一種抗氧化多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法，該方法以小球藻蛋白為原料，通過酸性蛋白酶的酶解，分離純化得到抗氧化多肽，其氨基酸全序列為：aviknyya。本發(fā)明消除了天然抗氧化劑的缺陷并且消除了公眾對(duì)人工合成抗氧化劑的憂慮，為開發(fā)基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種抗氧化多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]生物分子的氧化是一個(gè)自由基介導(dǎo)的過程，它會(huì)對(duì)食品和生物系統(tǒng)造成許多不利的影響。在好氧器官內(nèi)，與動(dòng)脈硬化、癌癥等多中疾病相關(guān)的游離自由基會(huì)不可避免地隨著氧代謝的過程而產(chǎn)生。在食品中，食品營養(yǎng)成分的氧化會(huì)產(chǎn)生過氧化物，其不僅會(huì)影響食品的營養(yǎng)價(jià)值，引起食品品質(zhì)下降，嚴(yán)重的甚至還會(huì)導(dǎo)致攝入者的身體發(fā)生疾病。因此，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產(chǎn)生一直是生化營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于BHT、TBHQ等化學(xué)合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價(jià)格，因此其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑對(duì)人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作用，從而引起了人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂，并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。α -生育酚是一種被最普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩(wěn)定性，但是卻不利于食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來源的安全的天然抗氧化劑。
[0003]多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，使蛋白質(zhì)具有一定的生理功能。在人類的生命活動(dòng)中，肽在體內(nèi)的消化吸收優(yōu)于游離的氨基酸，且有著區(qū)別于氨基酸的體內(nèi)輸送體系。某些短肽在提供人體生長、發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還能夠防病治病，調(diào)節(jié)人體機(jī)能，這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，很多不同來源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
[0004]我國擁有豐富的微藻資源，但是由于資源利用率低，加工過程產(chǎn)生的下腳料浪費(fèi)等原因造成資源浪費(fèi)，甚至是環(huán)境污染。微藻中含有大量蛋白質(zhì)，且其組成均衡，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)資源進(jìn)行深加工，合理的選用酶類等，通過工藝優(yōu)化生物活性肽的產(chǎn)品得率將使得生物活性肽的研究具有更廣闊的前景。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法，使抗氧化活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。
[0007]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: 一種抗氧化多肽，所述抗氧化多肽的氨基酸序列為:aviknyya。
[0008]一種抗氧化多肽的制備方法，以小球藻為原料提取蛋白，然后采用酸性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽。
[0009]所述酶解條件為:pH為3.0、溫度50°C、酶解時(shí)間為5h、酶-底物配比為3000U/g ；所述酶為酸性蛋白酶。
[0010]所述分離純化的方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
[0011]所述分離純化的具體步驟為:
(1)酶解產(chǎn)物首先利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分尚，將其分為3個(gè)分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分；
(2)收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S^hadexC-25陽離子交換色譜進(jìn)行分離，上樣后洗去未吸附組分，再以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，在225nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性；
(3)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用S^hadexG_50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，在225nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性；
(4)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm ;洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為61%乙腈和39 %水處的洗脫峰，得到所需抗氧化多肽；利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
[0012]本發(fā)明立足于尋找一種天然高效的抗氧化劑，以來自于小球藻蛋白為出發(fā)點(diǎn)，通過酸性蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。
[0013]本發(fā)明改變了現(xiàn)有抗氧化劑的提取與運(yùn)用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化劑所可能引起的副作用，是一種天然抗氧化劑，可以取代傳統(tǒng)的合成抗氧化劑。并且本發(fā)明還改善了我國對(duì)微藻蛋白利用率偏低的情況，既可解決大量微藻資源的高效利用問題，又能解除消費(fèi)者對(duì)抗氧化劑在食品安全方面的顧慮，對(duì)科技、經(jīng)濟(jì)和食品業(yè)的發(fā)展將具有深遠(yuǎn)的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為抗氧化多肽的RP-HPLC圖譜。
[0015]圖2為純化的抗氧化多肽清除DPPH自由基的“量-效”關(guān)系曲線。
[0016]圖3為純化的抗氧化多肽清除ABTS自由基的“量-效”關(guān)系曲線。
[0017]圖4為純化的抗氧化多肽抑制Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白多不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的“量-效”關(guān)系曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]制備方法如下:
(I)小球藻蛋白的提取
本發(fā)明所采用的小球藻蛋白為異樣發(fā)酵獲得。
[0019]小球藻蛋白質(zhì)提取工藝條件為:將小球藻清洗3-5次，超聲波(加入吐溫，濃度0.1%，)破碎，浸提。浸提pH為8.0，料液比為20:1 (重量比)。浸提時(shí)間6h，離心1000Og20分鐘，收集上清液，經(jīng)過濾、濃縮和冷凍干燥后得到小球藻蛋白。
(2)小球藻蛋白的酶解
酶購自上海生物試劑公司(中國.上海)。
[0020]采用酸性蛋白酶酶解小球藻蛋白，蛋白濃度為30mg/ml，酶解條件取pH為3.0、溫度50°C、酶解時(shí)間為5h、酶與底物比為(3000U/g)，用2M HCl調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定，水解5h后，沸水浴中滅酶15min,然后迅速冷卻至室溫,置于離心機(jī)中，以4000r/min離心15min,取上清液備用。
[0021 ](3)酶解產(chǎn)物的分離、純化
將得到的酶解產(chǎn)物利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分尚，將其分為3個(gè)分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分；收集具有最佳抗氧化活性的組分，再經(jīng)過SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜(長20cm,直徑1.6cm)進(jìn)行分離，以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min,在225nm下進(jìn)行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰,再用Sephadex G-50 (長IOOcm,直徑2.6cm)凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測波長為225nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水(v/V)的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，得到本發(fā)明的高純度的特異性抗氧化多肽。
[0022](4)抗氧化多肽的氨基酸序列測定
利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA, U.S.A)測定本發(fā)明的抗氧化多肽的氨基酸全序列。
[0023]( 5 )抗氧化活性的測試
a) DPPH自由基清除能力的測定
利用DPPH (I, l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為I X 10_5mOl/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2mL，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。
[0024]清除率(％)=〔1-(A1- Aj)/A0) X 100%
式中，Atl為2 mL,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品溶劑，空白對(duì)照.Α為2mL，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品；A」為2mL的無水乙醇+2 mL的樣品。
[0025]b) ABTS自由基清除活性的測定
以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12~16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2 mol/L,pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取
0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30s，暗處反應(yīng)10 min，然后在734nm下測定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。
[0026]清除率(%)= (A0- Aj) /A0X 100%
式中，Atl為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL蒸餾水混合液的吸光值；A」為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL酶解液混合液的吸光值。
[0027]c)抗脂質(zhì)體過氧化活性的測定
用等體積新鮮的雞蛋卵黃和磷酸緩沖液(pH7.4，0.lmol/L)混合，使用前稀釋25倍并用磁力攪拌機(jī)攪拌均勻。在試管中分別加入2.4ml卵黃稀釋液、2.4ml 25mmol/LFeSO4.H20,200 μ L水解液樣品，混勻后在37°C下水浴4h，加入0.8ml 50%三氯乙酸和2mlTBA,混勻后在95°C恒溫30min。冷卻至室溫后,8000r/min離心20min,取上清液于532nm下測定吸光值。以蒸餾水代替水解液作為空白。
[0028]抑制率(%)=( (A0- Aj)/A0) X 100%
式中，Atl為空自對(duì)照組的吸光度；Α]為樣品組的吸光度。
[0029]為了進(jìn)一步了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例:
實(shí)施例1
稱取7.5克小球藻蛋白 用去離子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L HCl將其pH調(diào)節(jié)至3.0。先將該溶液水浴加熱到50°C，接著再按照酶-底物配比為3000U/g的比例加入相應(yīng)量的酶，酶解時(shí)間為5小時(shí)。接著在沸水浴中滅酶15分鐘，冷卻后再4000rpm離心15分鐘。收集上清液備用。
[0030]將上清液用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜進(jìn)行超濾分離，將其分為3個(gè)分子量范圍不同的組分，分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分，并測定其抗氧化活性。分子量小于3500Da的組分具有最好的抗氧化活性。
[0031]收集分子量小于3500Da的組分，用SP-S^hadex C-25陽離子交換色譜(長20cm，直徑1.6cm)進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量，收集各峰并測定抗氧化活性。
[0032]將分離出來的抗氧化活性最明顯的組分峰用S印adex G-50凝膠過濾色譜(長20cm,直徑1.6cm)再進(jìn)行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.5ml/min,洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量。收集各峰并測定抗氧化活性。
[0033]將分離出來的最好的抗氧化活性組分利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集61%乙腈和39 %水&八)處的洗脫峰，得到本發(fā)明的高純度的特異性抗氧化多肽，如圖1所示，T峰為該抗氧化多肽的色譜峰。得到高純度的抗氧化肽。
[0034]純化后的抗氧化多肽具有很強(qiáng)的抗氧化能力，由圖2、圖3和圖4可以看出，它具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的能力。
[0035]利用蛋白質(zhì)固相測序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA, U.S.A)測定純化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列為:aviknyya。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗氧化多肽，其特征在于:所述抗氧化多肽的氨基酸序列為:aviknyya。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種抗氧化多肽的制備方法，其特征在于:以小球藻為原料提取蛋白，然后采用酸性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法，其特征在于:所述酶解條件為:pH為3.0、溫度50°C、酶解時(shí)間為5h、酶-底物配比為3000U/g ;所述酶為酸性蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的具體步驟為: (1)酶解產(chǎn)物首先利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分尚，將其分為3個(gè)分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分； (2)收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S^hadexC-25陽離子交換色譜進(jìn)行分離，上樣后洗去未吸附組分，再以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，在225nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性； (3)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用S^hadexG_50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，在225nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性； (4)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm ;洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為61%乙腈和39 %水處的洗脫峰，得到所需抗氧化多肽；利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103804476SQ201410079701
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】汪少蕓, 王文龍, 張毓琛, 趙立娜, 方衛(wèi)東, 邵彪, 江勇 申請(qǐng)人:福州大學(xué)