本文中公開的那些。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，關(guān)于其CH3結(jié)構(gòu)域而言在人中為非免疫原性的或基本上非免疫原性的，然而具有經(jīng)差別修飾的重鏈的雙特異性抗體為包含有著下列修飾之一(或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上由下列修飾之一組成)的CH3結(jié)構(gòu)域的人 IgGU IgG2 或 IgG4:H95R,或者 H95R 和 Y96F (IMGT 編號(hào))。
[0103]預(yù)期所述雙特異性抗體相關(guān)于其中對(duì)于人IgGl、IgG2和IgG4同等型的耐受性尚未在任何大程度上被打破的人而言，是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
[0104]特別地，預(yù)期所述Fe Λ Adp修飾是免疫學(xué)上“不可見的”，因?yàn)镸HCII類分子的結(jié)合溝容納包含由T細(xì)胞受體的可變環(huán)所識(shí)別的主要決定子的9-聚體，從而缺乏任何天然9-聚體子序列的肽將看起來不可能引起免疫應(yīng)答。然而，比9-聚體更長(zhǎng)的肽(通常大約13-至17-聚體)被MHC II類分子結(jié)合，并且可能的是，突出的區(qū)段可能潛在地影響結(jié)合。因此，消除較長(zhǎng)的非天然序列的額外修飾(在Fe AAdp修飾之外)可以進(jìn)一步減少免疫原性的潛在性。一個(gè)特別的 實(shí)例為修飾V422I(EU ;V82I，根據(jù)MGT編號(hào))，其在IgGlAAdp中將最小非天然肽的長(zhǎng)度從14個(gè)殘基延伸至39個(gè)殘基，和在類似地定義的IgG2AAdp中延伸至43個(gè)殘基。另一個(gè)實(shí)例為IgG4AAdp中的修飾L445P(EU ;L105P，根據(jù)MGT編號(hào))，其將該長(zhǎng)度從10個(gè)殘基延伸至14個(gè)殘基。
[0105]藥物動(dòng)力學(xué)
[0106]對(duì)于A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)與對(duì)于新生Fe受體(FcRN，其被認(rèn)為負(fù)責(zé)賦予免疫球蛋白以延長(zhǎng)的血清半壽期)的結(jié)合位點(diǎn)相重疊。因此，在A蛋白結(jié)合位點(diǎn)附近的修飾提高了這樣的可能性，即在本文中所提出的形式可以具有比IgGl、2和4更短的血清半壽期，假定人IgG3(大約7天)具有比其他IgG亞類(大約21天)更短的血清半壽期。一些影響His435的Fe突變體已顯示不結(jié)合FcRN，并且在小鼠中具有較短的半壽期。然而，藥物動(dòng)力學(xué)分析已顯示，IgGlAA / IgGl異源二聚體的血清半壽期并非與IgGl同源二聚體的血清半壽期相當(dāng)不同(參見，實(shí)施例2)。因此，IgGl AAdp突變具有去除A蛋白結(jié)合而同時(shí)仍然保留IgGl的較長(zhǎng)半壽期的優(yōu)點(diǎn)。
[0107]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含如在本文中所描述的CH3結(jié)構(gòu)域修飾的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白展示出與缺乏在CH3結(jié)構(gòu)域處的修飾的相同的雙特異性抗原結(jié)合蛋白等價(jià)的藥物動(dòng)力學(xué)特性曲線。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含IgGlAA / IgGl異源二聚Fe的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體所具有的血清半壽期為在其他方面相同但包含IgG3CH3結(jié)構(gòu)域或者在其他方面相同但包含至少一個(gè)IgG3重鏈的雙特異性抗體的大約1.5倍、大約2倍、大約2.5倍或大約3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含IgGl Λ A / IgGl異源二聚Fe的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體展示出與沒有該IgGl Λ A修飾的雙特異性抗體(即IgGl同源二聚雙特異性抗體)大致相同的血清半壽期。
[0108]免疫球蛋白重鏈
[0109]可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來產(chǎn)生可以用于產(chǎn)生具有所希望的特征(例如，所希望的特異性，所希望的親和力，所希望的功能性，例如阻斷、非阻斷、抑制、激活等)的雙特異性抗體的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。然后，可以通過將包含可變區(qū)的核酸序列克隆到具有本文中所描述的所希望的重鏈恒定區(qū)的構(gòu)建體中來構(gòu)建所希望的重鏈。
[0110]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一重鏈包含由源自第一動(dòng)物(其已用第一抗原進(jìn)行免疫接種)的成熟B細(xì)胞基因組的核酸所編碼的可變區(qū)，并且第一重鏈特異性地識(shí)別第一抗原。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，第二重鏈包含由源自第二動(dòng)物(其已用第二抗原進(jìn)行免疫接種)的成熟B細(xì)胞基因組的核酸所編碼的可變區(qū)，并且第二重鏈特異性地識(shí)別第二抗原。
[0111]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一動(dòng)物和/或第二動(dòng)物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的經(jīng)基因改造的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一動(dòng)物和/或第二動(dòng)物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的經(jīng)基因改造的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一動(dòng)物和/或第二動(dòng)物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的經(jīng)基因改造的小鼠。
[0112]免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列可以通過本領(lǐng)域中已知的任何其他方法(例如，通過噬菌體展示)來獲得，并且可以將由此所獲得的序列用于制備核酸構(gòu)建體以用于連接至編碼任何合適的重鏈(例如，具有如在本文中所描述的經(jīng)修飾的CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈)的核酸，并置于表達(dá)構(gòu)建體中和轉(zhuǎn)移至能夠產(chǎn)生重鏈(例如，在合適的輕鏈存在下)的細(xì)胞。
[0113]免疫球蛋白輕鏈
[0114]包含識(shí)別兩個(gè)不同表位(或兩個(gè)不同抗原)的兩條重鏈的雙特異性抗體更容易被分離，在它們可以與相同的輕鏈(即具有相同的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的輕鏈)相配對(duì)時(shí)。在本領(lǐng)域中已知各種方法用于產(chǎn)生輕鏈，所述輕鏈可以與具有不同特異性的兩條重鏈相配對(duì)，而不干擾或基本上不干擾重鏈可變結(jié)構(gòu)域與其靶抗原的選擇性和/或親和力。[0115]在一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇:調(diào)查所有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的使用統(tǒng)計(jì)學(xué)，鑒定出人抗體中最頻繁使用的輕鏈，并且將該輕鏈與具有不同特異性的兩條重鏈相配對(duì)。
[0116]在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇:觀察噬菌體展示文庫(例如，包含人輕鏈可變區(qū)序列的噬菌體展示文庫，例如人ScFv文庫)中的輕鏈序列，并且從該文庫中選擇出最經(jīng)常使用的輕鏈可變區(qū)。
[0117]在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇:使用兩條重鏈的重鏈可變序列作為探針來對(duì)輕鏈可變序列的噬菌體展示文庫進(jìn)行檢定。與兩個(gè)重鏈可變序列都相聯(lián)合的輕鏈被選擇作為用于所述重鏈的輕鏈，并且允許相關(guān)于兩個(gè)表位的結(jié)合和/或激活。
[0118]在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇:將已知的輕鏈與所希望的重鏈相組合，并且就結(jié)合特異性、親和力和/或激活能力來對(duì)所得到的雙特異性抗體進(jìn)行檢定。
[0119]在任何用于選擇輕鏈的方法中遇到困難(例如，所述輕鏈干擾所述重鏈中的一條或兩條與其抗原的結(jié)合，或者所述輕鏈不能與所述重鏈中的一條或兩條令人滿意地相聯(lián)合)的情況下，可以將所述輕鏈與所述重鏈的關(guān)聯(lián)輕鏈進(jìn)行比對(duì)，并且在所述輕鏈中產(chǎn)生修飾以便更接近地匹配對(duì)于該兩條重鏈的關(guān)聯(lián)輕鏈來說共同的序列特征。如果免疫原性的機(jī)會(huì)需要被最小化，那么所述修飾優(yōu)選地導(dǎo)致在已知的人輕鏈序列中存在的序列，從而蛋白水解加工不可能產(chǎn)生 T細(xì)胞表位，基于在領(lǐng)域中已知用于評(píng)估免疫原性的可能性的參數(shù)和方法(即，計(jì)算機(jī)測(cè)定法以及濕測(cè)定法)。
[0120]抗體和結(jié)合蛋白
[0121]所述組合物和方法在制備人雙特異性抗體(即包含人恒定結(jié)構(gòu)域和可變結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體)中是特別有用的。在一些實(shí)施方案中，人抗體包括具有源自人種系免疫球蛋白序列(在一些實(shí)施方案中，源自經(jīng)體細(xì)胞突變的人免疫球蛋白序列(例如，在包含人免疫球蛋白基因序列的動(dòng)物中產(chǎn)生的))的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的那些抗體。在一些實(shí)施方案中，人可變區(qū)和/或恒定區(qū)可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基或者由于例如在CDR (特別是CDR3)中的重組和/或剪接而編碼的氨基酸殘基。人抗體并不想要包括其中已經(jīng)將源自另一哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。那些抗體被稱為人源化的或嵌合的抗體。人抗體包括包含突變(例如，通過隨機(jī)或位點(diǎn)專一誘變而在體外引入的)的那些抗體，但是所述突變優(yōu)選地在人中是非免疫原性的。
[0122]所述方法和組合物可以用于制備嵌合抗體，其優(yōu)選地在人中是非免疫原性的，或具有低免疫原性。嵌合抗體是其中重鏈可變區(qū)或構(gòu)架區(qū)或⑶R或者重鏈恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域之一來自不同物種(例如，人和小鼠，或者人和靈長(zhǎng)類)的抗體。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗體包括具有非人來源(例如，小鼠)的重鏈可變區(qū)和人來源的重鏈恒定區(qū)的抗體。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗體包括具有人來源的重鏈可變區(qū)和非人(例如，小鼠)來源的重鏈恒定區(qū)的抗體。在各種實(shí)施方案中，小鼠來源的區(qū)域與具有或沒有體細(xì)胞高變的小鼠免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同。嵌合抗體還包括這樣的抗體，所述抗體具有與人免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同的輕鏈恒定區(qū)和非人(例如，小鼠)重鏈或嵌合的人/非人重鏈。嵌合抗體包括這樣的抗體，所述抗體具有與非人(例如，小鼠)免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和人重鏈或嵌合的非人/人重鏈。[0123]在一些實(shí)施方案中，所述組合物和方法用于制備經(jīng)親和力成熟的抗體。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)親和力成熟的抗體在一個(gè)或多個(gè)CDR中包含一個(gè)或多個(gè)改變，其導(dǎo)致相比于缺乏所述改變的基本上相同的抗體而言更高的所述抗體對(duì)于其靶抗原的親和力(例如，在nM或ρΜ范圍內(nèi)的Kd)。經(jīng)親和力成熟的抗體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來制備，例如，通過CDR和/或構(gòu)架區(qū)的隨機(jī)或位點(diǎn)定向誘變，隨后為親和篩選、VH結(jié)構(gòu)域改組等。
[0124]在一些實(shí)施方案中，所述抗體為中和抗體。中和抗體包括能夠中和、抑制或阻止抗原的生物學(xué)活性的抗體。中和抗體包括在結(jié)合抗原后阻止或降低所述抗原在體內(nèi)和體外作用于該抗原的天然靶的能力的那些抗體。中和抗體的實(shí)例包括針對(duì)生物學(xué)受體的蛋白質(zhì)配體的抗體，其阻止所述配體結(jié)合所述受體，或者針對(duì)生物學(xué)受體的抗體，其阻止所述受體結(jié)合其配體，其中在不存在所述抗體的情況下的配體結(jié)合引起所述受體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生變化。確定一種抗體是否為中和抗體通常需要進(jìn)行功能測(cè)定法，其中測(cè)量所述抗體對(duì)于所述抗原的生物學(xué)活性的影響。
[0125]本發(fā)明的方法和組合物在各種關(guān)于抗體和其他結(jié)合蛋白的應(yīng)用中也是有用的。本文提供了一些有用應(yīng)用的簡(jiǎn)短描述。
[0126]可以制備包含針對(duì)腫瘤抗原和T-細(xì)胞抗原的結(jié)合特異性的雙特異性結(jié)合蛋白，其靶向細(xì)胞上的抗原，例如⑶20，并且還靶向T-細(xì)胞上的抗原，例如⑶3。以這樣的方式，所述雙特異性抗體靶向患者中的目的細(xì)胞(例如，淋巴瘤患者中的B細(xì)胞，通過CD20結(jié)合)以及該患者的T-細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，對(duì)所述雙特異性抗體進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便在結(jié)合CD3后激活T-細(xì)胞，從而將T-細(xì)胞激活與特定的、所選擇的腫瘤細(xì)胞相偶聯(lián)。
[0127]也可以制備包含兩個(gè)結(jié)合部分的雙特異性蛋白，所述兩個(gè)結(jié)合部分中的每個(gè)針對(duì)在相同細(xì)胞的表面上的結(jié)合伙伴(即，每個(gè)針對(duì)不同的靶)。該設(shè)計(jì)特別適合于靶向在相同細(xì)胞的表面上表達(dá)該兩種靶的特定細(xì)胞或細(xì)胞類型。盡管靶可能獨(dú)個(gè)地出現(xiàn)在其他細(xì)胞上，但是對(duì)這些結(jié)合蛋白的結(jié)合部分進(jìn)行選擇，從而使得每個(gè)結(jié)合部分以相對(duì)低的親和力(例如，低μΜ，或高nM——例如，超過一百nM的KD，例如500、600、700、800nM)結(jié)合其靶。以這樣的方式，僅在所述兩種靶在相同細(xì)胞上鄰近的情況下，才有利于延長(zhǎng)的靶結(jié)合。
[0128]可以制備包含結(jié)合相同靶的兩個(gè)結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白，所述兩個(gè)結(jié)合部分中的每個(gè)在相同靶的不同表位處結(jié)合。該設(shè)計(jì)特別適合于使成功地用結(jié)合蛋白阻斷靶的可能性最大化。多個(gè)細(xì)胞外環(huán)(例如，跨膜通道或細(xì)胞表面受體的細(xì)胞外環(huán))可以被相同的雙特異性結(jié)合分子所靶向。
[0129]可以制備包含兩個(gè)結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白，所述兩個(gè)結(jié)合部分簇集并激活免疫信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)物，從而導(dǎo)致免疫抑制。當(dāng)所述靶在相同的細(xì)胞上時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)順式阻抑；當(dāng)所述靶在不同的細(xì)胞上時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)反式阻抑。順式阻抑，例如可以用具有抗-1gGRIIb結(jié)合部分和抗-FelDl結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白來實(shí)現(xiàn)，從而使得IgGRIIb僅在FelDl存在下才被簇集，以便下調(diào)對(duì)于FelDl的免疫應(yīng)答。反式阻抑，例如可以用具有抗-BTLA結(jié)合部分和特異性地結(jié)合組織特異性目的抗原的結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白來實(shí)現(xiàn)，從而使得抑制性BTLA分子的簇集僅在所選擇的靶組織中發(fā)生，這潛在地處理自身免疫疾病。
[0130]可以制備激活多組分受體的雙特異性結(jié)合蛋白。在該設(shè)計(jì)中，針對(duì)受體的兩個(gè)組分的兩個(gè)結(jié)合部分結(jié)合該受體，使該受體交聯(lián)，并激活從該受體的信號(hào)傳導(dǎo)。這可以例如使用具有結(jié)合IFNARl的結(jié)合部分和結(jié)合IFNAR2的結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白來進(jìn)行，其中結(jié)合使該受體交聯(lián)。這樣的雙特異性結(jié)合蛋白可以提供關(guān)于干擾素治療的備選方案。
[0131]可以制備轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合部分跨越半滲透性屏障(例如，血腦屏障)的雙特異性結(jié)合蛋白。在該設(shè)計(jì)中，一個(gè)結(jié)合部分結(jié)合可以越過特定的選擇性屏障的靶；另一個(gè)結(jié)合部分靶向具有治療活性的分子，其中該具有治療活性的靶分子通常不能穿過該屏障。這種類型的雙特異性結(jié)合蛋白對(duì)于將治療劑帶至否則治療劑將不會(huì)到達(dá)的組織是有用的。一些實(shí)例包括靶向PlGR受體以轉(zhuǎn)運(yùn)治療劑進(jìn)入腸或肺，或者靶向運(yùn)鐵蛋白受體以轉(zhuǎn)運(yùn)治療劑跨越血腦屏障。
[0132]可以制備轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合部分進(jìn)入特定細(xì)胞或細(xì)胞類型的雙特異性結(jié)合蛋白。在該設(shè)計(jì)中，一個(gè)結(jié)合部分靶向容易地內(nèi)在化到細(xì)胞中的細(xì)胞表面蛋白(例如，受體)。另一個(gè)結(jié)合部分靶向細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中所述細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)合導(dǎo)致治療效應(yīng)。
[0133]結(jié)合吞噬免疫細(xì)胞的表面受體和感染性病原體(例如，酵母或細(xì)菌)的表面分子以將所述感染性病原體帶至吞噬免疫細(xì)胞附近從而促進(jìn)所述病原體的吞噬的雙特異性結(jié)合蛋白。此類設(shè)計(jì)的一個(gè)實(shí)例可以為靶向CD64或CD89分子和也靶向病原體的雙特異性抗體。
[0134]具有抗體可變區(qū)作為一個(gè)結(jié)合部分和具有非Ig部分作為第二個(gè)結(jié)合部分的雙特異性結(jié)合蛋白。所述抗體可變區(qū)實(shí)現(xiàn)靶向，而所述非Ig部分為與Fe相連接的效應(yīng)子或毒素。以這樣的方式，配體(例如，效應(yīng)子或毒素)被遞送至由該抗體可變區(qū)所結(jié)合的靶。
[0135]具有兩個(gè)部分的雙特異性結(jié)合蛋白，所述兩個(gè)部分中的每個(gè)結(jié)合至Ig區(qū)(例如，包含CH2和CH3區(qū)的Ig序列)，從而使得任何兩個(gè)蛋白質(zhì)部分可以在Fe的情境下被帶至彼此附近。該設(shè)計(jì)的實(shí)例包括誘捕劑(trap)，例如，同源二聚或異源二聚的誘捕劑分子。
[0136]核酸`
[0137]可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來獲得編碼單克隆抗體的核酸序列。用于獲得單克隆抗體(和其核酸序列)的合適方法的實(shí)例包括，例如，通過雜交瘤方法(參見，例如Kohler等人，(1975)Nature256:495-497)或噬菌體抗體文庫(參見，例如，參見Clackson 等人，(1991) Nature352:624-628)。
[0138]在各種實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域源自經(jīng)基因改造的動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述區(qū)域源自包含人免疫球蛋白小基因座(minilocus)的動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中,所述區(qū)域源自包含一個(gè)或多個(gè)染色體外核酸的小鼠，所述染色體外核酸包含一個(gè)或多個(gè)編碼免疫球蛋白序列的核酸。在各種實(shí)施方案中，所述動(dòng)物可以具有一個(gè)或多個(gè)未重排的人免疫球蛋白核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物包含人輕鏈可變區(qū)核酸序列，在一些實(shí)施方案中，包含人重鏈可變序列，在一些實(shí)施方案中，包含重鏈和輕鏈可變序列，和在一些實(shí)施方案中，還包含人恒定區(qū)序列。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述核酸序列源自其中內(nèi)源性小鼠重鏈可變區(qū)基因區(qū)段和輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段已經(jīng)被人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段和輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段替換的小鼠。
[0139]在一些實(shí)施方案中，所述核酸序列源自這樣的動(dòng)物的幼稚B細(xì)胞或T細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述核酸序列源自已用目的抗原進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物的B細(xì)胞或T細(xì)胞。
[0140]在各種實(shí)施方案中，所述核酸序列通過用引物(包括例如，成組的簡(jiǎn)并引物，其包含一個(gè)或多個(gè)FR序列、連接序列或恒定序列)擴(kuò)增它們而源自細(xì)胞。
[0141]在各種實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域源自已用目的抗原進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物的核酸。例如，用目的抗原對(duì)非人的轉(zhuǎn)基因或經(jīng)基因改造的動(dòng)物進(jìn)行免疫接種(通過例如，使動(dòng)物暴露于該抗原或者攜帶該抗原或編碼該抗原的可表達(dá)形式的核酸的細(xì)胞)，從而允許所述動(dòng)物經(jīng)歷免疫應(yīng)答，從所述動(dòng)物中分離免疫細(xì)胞(例如，B細(xì)胞)，可選地使所述細(xì)胞永生化，和篩選所述細(xì)胞以鑒定與該抗原的反應(yīng)性和/或鑒定和/或分離核酸序列，所述核酸序列編碼當(dāng)置于抗體的情境下時(shí)能夠識(shí)別該抗原的免疫球蛋白可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為B細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的B細(xì)胞來制備雜交瘤，并且鑒定表達(dá)特異性地識(shí)別所述抗原的表位的抗體的B細(xì)胞，以及鑒定和/或分離編碼識(shí)別所述表位的可變區(qū)氨基酸序列的核酸序列。
[0142]在一些實(shí)施方案中，所述核酸源自人、非人靈長(zhǎng)類(例如，猿類例如黑猩猩)、猴類(例如，食蟹猴或恒河猴)、嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、倉鼠)、驢、山羊、綿羊等。
[0143]在一些實(shí)施方案中，所述重鏈包含源自人細(xì)胞的序列。例如，在體外暴露于抗原并置于合適的宿主動(dòng)物(例如，SCID小鼠)的人胎兒細(xì)胞。[0144]在一些實(shí)施方案中，使用載體將所述核酸引入到細(xì)胞中。載體包括，例如質(zhì)粒、粘粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、植物病毒、YAC、BAC、EBV-衍生的附加體。
[0145]在一些實(shí)施方案中，所述核酸存在于表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體中。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體或構(gòu)建體為包含啟動(dòng)子的載體，所述啟動(dòng)子有效地連接至目的核酸序列，從而使得該目的核酸序列能夠在合適的細(xì)胞中在合適的條件下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)載體或構(gòu)建體可以包含前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止序列、剪接序列、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子、IRES元件、標(biāo)記基因、選擇序列、重組酶識(shí)別位點(diǎn)、同源臂、病毒序列、操縱基因(例如，原核操縱基因)等。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含允許誘導(dǎo)型表達(dá)的元件，例如，有效地連接至真核啟動(dòng)子的原核操縱基因。在一些實(shí)施方案中，在添加表達(dá)誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)了表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，在去除表達(dá)抑制物后，誘導(dǎo)了表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過溫度變化來誘導(dǎo)表達(dá)。
[0146]在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)重鏈核苷酸序列在同一個(gè)載體上。在一些實(shí)施方案中，此處的重鏈核酸序列和輕鏈核酸序列在同一個(gè)載體上。在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)重鏈核酸序列和輕鏈核酸序列在同一個(gè)載體上。
[0147]在一些實(shí)施方案中，所述核酸在包含一個(gè)或多個(gè)來自病毒的核酸的細(xì)胞中表達(dá)。在特別的實(shí)施方案中，所述病毒選自腺病毒、腺伴隨病毒、SV_40、EB病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、桿狀病毒、冠狀病毒、單純皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒和痘苗病毒。
[0148]宿主細(xì)胞為可以被轉(zhuǎn)化以表達(dá)目的核酸的細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化包括改變細(xì)胞的核酸內(nèi)容，從而使得它包含外源核酸(例如，在自然界中未在所述細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核酸，或者一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的相應(yīng)于在自然界中在所述細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸)。可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來改變細(xì)胞的核酸內(nèi)容，例如，通過將核酸整合到細(xì)胞的基因組中或者通過將它以染色體外或基因組外的形式置于細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，可以改變細(xì)胞的核酸內(nèi)容從而使得所述細(xì)胞瞬時(shí)地表達(dá)目的核酸，或者可以改變核酸內(nèi)容從而使得所述細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)目的核酸。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，細(xì)胞的基因內(nèi)容的改變得到遺傳。
[0149]分離雙特異性抗原結(jié)合蛋白
[0150]一旦基于此處的信息而選擇了合適的成組修飾，就嘗試通過使用本領(lǐng)域中已知的方法來分離雙特異性抗原結(jié)合蛋白。在每種情況下，僅應(yīng)用公開的方法并不提供令人滿意的分開。
[0151]Lindhofer等人制備了具有異源二聚重鏈的雙特異性抗體(其中具有一條結(jié)合A蛋白的重鏈(小鼠IgG)和一條不結(jié)合A蛋白的重鏈(大鼠IgG))，并且用從中性至pH5.8的PH階梯式梯度(以洗脫異源二聚體)，然后用從5.8至3.5的pH階梯(以洗脫小鼠/小鼠同源二聚體)，成功地將大鼠/小鼠異源二聚雙特異性抗體與小鼠/小鼠和大鼠/大鼠二聚體的四源雜交瘤混合物相分開。(參見，Lindhofer等人，(1995)Preferentialspecies-restricted heavy / light chain pairing in rat / mouse quadromas:Implications for a single-step purification of bispecific antibodies.J.Tmmunol.155(1):219-225)。
[0152]當(dāng)應(yīng)用于將IgGl同源二聚體與具有兩條相同的但I(xiàn)gGlCH3結(jié)構(gòu)域之一包含H435R / Y436F 二肽修飾的IgGl重鏈的IgGl異源二聚體相分開時(shí)，Lindhofer方法不成功。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在線性pH梯度中，經(jīng)二肽修飾的IgGl在大約pH3.9處洗脫，而IgGl同源二聚體在大約PH3.7處洗脫。該pH差異被認(rèn)為不足以達(dá)到使用Lindhofer方法令人滿意地將異源二聚體與同源二聚體相分開?？深A(yù)測(cè)地，該差異不是可重復(fù)的。
[0153]在采用相對(duì)較大的離子強(qiáng)度(其由為了保持特定的pH階梯或梯度所需要的緩沖液強(qiáng)度所貢獻(xiàn))的層析運(yùn)行中觀察到層析行為的變化。但通過添加有機(jī)改性劑(1-丙醇)并未達(dá)到令人滿意的分開。然而，有些令人驚訝地，對(duì)于一些層析運(yùn)行來說，添加0.5M至
1.0M的離子改性劑(例如，NaCl)急劇地和出人意料地改善了同源二聚IgGl和異源二聚IgGl的分開。離子改性劑的添加拓寬了`用于洗脫的pH范圍(在具有離子改性劑時(shí)為1.2個(gè)pH單位，但在沒有離子改性劑時(shí)為0.2個(gè)pH單位)，從而使得pH階梯式梯度可以成功地分開所述兩個(gè)種類。但是，在其他的運(yùn)行中，用僅大約150mM的NaCl濃度達(dá)到了令人滿意的分開(參見實(shí)施例4)。為了確?？梢赃_(dá)到令人滿意的分開，在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合蛋白的分離在大約0.5至大約1.0M的離子改性劑存在下進(jìn)行。
[0154]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于分離雙特異性抗原結(jié)合蛋白(其包含具有包含如在本文中所描述的修飾的一條鏈的異源二聚IgG)的方法包括在離子改性劑存在下采用pH梯度的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子改性劑以足以使IgG同源二聚體和如在本文中所描述的(即，具有CH3修飾的)IgG異源二聚體從A蛋白支持物上的洗脫之間的pH差異最大化的濃度存在。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑以大約0.5至大約1.0M的濃度存在。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述離子改性劑以大約0.15至大約0.5M的濃度存在。
[0155]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子改性劑為鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子改性劑為堿金屬或堿土金屬與鹵素的鹽。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述鹽為堿金屬或堿土金屬的氯化物鹽，例如NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述鹽以大約
0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1.0的體積摩爾濃度存在。
[0156]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH梯度從大約pH3.9至大約pH4.5 ;在另一個(gè)實(shí)施方案中，從大約pH4.0至大約pH4.4 ;和在另一個(gè)實(shí)施方案中，從大約pH4.1至大約pH4.3。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述梯度為線性梯度。
[0157]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH梯度為階梯式梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給經(jīng)平衡的A蛋白柱(例如，在PBS或另一種合適的緩沖液或液體中進(jìn)行平衡)應(yīng)用大約ρΗ3.9，大約ρΗ4.0，大約ρΗ4.1，大約ρΗ4.2，大約ρΗ4.3，或大約ρΗ4.4的階梯。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述階梯為大約ΡΗ4.2。
[0158]在一個(gè)實(shí)施方案中，包含異源二聚IgG CH3結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體在一個(gè)或多個(gè)基本上沒有非異源二聚IgG的級(jí)分中從A蛋白支持物上洗脫。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，洗脫出的雙特異性抗體級(jí)分包含少于總蛋白質(zhì)的大約I重量％，0.5重量％，或0.1重量％的非異源二聚抗體。
實(shí)施例
[0159]給出下列實(shí)施例以便給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員描述如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物，但不意欲限制發(fā)明人認(rèn)為是其發(fā)明的范圍。已作出了努力以確保關(guān)于所使用的數(shù)字(例如，量、溫度等)的準(zhǔn)確度，但應(yīng)當(dāng)說明一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，和壓力處于或接近大氣壓。
[0160]實(shí)施例1:雙特異性IL_4Ra / IL_6Ra抗原結(jié)合蛋白
[0161]發(fā)現(xiàn)兩個(gè)已知的人IgGl同種型抗體(一個(gè)針對(duì)IL_4Ra，和一個(gè)針對(duì)IL_6Ra)具有僅相差四個(gè)氨基酸的輕鏈。共表達(dá)實(shí)驗(yàn)揭示了，抗_IL-4Ra抗體的輕鏈可以用來自IL-6Ra的輕鏈替換并仍然保持對(duì) 于IL_4Ra的高親和力結(jié)合，由此使得使用抗_IL-4Ra重鏈和抗-1L-6Ra重鏈以及相同的輕鏈來產(chǎn)生雙特異性抗體是可行的。因此，將IL-6Ra抗體的重鏈修飾為Fe AAdp形式(即CH3 二肽修飾H95R / Y96F，根據(jù)MGT外顯子編號(hào))。
[0162]然后，將抗-1L_6Ra輕鏈與抗_IL4Ra / Fe重鏈和抗_IL6Ra /FcA Adp重鏈在CHO細(xì)胞中共表達(dá)，并且使來自這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基經(jīng)歷蛋白A層析。在用包含同源二聚體和異源二聚體的混合物的細(xì)胞上清液加載A蛋白柱后，用pH階梯式梯度來進(jìn)行洗脫，所述PH階梯式梯度通過改變兩種緩沖液(A:1OOmM檸檬酸鈉，150mM NaCl，pH6.0 JPB:100mM檸檬酸鈉，150mM NaCl，pH3.0 ;參見，圖4)的組合以便產(chǎn)生分別在pH6.0、pH4.2和pH3.0處的三個(gè)相而產(chǎn)生。在圖4中，IL-4R表示抗-1L-4Ra，和IL-6RA表示抗_IL_6Ra (IgGl Λ Adp)。就與IL-6Ra和IL-4Ra蛋白的結(jié)合來對(duì)所示的柱級(jí)分進(jìn)行檢定(參見，圖5)。進(jìn)行階梯式洗脫，從而引起在PH4.2處洗脫的一個(gè)峰，和在pH3.0處的第二個(gè)峰(圖4)。BIAC0RE?分析顯示，如所預(yù)期的，流過材料可以結(jié)合可溶性IL-6Ra，但不結(jié)合IL-4Ra(圖5)。相應(yīng)于pH4.2峰的級(jí)分可以結(jié)合大約相等量的IL-6Ra和IL_4Ra，這與異源二聚體相一致。在pH3.0處洗脫的峰僅可以結(jié)合IL-4Ra，而不結(jié)合IL-6Ra，這相應(yīng)于所預(yù)期的抗-1L-4Ra同源二聚體。這確立了，用簡(jiǎn)單的pH階梯式梯度，通過使用A蛋白層析可以有效地分離異源二聚雙特異性抗體。
[0163]實(shí)施例2:Fe Λ Adp蛋白的藥物代謝動(dòng)力學(xué)
[0164]為了測(cè)試FcAAdp修飾是否影響包含異源二聚Fe / FcAAdp的分子的藥物動(dòng)力學(xué)，給小鼠注射經(jīng)純化的上面所描述的抗-1L-4Ra /抗-1L-6Ra的異源二聚種類，并且在28天的時(shí)間段內(nèi)測(cè)量血清中人免疫球蛋白的濃度(圖6 ;表1)。所述異源二聚體的血清半壽期為大約10天，這與野生型的半壽期類似。這確立了，F(xiàn)cAAdp修飾對(duì)于血清半壽期沒有
可檢測(cè)的影響。
[0165]
【權(quán)利要求】
1.制備抗原結(jié)合蛋白的方法，其包括: a.讓哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白，其包含: 包含識(shí)別第一表位的第一可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含第一 CH3區(qū)的免疫球蛋白恒定區(qū)，該第一 CH3區(qū)為選自IgGl、IgG2和IgG4的人IgG的CH3區(qū)，其中所述第一 CH3區(qū)與A蛋白結(jié)合； 包含識(shí)別第二表位的第二可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第二免疫球蛋白重鏈包含第二 CH3區(qū)的免疫球蛋白恒定區(qū)，該第二 CH3區(qū)為選自IgGl、IgG2和IgG4的人IgG的CH3區(qū)，其中所述第二 CH3區(qū)中包含根除或減少與A蛋白的結(jié)合的修飾； 與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對(duì)的免疫球蛋白輕鏈；和 b.使用A蛋白將所述免疫球蛋白作為抗原結(jié)合蛋白分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈?zhǔn)侨薎gG重鏈。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈?zhǔn)侨薎gGl重鏈。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白輕鏈為人免疫球蛋白輕鏈。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾選自MGT外顯子編號(hào)系統(tǒng)中的(a)95R，和(b)95R和96F，或者EU編號(hào)系統(tǒng)中的(a，)435R，和(b，)435R和436F。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二CH3區(qū)還包含I至5個(gè)選自下列的修飾:MGT編號(hào)系統(tǒng)中的 16E、18M、44S、52N、57M 和 821，或者 EU 編號(hào)系統(tǒng)中的 356E、358M、384S、392N、397M 和 4221。
7.權(quán)利要求1的方法，其中相比于缺乏所述修飾的相應(yīng)的抗原結(jié)合蛋白，所述修飾不改變或基本上不改變所述抗原結(jié)合蛋白的血清半壽期。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗原結(jié)合蛋白的第二CH3區(qū)在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞選自以下組:CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，Hela細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，和視網(wǎng)膜細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中在包含A蛋白的固體支持物上分離所述抗原結(jié)合蛋白。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述固體支持物包括A蛋白親和柱，并且使用pH梯度來分離所述抗原結(jié)合蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述pH梯度為包含一個(gè)或多個(gè)位于pH3和pH5之間的PH階梯的階梯式梯度。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗原結(jié)合蛋白在大約pH3.9到大約pH4.4之間洗脫。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗原結(jié)合蛋白在大約pH4.2洗脫。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈分別由第一和第二核酸序列編碼，其中所述第一和第二核酸序列各自從基因改造的小鼠獲得。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一個(gè)或多個(gè)人重鏈可變區(qū)核酸序列。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞引入 (a)編碼所述第一免疫球蛋白重鏈的第一核酸序列； (b)編碼所述第二免疫球蛋白重鏈的第二核酸序列；(C)編碼與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對(duì)的免疫球蛋白輕鏈的第三核酸序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中使用載體或攜帶所述核酸序列的病毒將所述第一，第二和第三核酸序列引入所述細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中 (a)所述第一和第二核酸序列在同一個(gè)載體或病毒上； (b)所述第一和第三核酸序列在同一個(gè)載體或病毒上；或 (C)所述第一,第二和第三核酸序列在同一個(gè)載體或病毒上。
21.提供相對(duì)于A蛋白異源二聚的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的方法，其包含步驟: 提供第一免疫球蛋白重鏈，所述第一免疫球蛋白重鏈為修飾的免疫球蛋白重鏈，所述修飾的免疫球蛋白重鏈與特異性針對(duì)第一表位的抗體中的第一參考重鏈相比除了包含殘基435和436的替換之外其氨基酸序列與第一參考重鏈相同，所述修飾的免疫球蛋白重鏈表現(xiàn)出相對(duì)于所述參考重鏈的降低的A蛋白結(jié)合； 提供第二免疫球蛋白重鏈，其氨基酸序列與特異性針對(duì)第二表位的抗體中的第二參考重鏈相同； 提供與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對(duì)的第一和第二免疫球蛋白輕鏈； 所述提供使得所述重鏈和輕鏈裝配在一起形成雙特異性抗體，其同時(shí)與所述第一表位和第二表位結(jié)合并且相對(duì)于A蛋白異源二聚。
【文檔編號(hào)】C07K16/46GK103833855SQ201410072042
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2009年6月26日
【發(fā)明者】S·戴維斯, E·史密斯, D·邁克多納德, K·L·奧森 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司