一種韭菜籽抗氧化三肽及其制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于韭菜籽的抗氧化三肽的氨基酸序列、制備方法及其在生物醫(yī)藥和食品方面的應用。該抗氧化三肽序列為Gly-Ser-Gln（GSQ），體外實驗表明，該多肽可以有效清除DPPH、ABTS和超氧陰離子等自由基，同時對過氧化氫誘導正常肝細胞的損害具有保護作用。本發(fā)明所涉及的抗氧化三肽具有結構簡單、抗氧化活力強等特點，可作為現(xiàn)有人工合成抗氧化劑的優(yōu)良替代，對新型抗氧化保健品和藥物開發(fā)與應用方面具有重要價值。
【專利說明】一種韭菜籽抗氧化三肽及其制備與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種韭菜籽天然抗氧化三肽及其制備方法和在食品、生物制藥領域中的應用，屬于食品和生物醫(yī)學領域。
【背景技術】
[0002]我國是一個農業(yè)大國，農作物的種類繁多，但由于受加工技術條件的所限農作物的加工大都處于初級階段，其加工后的殘余物中仍有較大含量的蛋白質，而它們大多主要用于飼料工業(yè)或自然排放，不僅浪費了資源，同時也造成環(huán)境污染。植物活性肽概念的提出及分離檢測技術的提高，使人們開始逐漸重視對富含蛋白質的農副產品的深加工并從中獲得多種活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血壓肽和易消化吸收肽等，植物來源活性肽的研究和開發(fā)對提高我國農產品深加工的附加值具有重要作用。
[0003]抗氧化劑近些年來在國內外發(fā)展很快，用途也越來越廣。自從Harman提出自由基理論以來，人們認識到人體內氧化產生的自由基與人的衰老和許多疾病有關，因此抗氧化劑不僅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開發(fā)?？寡趸瘎┑姆N類很多，然而化學合成的抗氧化劑如BHA、BHT等，由于其本身具有毒副作用，各國政府紛紛對其強制規(guī)定了 ADI值控制其過量添加。于是人們把目光逐步轉向從各種植物和動物組織中提取天然抗氧化劑?？寡趸钚远嚯挠捎诘投尽⒏咝У忍攸c，作為食品和機體的抗氧化劑，被認為是人工合成抗氧化劑的理想替代者。
[0004]抗氧化肽能有效地清除體內過剩的活性氧自由基，保護細胞和線粒體的正常結構和功能，防止脂質過氧化的發(fā)生，而氧化與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的發(fā)病機理有關。適當攝入具有抗氧化活性的物質可以降低體內自由基水平，防止脂質過氧化，幫助機體抵御疾病。目前使用植物和動物蛋白為原料，制備抗氧化肽的專利也有很多，主要采用酶解蛋白質的方法制備抗氧化多肽，而直接分離純化得的抗氧化肽較為少見。
`[0005]韭菜籽為我國常見食用蔬菜百合科植物韭菜J77i應tuberosum Rottl干燥成熟的種子，韭菜籽(藥典中常稱為韭子)為我國傳統(tǒng)中藥品種，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品。據藥典記載，韭菜籽具有溫補肝腎、壯陽固精之功效。韭菜籽作為壯陽補腎用入藥在我國民間已有數(shù)千年的歷史。2002年我國衛(wèi)生部將其列為藥食兩用植物天然產物。韭菜籽這種植物種子資源在我國十分豐富，產量居世界首位。目前國內外一直以來對韭菜尤其是其種子韭菜籽的研究很少。國外還未對韭菜籽進行過化學成分和功效等方面的研究，國內化學成分方面的研究也并不多，迄今為止，對其活性多肽或藥理研究國內外都還幾乎沒有報道。因此，有必要充分利用我國十分豐富的韭菜(韭菜籽)植物資源，對其進行深入系統(tǒng)研究，為實現(xiàn)韭菜籽中藥現(xiàn)代化和開發(fā)新型、高效、安全的健康食品和藥品提供科學依據。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種韭菜籽抗氧化三肽，及其制備方法和在食品、生物制藥領域中的應用，為實現(xiàn)韭菜籽中藥現(xiàn)代化和開發(fā)新型、高效、安全的健康食品和藥品提供科學依據。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種韭菜籽抗氧化三肽，所述抗氧化三肽氨基酸序列為Gly-Ser-Gln。
[0008]所述多肽衍生物為抗氧化三肽的氨基酸被氨基化，或者環(huán)化，或者L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸。
[0009]韭菜籽抗氧化三肽的制備方法，從天然韭菜籽中分離純化或人工合成方法得到。
[0010]具體步驟包括如下:
1)韭菜籽抗氧化三肽的制備:韭菜籽經中藥粉碎機粉碎，按料液比1:10比例加入體積分數(shù)為10% ( K/K)醋酸溶液，超聲波輔助提取20 min，在室溫下攪拌提取8 h后，12000 rpm離心10 min，過濾取上清液，冷凍干燥，即為韭菜籽粗提物；
2)分離純化:取韭菜籽粗提物利用S^hadexG-50凝膠色譜進行分離，以去離子水為洗脫液，流速0.3 mL/min，測量洗脫組分214 nm波長處的吸光值，收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一步分離，RP-HPLC的洗脫梯度為0-5 min，體積分數(shù)為5% CV/V)乙腈；5~40 min，體積分數(shù)為5%~30% CV/V)乙腈；40_50 min，體積分數(shù)為30% (V/V)乙腈；流速為2.0 mL/min，檢測波長214 nm，收集體積分數(shù)為16% CV/V)乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗氧化三肽。
[0011]韭菜籽抗氧 化三肽在抗氧化保健品及藥物開發(fā)方面的應用。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
所述抗氧化三肽具有強活性，對DPPH，超氧陰離子和ABTS自由基都有強的清除作用，并對自由基誘導的細胞損傷具有保護作用，表明其在抗氧化活性開發(fā)和應用方面有重要價值。該抗氧化三肽的活性見實施實例2與實施實例3。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:韭菜籽提取物Sephedex G_50凝膠過濾色譜圖。
[0014]圖2:凝膠色譜洗脫峰2反相高效液相色譜圖。
[0015]圖3:抗氧化三肽的質譜圖。
[0016]圖4:韭菜籽抗氧化三肽對DPPH自由基清除作用。
[0017]圖5:韭菜籽抗氧化三肽對ABTS自由基清除作用。
[0018]圖6:韭菜籽抗氧化三肽對超氧陰離子自由基清除作用。
[0019]圖7:韭菜籽抗氧化三肽的還原力測定。
[0020]圖8:韭菜籽抗氧化三肽對肝細胞L02的保護作用(*/X0.05，# P<0.01)。
【具體實施方式】
[0021]本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于下述的實施實例。
[0022]實施例1
本發(fā)明所述抗氧化三肽的分離純化包括Sephadex G_50凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)兩個步驟。[0023]提取韭菜籽提取物:韭菜籽經高速中藥粉碎機粉碎，用10% ( V/V)乙酸浸泡，超聲波輔助提取20 min,在室溫下攪拌提取6 h, 12000 rpm離心15 min,取上清液冷凍干燥,-80°C低溫保存。
[0024]Sephadex G_50凝膠過濾色譜:按上述方法獲得韭菜籽提取物凍干粉，溶解于去離子水中，12000 rpm離心15 min。取上清液用0.22 μ m孔徑微濾膜過濾。Sephadex G-50凝膠柱(1.6cmX100 cm)用去離子水平衡，將已過濾的樣品上柱。用去離子水洗脫，流速0.3mL/min，于214 nm波長處檢測洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線，如圖1所示。收集洗脫峰峰2，冷凍干燥，-80 °(:低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0025]高效液相色譜:去離子水溶解上述峰2凍干粉，采用RP-HPLC進一步分離。液相色譜系統(tǒng)為 LC-20A,裝配 Gemini 5 μ C18 (250mmX 10mm)反相柱(Phenomenex, UK),用水和乙腈(含0.05% (K/K)三氟乙酸)構成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫。洗脫條件:0-5 min,5% CV/V)乙腈;5~40 min，5%~30% CV/V)乙腈;40_50 min, 30% CV/V)乙腈；洗脫流速 2.0mL/min，檢測波長214 nm，洗脫曲線如圖2所示。收集16% (K/K)乙腈濃度的洗脫峰CLP-2(保留時間為22.5^24.8 min)，冷凍干燥即為本發(fā)明所述抗氧化三肽。
[0026]將收集到的抗氧化組分CLP-2冷凍干燥，采用高效液相色譜檢驗所得到的組分純度。經檢測，該抗氧化肽組分純度達到95%，可測定其氨基酸序列。
[0027]用液相色譜與質譜連用(LC-MS/MS)方法測定氨基酸序列(圖3)，得到CLP-2的氨基酸序列GSQ。
[0028]實施例2
實施實例I中得到的天然抗氧化三肽活性進行研究:
DPPH自由基清除作用:0.4 mL不同濃度的樣品與等體積的4% (r/K)DPPH無水乙醇溶液充分混合，室溫下避光靜置30 min，于517 nm下測定吸光值。用去離子水和還原型谷胱甘肽代替樣品分別作空白對照和陽性對照。樣品的DPPH自由基清除活力按下列公式(1)計算:
【權利要求】
1.一種韭菜籽抗氧化三肽，其特征在于:所述抗氧化三肽氨基酸序列為Gly-Ser-Gln。
2.一種如權利要求1所述的一種韭菜籽抗氧化三肽的多肽衍生物，其特征在于:所述多肽衍生物為抗氧化三肽的氨基酸被氨基化，或者環(huán)化，或者L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸。
3.—種如權利要求1所述的韭菜籽抗氧化三肽的制備方法，其特征在于:從天然韭菜籽中分離純化或人工合成方法得到。
4.根據權利要求3所述韭菜抗氧化三肽的制備方法，其特征在于:具體步驟包括如下: 1)韭菜籽抗氧化三肽的制備:韭菜籽經中藥粉碎機粉碎，按料液比1:10比例加入體積分數(shù)為10% ( K/K)醋酸溶液，超聲波輔助提取20 min，在室溫下攪拌提取8 h后，12000 rpm離心10 min，過濾取上清液，冷凍干燥，即為韭菜籽粗提物； 2)分離純化:取韭菜籽粗提物利用S^hadexG-50凝膠色譜進行分離，以去離子水為洗脫液，流速0.3 mL/min，測量洗脫組分214 nm波長處的吸光值，收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一步分離，RP-HPLC的洗脫梯度為0-5 min，體積分數(shù)為5% CV/V)乙腈；5~40 min，體積分數(shù)為5%~30% CV/V)乙腈；40_50 min，體積分數(shù)為30% (V/V)乙腈；流速為2.0 mL/min，檢測波長214 nm，收集體積分數(shù)為16% CV/V)乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗氧化三肽。
5.一種如權利要求 1所述的一種韭菜籽抗氧化三肽在抗氧化保健品及藥物開發(fā)方面的應用。
【文檔編號】C07K5/083GK103864891SQ201410112774
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權日:2014年3月25日
【發(fā)明者】洪晶, 陳濤濤, 汪少蕓, 戶佩, 俞世宏 申請人:福州大學