一種人工合成的sp系列多肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類SP系列多肽及其在治療癌癥方面的用途，具體氨基酸序列如SEQ?ID:1-11所示。SP系列多肽可治療慢性髓細(xì)胞性白血病，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)PP2A活性，去磷酸化BCR/ABL，從而起到治療白血病的作用，并且此多肽對(duì)伊馬替尼耐藥的白血病同樣有效。SP系列多肽通過(guò)SET/PP2A途徑發(fā)揮作用，具有廣泛的治療癌癥的用途。
【專利說(shuō)明】—種人工合成的SP系列多肽及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及多肽的用途，即SP系列多肽具有治療癌癥的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)，亦稱慢性粒細(xì)胞白血病(CGL)，是一類起始于骨髓內(nèi)形成血液的細(xì)胞發(fā)生癌變，并浸潤(rùn)血液的癌癥?；糃ML后，白血病細(xì)胞在體內(nèi)聚集需要很長(zhǎng)時(shí)間，許多患者在幾年內(nèi)甚至沒(méi)有任何癥狀。與此同時(shí)，癌細(xì)胞浸潤(rùn)機(jī)體其他組織器官，包括脾臟。CML亦可轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞迅速生長(zhǎng)的急性白血病，其癌細(xì)胞可以快速浸潤(rùn)機(jī)體各個(gè)器官。任何造血細(xì)胞或者淋巴樣細(xì)胞都可以轉(zhuǎn)變成白血病細(xì)胞。一旦產(chǎn)生這樣的變化，這些白血病細(xì)胞就不能進(jìn)行正常的成熟程序。一些白血病細(xì)胞可能增殖速度加快，但大多數(shù)情況下，在特定時(shí)間卻不會(huì)死亡。它們繼續(xù)存活并聚集起來(lái)，經(jīng)常排擠正常的骨髓細(xì)胞，導(dǎo)致血紅細(xì)胞數(shù)量驟減。隨著時(shí)間的推移，白血病細(xì)胞浸潤(rùn)周邊細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至其他組織，從而影響機(jī)體相關(guān)功能。
[0003]患CML的病例占總白血病病例的10%左右，男性患這種疾病的可能性略高于女性，且白種人患病可能性高于非裔美國(guó)人?；糃ML的患者年齡大約在64歲，幾乎半數(shù)以上患者年齡在65歲及以上。大多數(shù)CML發(fā)生于成人間，極少數(shù)發(fā)生于兒童間，一般而言，對(duì)兒童的治療與成人類似。2014年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布約有5980患者確診為CML(3130名男性患者和2850名女性患者)，其中約810人死亡(550名男性患者和260名女性患者)。
[0004]CML的癥狀 通常比較模糊，且經(jīng)常由其他原因引起，包括:虛弱、疲勞、盜汗、體重減輕、發(fā)燒、骨痛、脾擴(kuò)大(感覺(jué)左側(cè)胸廓有異物)、腹部有疼痛感或者腫脹感和吃少量食物就感覺(jué)有飽腹感。但是這些并不只是CML會(huì)出現(xiàn)的癥狀，它們也會(huì)出現(xiàn)在其他癌癥癥狀中，或者非癌癥的疾病中。
[0005]許多CML患者在被確診時(shí)都未出現(xiàn)任何癥狀。白血病通常是患者在做其他非相關(guān)的疾病檢查中發(fā)現(xiàn)，而且即使已有部分癥狀，它們經(jīng)常是模糊的且非特異性的。通常會(huì)做全血檢查，CML患者通常體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量增多，且含有許多未成熟的細(xì)胞。有時(shí)患者體內(nèi)紅細(xì)胞和血小板的數(shù)量會(huì)降低，盡管這些癥狀表明是白血病，患者一般仍要進(jìn)行其他血液和骨髓檢查以便確診。
[0006]對(duì)CML的治療主要包括以下幾個(gè)方面:靶向治療、免疫治療、化學(xué)治療、放射性療法、手術(shù)、干細(xì)胞移植，其中靶向治療是主要手段。
[0007]常用的化學(xué)治療通常指任何能治療癌癥的藥物，在這里主要是指常規(guī)的細(xì)胞毒藥物，主要通過(guò)口服或者注射的方式進(jìn)入人體血液循環(huán)，殺死那些增殖分化迅速的細(xì)胞。然而體內(nèi)生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞不僅有癌細(xì)胞，正常細(xì)胞中也有，如骨髓內(nèi)細(xì)胞、口腔及腸內(nèi)細(xì)胞及毛囊內(nèi)細(xì)胞等，它們通常也會(huì)被化療藥物攻擊，從而導(dǎo)致脫發(fā)、口腔潰瘍、惡心嘔吐、易瘀紫出血、疲勞等副作用?，F(xiàn)在通常用于輔助靶向藥物治療，或者在靶向藥物失去藥用效果后使用。[0008]CML細(xì)胞內(nèi)存在名為BCR-ABL的癌基因，是由9位、22位染色體重排導(dǎo)致的，在正常細(xì)胞中并不存在。這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄翻譯成BCR-ABL蛋白，會(huì)導(dǎo)致CML細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖超出控制。BCR-ABL是一類酪氨酸激酶蛋白，如今，靶向BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)藥物是治療CML的首選藥物。這些藥物對(duì)正常細(xì)胞影響甚微，所以它們的副作用較之其他用于治療CML的藥物要小得多，例如化學(xué)藥物或干擾素。常用的靶向藥物如下所示:
伊馬替尼(格列衛(wèi))是第一個(gè)靶向BCR-ABL的藥物，很快成為治療CML的首選藥物，以第一代酪氨酸激酶抑制劑成名。幾乎所有的CML患者都對(duì)伊馬替尼治療有應(yīng)答，大多數(shù)患者能生活許多年。但這個(gè)藥物并不能完全治好白血病，所以需要患者每日服用，直到失去治療效果。對(duì)于有些患者，伊馬替尼最終失去治療功能，這就是所謂的伊馬替尼耐藥。伊馬替尼耐藥主要是CML細(xì)胞內(nèi)某些基因突變導(dǎo)致的，有些耐藥可以通過(guò)加大用藥量解決，但有些需要另一種藥物，這就引入TKIs第二代產(chǎn)品——達(dá)沙替尼/尼羅替尼。它們通常用于伊馬替尼耐藥或者伊馬替尼副作用患者不能忍受的情況，不過(guò)仍然具有很大的副作用，且用藥劑量要高于伊馬替尼。普納替尼是最新的靶向BCR-ABL的TKIs產(chǎn)品。當(dāng)所有其他TKIs產(chǎn)品失去作用時(shí)，才使用普納替尼進(jìn)行CML治療?；蛘弋?dāng)CML細(xì)胞內(nèi)發(fā)生T315I突變時(shí)，也采用普納替尼進(jìn)行治療。T315I突變通常發(fā)生于長(zhǎng)期使用其他TKIs產(chǎn)品治療CML產(chǎn)生耐藥性后，目前為止，有且僅有普納替尼能夠繼續(xù)治療此耐藥行為。但是，普納替尼對(duì)患者身體的副作用相當(dāng)嚴(yán)重，除了常見的虛弱、頭痛、腹痛、疹子或其他皮膚病外，還會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生血塊，容易導(dǎo)致心臟病、中風(fēng)及阻塞四肢動(dòng)脈靜脈等。更嚴(yán)重的是此藥物會(huì)使心臟肌肉萎縮，將導(dǎo)致胰腺炎、肝臟衰竭和充血性心力衰竭等。
[0009]因此，現(xiàn)今急切需要一種新的作用機(jī)制的藥物，能夠安全有效治療CML。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]C0G133是第一個(gè)抗炎癥和神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的多肽，來(lái)源于人體內(nèi)載脂蛋白(apoE)受體結(jié)合區(qū)域133-149位氨基酸序列。C0G112是C0G133的N端融合了源于果蠅屬觸角蛋白的蛋白轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(PTD)序列形成的融合肽，生物活性較C0G133大大提高。ApoE系列多肽即具有apoE蛋白133-149位氨基酸序列的多肽，此前研究發(fā)現(xiàn)其具有治療紊亂性疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥、外傷性腦損傷、炎性腸病、腦缺血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默癥和其他大腦神經(jīng)紊亂。
[0011]本發(fā)明通過(guò)對(duì)C0G133進(jìn)行多肽改造，人工合成了一系列SP系列多肽，如下所示: C0G133 Ac-LRVRLASHLRKLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:1)
SP2 Ac-LRVRLASVLRKLVKRLL-NH2 (SEQ ID NO:2)
SP2 Ac-LRVRLASHLRkLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:3)
SP4 Ac-LRVRLASHLRKLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:4)
SP5 Ac-LRVRLASHLRkLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:5)
SP6 Ac-LRVRLASHLrKLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:6)
SP7 Ac-LRVRLASHLRKLrKRLL-NH2 (SEQ ID NO:7)
SP8 Ac-LRVRLASHLrKLrKRLL-NH2 (SEQ ID NO:8)
SP9 Ac-ASHLRkLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:9)
SPlO Ac-ASHLRKLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:10)CU063 Ac-LRVRLASVLRKLVkRLL-NH2 (SEQ ID NO:11)
其中小寫k表示D型賴氨酸，小寫r表示D型精氨酸，Ac表示乙酰化羧基端。
[0012]對(duì)于⑶063，本發(fā)明期望通過(guò)引入D型氨基酸，能延緩多肽降解，在體內(nèi)獲得更長(zhǎng)半衰期來(lái)獲得更好的藥理活性。
[0013]本發(fā)明提供了用于治療白血病的方法，包括將至少一種SP系列多肽與所述肽不存在時(shí)會(huì)發(fā)生的相比減少疾病癥狀的量施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述白血病是慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)。SET，亦被稱為I2PP2A，是一個(gè)有效的生理水平上的PP2A抑制劑。SET在CML細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)并且抑制PP2A活性，維持癌基因BCR/ABL激酶處于持續(xù)激活狀態(tài)。加入SP系列多肽后，可以激活CML細(xì)胞內(nèi)部PP2A活性，去磷酸化相關(guān)細(xì)胞增殖和存活的調(diào)節(jié)物，從而抑制BCR/ABL激酶活性，達(dá)到減少白血病產(chǎn)生的目的。此機(jī)制與酪氨酸激酶抑制劑(伊馬替尼、達(dá)沙替尼)作用機(jī)制不一樣，后者是直接作用于BCR/ABL激酶，會(huì)受此激酶突變而影響藥物活性。因此，SP系列多肽具有治療Bcr/Abl基因突變的CML的能力。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SP系列多肽在受處理的細(xì)胞中增加PP2A的活性。PP2A是一個(gè)重要的絲蘇氨酸磷酸酶，是一個(gè)異質(zhì)三聯(lián)體，包括兩個(gè)常見組分，一個(gè)催化亞基(PP2Ac)和一個(gè)支架亞基(PP2A A)組成催化中心二聚體，同時(shí)連接著一個(gè)由四種不同家族基因編碼的調(diào)節(jié)B亞基。PP2A可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)大多生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育和遷移。PP2A活性的喪失或者受抑制會(huì)導(dǎo)致PP2A嚴(yán)重失去抑制腫瘤的功能。本發(fā)明人有理由相信SP系列多肽可減少一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀，包括但不僅限于腫瘤形成、腫瘤生長(zhǎng)、癌細(xì)胞數(shù)、癌細(xì)胞向健康組織的擴(kuò)散以及減少的存活。SP系列多肽可用于治療多種白血病(急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病等)、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、皮膚癌(黑色素瘤和非黑色素瘤)、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、腎細(xì)胞癌、胃癌、食道癌、肝癌、淋巴瘤和肉瘤等。
`[0015]本發(fā)明的多肽可通過(guò)如本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明的肽可附加多種標(biāo)記部分如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記以供檢測(cè)和示蹤。熒光標(biāo)記包括但不僅限于熒光素、曙紅、羅丹明、香豆素和NBD熒光團(tuán)等。
[0016]對(duì)本文中公開的肽的修飾以增強(qiáng)與這些肽相關(guān)的功能活性可容易的由本領(lǐng)域技術(shù)人員達(dá)成。例如，用于本發(fā)明方法中的肽可經(jīng)化學(xué)修飾或偶合于其他分子以增強(qiáng)如溶解性、血清穩(wěn)定性等參數(shù)，而保留功能活性。具體而言，本發(fā)明的肽可在N-端乙?；?或在C-端酰胺化，或偶合、復(fù)合或融合于增強(qiáng)其血清穩(wěn)定性的分子，包括但不僅限于白蛋白、免疫球蛋白及其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)體、PEG和右旋糖酐等。
[0017]本發(fā)明的肽不僅包括所有公開的SP系列多肽的氨基酸序列，同時(shí)還還包括那些通過(guò)例如同源重組、定點(diǎn)或PCR誘變，以及其他動(dòng)物物種的相應(yīng)肽，其中所述動(dòng)物物種包括但不僅限于兔、大鼠、豬、牛、羊、馬和非人靈長(zhǎng)類物種，和包括其中的肽用除了天然存在的氨基酸之外的部分經(jīng)取代、化學(xué)、酶或其他合適手段而共價(jià)修飾的衍生物。
[0018]本發(fā)明公開的SP系列多肽，包括但不僅限于SP系列多肽及其衍生物，還可為游離形式或鹽形式，其中所述鹽是藥學(xué)上可接受的。這包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳等的無(wú)機(jī)鹽。還可用包括但不僅限于乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水楊酸等制備所述肽的多種有機(jī)鹽。
[0019]本發(fā)明公開的SP系列多肽可與藥學(xué)上可接受的載體組合。所述載體可為液體，從而使得該組合物適用于腸胃外施用，或可為固體，即配制用于口服的片劑或丸劑。此外，所述載體可為可噴霧的液體或固體形式，從而使得所述組合物適用于吸入。本發(fā)明的肽還可配制為供局部施用，例如乳膏或凝膠的形式，局部制劑對(duì)于治療皮膚癌特別有用。
[0020]本發(fā)明公開的SP系列多肽可通過(guò)不同途徑對(duì)人體給藥，具體的給藥途徑包括口月艮、非胃腸道給藥、口腔吸入、直腸給藥、鼻腔給藥、舌下給藥及通過(guò)植入性容器給藥。非胃腸道給藥又包括在皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、損傷部位內(nèi)和顱內(nèi)注射或浸滲。
[0021]本發(fā)明公開的SP系列多肽在用于人體疾病預(yù)防和治療時(shí)，所用的劑量受多種因素的影響，這些因素包括年齡、體重、健康狀況、性別、種族、飲食習(xí)慣、給藥時(shí)間、排尿頻率及是否使用其他藥物，等等。
[0022]本發(fā)明的肽可單獨(dú)用于治療癌癥或與其他通常用于治療癌癥的治療劑組合使用，所述治療劑例如化療劑(苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺)，皮質(zhì)類固醇(潑尼松、潑尼松龍)，氟達(dá)拉濱，噴司他丁，克拉屈濱，伊馬替尼，達(dá)沙替尼，激素療法等。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖 1C0G133、SP2、CU063 多肽作用 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細(xì)胞株 72h的細(xì)胞毒性。
[0024]圖 2C0G133、SP2、CU063 多肽于 24h、48h、72h 分別對(duì) K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。
[0025]圖3C0G133、SP2 多肽對(duì) K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細(xì)胞株作用后，細(xì)胞內(nèi)SET, PP2A-C, BCR-ABL, p-BCR-ABL 等蛋白的表達(dá)情況。
[0026]圖4C0G133、SP2多肽及其分別與岡田酸(OA)聯(lián)用，作用于K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I細(xì)胞株后，細(xì)胞內(nèi)PP2A的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0027]列出下述實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0028]實(shí)施例1:
BCR-ABL融合會(huì)產(chǎn)生一個(gè)重達(dá)p210或pl80的蛋白質(zhì)(P為計(jì)量細(xì)胞內(nèi)蛋白的質(zhì)量單位，相當(dāng)于KDa)。選用具有T315I突變的伊馬替尼耐藥株——鼠源BaF3p210T315I細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞毒性篩選。
[0029]檢測(cè)C0G133、SP2-SP10、CU063 等多肽對(duì) K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 等細(xì)胞作用24h、48h、72h的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。
[0030]實(shí)驗(yàn)步驟:
1向 96 孔板中接種 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細(xì)胞(每孔 2.5-4X103 個(gè)細(xì)胞)，12-18h后每孔加入100 μ I含有多肽的培養(yǎng)基，多肽的最大濃度為64 μ Μ，濃度2倍遞減。
[0031]2待多肽作用24h、48h、72h后，將板從培養(yǎng)箱取出，室溫下放置30min后，加入CellTiter Glo Reagent (試劑于室溫下平衡,96孔板每孔加入25 μ I),將板置于振蕩器上振蕩5min (300 - 500rpm),于室溫下放置IOmin-1h (具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類確定)。
[0032]3.讀數(shù)后求 IC5tl (Perkin Elemer2103Multipliable Reader)。[0033]在K562、BaF3p2IOffT細(xì)胞株中檢測(cè)C0G133、SP2-SP10多肽對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制率。
[0034]表1:K562/BaF3p210WT細(xì)胞株中多肽的活性篩選
【權(quán)利要求】
1.一種源于載脂蛋白的人工設(shè)計(jì)合成的多肽，稱為SP系列多肽，其氨基酸序列為SEQID NO: 1-11，具有治療癌癥的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征是，所述多肽的N端經(jīng)乙?；揎?、C端經(jīng)酰胺化修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌癥，是指白血病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白血病，是指慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，還包括那些通過(guò)例如同源重組、定點(diǎn)或PCR誘變，以及其他動(dòng)物物種的相應(yīng)肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，還包括以游離形式或者鹽形式存在的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，還包括可與藥學(xué)上可接受的載體組合的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，可單獨(dú)用于治療癌癥或與其他通常用于治療癌癥的治療劑組合使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的多肽，可通過(guò)不同途徑對(duì)人體給藥。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK103819554SQ201410088581
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】陳依軍, 王淑珍, 戴雯, 謝偉全 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)