高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，包括以下步驟：制備含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌；重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)后得到的菌體進(jìn)行超聲破碎得到包涵體；對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌；對(duì)洗滌后的包涵體進(jìn)行變性與復(fù)性，得到白細(xì)胞介素-24蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過對(duì)大腸桿菌生產(chǎn)白細(xì)胞介素-24培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得較疏松的白細(xì)胞介素-24包涵體結(jié)構(gòu)，提高了蛋白在高濃度下的復(fù)性的效率，同時(shí)，本發(fā)明方法使白細(xì)胞介素-24的變性效率和復(fù)性效率分別提高了50.52％和83.78％，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約了生產(chǎn)成本。這種通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來簡(jiǎn)化其純化過程的方法可適用于其它有類似包涵體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的蛋白。
【專利說明】高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生物工程下游蛋白質(zhì)的純化過程，尤其是涉及一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1995年哥倫比亞大學(xué)P.B.Fisher等用差示雜交的方法從人干擾素β和瑞香素(mezerein, MEZ)誘導(dǎo)的人類黑色素瘤細(xì)胞cDNA文庫中篩選得到一種新型細(xì)胞因子，命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因 _7 (melanoma differentiation-associated gene7, mda_7),因其在結(jié)構(gòu)、染色體定位、堿基序列同源性及細(xì)胞因子樣特性等方面與IL-10家族相近，被歸于IL-10家族，正式命名為白細(xì)胞介素-24(interleukin-24，IL-24)。MDA-7 / IL-24可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，但對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。另外，IL-24還具有抑制腫瘤血管形成和免疫激活作用，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和系統(tǒng)性腫瘤免疫過程中發(fā)揮作用。鑒于MDA-7 / IL-24的廣譜抗腫瘤特性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，其已成為抗腫瘤生物藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003]Introgen公司與德克薩斯大學(xué)M.D.Anderson Cancer Center合作開發(fā)的基因治療藥物重組復(fù)制缺陷的腺病毒_IL-24 (recombinant replication defectiveadenovirus-1L-24，Ad.1L-24)，商品名為INGN241，已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，其體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí)了 MDA-7 / IL-24顯著的抗腫瘤效果。但是腺病毒載體對(duì)一些低表達(dá)柯薩奇腺病毒受體(CAR)的腫瘤細(xì)胞存在轉(zhuǎn)染效率低的問題，限制了其應(yīng)用范圍。另外，腺病毒的基因治療存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，其應(yīng)用也受到社會(huì)和醫(yī)學(xué)倫理的限制。Fuson等的研究表明MDA-7 / IL-24的翻譯后的糖基化僅影響其分泌和在胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性，對(duì)其抗腫瘤活性沒有顯著影響。因此，MDA-7 / IL-24在原核生物工程菌中的重組表達(dá)研究也在進(jìn)行中。但是IL-24在原核生物中的表達(dá)卻不那么順利，因?yàn)橹亟MIL-24蛋白容易形成包涵體，并且形成的包涵體十分堅(jiān)固，不利于后期的復(fù)性過程。目前，大腸桿菌生產(chǎn)IL-24的缺陷就在于形成的包涵體過于堅(jiān)固，包涵體溶解效率低，故而復(fù)性收率低。另外低的溶解效率會(huì)導(dǎo)致后期的純化收率低，純化工藝繁瑣。在包涵體的整個(gè)處理過程中包涵體的變性和復(fù)性是影響最大的兩個(gè)因素，而包涵體的結(jié)構(gòu)又會(huì)影響包涵體的變性過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服IL-24包涵體復(fù)性過程收率低、純化困難的缺點(diǎn)而提供一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法。
[0005]本發(fā)明分析了 IL-24包涵體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)化了包涵體的洗滌條件，洗滌方法能有效逐步去除雜蛋白，得到純度達(dá)96%的IL-24蛋白，且步驟得到了簡(jiǎn)化，節(jié)約了生產(chǎn)成本，操作簡(jiǎn)單。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，該方法包括以下步驟:[0008](I)制備含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌:
[0009]表達(dá)質(zhì)粒為pET28a(+)，表達(dá)宿主為BL21(DE3)pLysS，白細(xì)胞介素_24的基因序列如Genbank號(hào)NM-006850所示；具體步驟如下:
[0010]I)編碼人源IL-24基因的cDNA的序列如Genbank號(hào)NM-006850所示，根據(jù)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物I含有Nde I酶切位點(diǎn)，引物2含有Hind III酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
[0011]引物1:5' ~GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT~3/，橫畫線表示Nde I 酶切位點(diǎn)；
[0012]引物2:5' ~CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG~3/，橫畫線表示Hind III 酶切位點(diǎn)；
[0013]2)編碼人源IL-24基因的cDNA在引物I和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物；
[0014]3)PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle-Pure Kit純化后，用Nde I和Hind III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-28a(+)，驗(yàn)證正確的陽性克隆即為含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌。
[0015](2)重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng):
[0016]重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，接種量為2~4wt%。
[0017]所述的發(fā)酵培養(yǎng)包括誘導(dǎo)前培養(yǎng)與誘導(dǎo)后培養(yǎng)兩個(gè)過程；
[0018]誘導(dǎo)前培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)溫度為28_37°C，pH值為6.5-7.5，當(dāng)菌種濃度OD6tltl達(dá)到0.4-1.0時(shí)，用終濃度為0.05-0.2mM的誘導(dǎo)劑IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)；
[0019]誘導(dǎo)后培養(yǎng)采用優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基，控制誘導(dǎo)溫度為25_37°C，pH值為6.5-7.5 ；所述的優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10-15g / L，酵母粉5-10g / L，NaC15 — IOg /L，MgS04l-2g / L，CaCl2l-2g / L 和 MnSO4.H2O0.2-1.0g/L。所述的優(yōu)化培養(yǎng)條件的目的是改善包涵體結(jié)構(gòu)，使包涵體結(jié)構(gòu)變得更疏松，顆粒變得更小，提高包涵體變性效率，進(jìn)而提高包涵體復(fù)性效率。
[0020](3)發(fā)酵培養(yǎng)后得到的菌體進(jìn)行超聲破碎得到包涵體:將菌體重懸于TE緩沖液(20mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH8.5)，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，超聲功率設(shè)為300-400W，超聲時(shí)間為2X100次(超聲3s，暫停6s)，將破碎溶液離心(10，000Xg，30min，4°C )收獲包涵體；
[0021](4)對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，依次使用三種洗滌緩沖液及去離子水洗滌包涵體，四次洗漆均采用攪拌洗漆2小時(shí)，10, OOOXg離心30min,取沉淀。所述方法能有效逐步去除雜蛋白，得到純度達(dá)96%的IL-24蛋白，本洗滌純化方法節(jié)約了生產(chǎn)成本，且操作簡(jiǎn)單；所述的二種洗漆緩沖液為:
[0022]洗滌緩沖液1:含有 20mM Tris-HClUOmM EDTAUOOmM NaCl、體積百分比 1.0%Triton X-100 及 2M Urea, pH 為 8.5 ;
[0023]洗滌緩沖液I1:含有 20mM Tris-HClUOmM EDTA、體積百分比 2.0 % Triton X-100及 4M Urea, pH 為 8.5 ;
[0024]洗滌緩沖液II1:含有 20mM Tris-HClUOmM EDTA、體積百分比 1.0% TritonX-1OO 及 4M Urea, pH 為 9.5。
[0025](5)對(duì)洗滌后的包涵體進(jìn)行變性與復(fù)性，得到白細(xì)胞介素-24蛋白，具體方法如下:
[0026]I)洗滌后的包涵體溶解于變性緩沖液中攪拌過夜，10，OOOXg離心30min后取上清液；變性緩沖液中含有20mM TrisUOmM EDTA及8M urea, pH為9.0 ;
[0027]2)采用透析復(fù)性方法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到溶于PBS中的白細(xì)胞介素-24蛋白；在進(jìn)行復(fù)性時(shí)，靜水壓采用0.5-1.0kPa，按重量比10: I比例添加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽，尿素濃度梯度依次為6M、3M、L 5M,0.75M、0M、0M，pH梯度依次為9.0,9.0,8.5、8.0、7.5、7.4，甘油體積濃度梯度依次為0%,15%,10%,5%,0%,0%0
[0028]本發(fā)明從發(fā)酵條件入手改善包涵體的結(jié)構(gòu)來進(jìn)而優(yōu)化后期的復(fù)性和純化過程。經(jīng)過條件優(yōu)化，包涵體的結(jié)構(gòu)變得疏松，包涵體顆粒明顯變得均勻，并且直徑變小，優(yōu)化后的IL-24包涵體的變性效率提高了 50.52%，這為后期復(fù)性效率的提高奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明進(jìn)一步地對(duì)包涵體的洗滌過程和復(fù)性過程進(jìn)行了優(yōu)化，復(fù)性效率提高了 83.78%。這種通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來改善復(fù)性和純化過程的方法可能適用于其它有類似包涵體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的蛋白。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0030](I)通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，改善了包涵體結(jié)構(gòu)，使包涵體結(jié)構(gòu)變得更疏松，顆粒變得更小，所述方法使IL-24的變性效率和復(fù)性效率分別提高了 50.52%和83.78%:
[0031](2)對(duì)包涵體洗滌過程進(jìn)行了優(yōu)化，洗滌方法能有效逐步去除雜蛋白，得到純度達(dá)96%的IL-24蛋白，本發(fā)明提供的洗滌純化方法節(jié)約了生產(chǎn)成本，且操作簡(jiǎn)單；復(fù)性過程的優(yōu)化提高了蛋白的復(fù)性效率。
[0032](3)本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞介素IL-24的商業(yè)化生產(chǎn)提供了一種有效的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為IL-24在重組大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá):
[0034]圖中,M表示Marker ；1為非誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)照組,2為誘導(dǎo)組全細(xì)胞,3為誘導(dǎo)組沉淀，4為誘導(dǎo)組上清液；
[0035]圖2為金屬離子添加劑對(duì)包涵體變性的影響；
[0036]圖中1-9添加的金屬離子分別為⑴未加金屬離子對(duì)照組，(2)Mg2+，(3)Ca2+，(4)Na+，(5)NH:，(6) Mn2+，(7) Fe3+，(8) K+，(9) Cu2+ ；
[0037]圖3為誘導(dǎo)溫度、pH、誘導(dǎo)劑濃度對(duì)包涵體變性的影響；
[0038]圖中，1-4分別為四個(gè)梯度，溫度梯度1-4為37°〇、301:、251:、181:郝梯度1-4為
6.0,7.0,8.0,9.0 ;IPTG 梯度 1-4 為 0.lmM、0.5mM、l.0mMU.5mM。
[0039]圖4為包涵體經(jīng)洗滌優(yōu)化后的SDS-PAGE電泳圖；
[0040]圖中，M =Marker ；1:誘導(dǎo)組上清液；2、4、5:包涵體經(jīng)洗滌緩沖液1、I1、III洗滌后的沉淀；3、6、7:包涵體經(jīng)洗滌緩沖液1、I1、III洗滌后的上清液；8:最后去離子水洗后的沉淀。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。[0042]實(shí)施例1
[0043]重組IL-24在大腸桿菌的表達(dá)
[0044]編碼人源IL-24基因的cDNA來自于本實(shí)驗(yàn)室，其序列與GenBank (NM-006850)公布的人IL-24的全序列一致。首先根據(jù)基因序列并應(yīng)用PrimerPrimer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，此引物擴(kuò)增的片段中不含前48個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。
[0045]引物1: 5' -GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT-3'(含 Nde I 酶切位點(diǎn))
[0046]引物2:5' ~CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG~3/ (含Hind III 酶切位點(diǎn))
[0047]PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle-PureKit純化后，用Nde I和Hind III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-28a(+)。驗(yàn)證正確的陽性克隆即為制備IL-24的基因工程菌。接種陽性單克隆菌落于LB培養(yǎng)基(10(^8/!^卡那霉素)，置于37°C搖床200rmp培養(yǎng)。當(dāng)OD6tltl至0.6-0.8時(shí)，加入0.SmM誘導(dǎo)劑IPTG，37°C誘導(dǎo)4h。收獲發(fā)酵液，經(jīng)離心(lOOOOrpm，IOmin)收集誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌菌體，并用Tris-HCl緩沖液(20mM，pH8.5)洗滌一次菌體。將菌體重懸于TE緩沖液(20mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.5)，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，超聲功率設(shè)為300-400W，超聲時(shí)間為2X 100次(超聲3s，暫停6s)。將破碎溶液離心(10，000Xg，30min，4°C )收獲包涵體，并對(duì)基因工程菌不同表達(dá)部分取樣進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)果顯示，所構(gòu)建的基因工程菌有目的蛋白MDA-7 / IL-24的表達(dá)，而對(duì)照卻未見相應(yīng)表達(dá)條帶，結(jié)果見圖1。
[0048]實(shí)施例2
[0049]重組IL-24包 涵體的獲得
[0050]以對(duì)包涵體變性的影響也就是溶解后的濁度為參數(shù)優(yōu)化培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)溫度選取18。。，25。。，30。。和 370C ；pH6.0,7.0,8.0 和 9.0 ;IPTG 濃度 0.1mM, 0.5mM, 1.0mM 和 1.5mM。離子添加劑的優(yōu)化選取的是Mg2+，F(xiàn)e3+，Ca2+，Na+，NH4+, Mn2+，Cu2+，K+，每個(gè)離子采用四個(gè)梯度
0.50g / L,l.0Og / L，2.00g/L 和 3.00g / L.每個(gè)離子對(duì)應(yīng)的化合物為 MgSO4, Fe2 (SO4) 3，CaCl2, NaCl，NH4Cl, MnSO4.H2O, CuSO4.5H20 和 KCl。優(yōu)化后的結(jié)果見圖 2 和圖 3。選取了誘導(dǎo)溫度30°C，pH7.0，誘導(dǎo)劑IPTG0.05-0.2mM作為培養(yǎng)條件。另外，Mg2+，Ca2+和Mn2+對(duì)包涵體增溶有正作用，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)找到了三種離子交互作用后的最適濃度。
[0051]重組菌的培養(yǎng)過程如下:重組大腸桿菌在LB種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，按接種量3wt%將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，重組菌在優(yōu)化過的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，獲得的菌體經(jīng)超聲破碎得到改善后的包涵體。發(fā)酵培養(yǎng)分為誘導(dǎo)前培養(yǎng)與誘導(dǎo)后培養(yǎng)。誘導(dǎo)前培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)溫度為28-30°C，pH值為7.0,當(dāng)菌種濃度0D_達(dá)到0.6-0.8時(shí)，用終濃度為0.05-0.2mM誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后培養(yǎng)采用優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基，控制誘導(dǎo)溫度為25-28°C，pH值為7.0。優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基組成為以下組分及含量:蛋白胨10_15g /L，酵母粉 5-10g/L，NaC15-10g/L，MgS04l-2g / L，CaCl2l_2g / L 和 MnSO4.H2O0.2-1.0g /L。優(yōu)化培養(yǎng)條件的目的是改善包涵體結(jié)構(gòu)，使包涵體結(jié)構(gòu)變得更疏松，包涵體顆粒變得更小，提高包涵體變性效率，進(jìn)而提高包涵體復(fù)性效率。
[0052]實(shí)施例3
[0053]IL-24包涵體的洗滌
[0054]將菌體重懸于TE緩沖液(20mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.5)，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，超聲功率設(shè)為300-400胃，超聲時(shí)間為2\100次(超聲3s，暫停6s)。將破碎溶液離心(10, 000Xg,30min,4°C )收獲包涵體。對(duì)收獲后的包涵體用三種洗滌緩沖液及去離子水分別洗滌包涵體，每次攪拌洗滌2小時(shí)，10，000 Xg離心30min，取沉淀。方法能有效逐步去除雜蛋白，得到純度達(dá)96%的IL-24蛋白，減少了純化步驟，節(jié)約了生產(chǎn)成本，操作簡(jiǎn)單結(jié)果見圖4。
[0055]三種洗滌緩沖液為:
[0056]buffer I:20Mm Tris-HCl, IOmM EDTA, IOOmM NaCl, 1.0% TritonX-100, 2M Urea,ρΗ8.5 ；
[0057]buffer 11:20mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 2.0% TritonX-100,4M Urea, pH8.5 ；
[0058]bufferIII:20mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 1.0% TritonX-100,4M Urea, pH9.5。
[0059]實(shí)施例4
[0060]IL-24包涵體的變復(fù)性
[0061]洗滌后的包涵體溶解于變性緩沖液中(20mM Tris, IOmM EDTA，8M urea, pH為9.0)，攪拌過夜，10，OOOXg離心30min，取上清。采用透析復(fù)性方法，尿素濃度遞減(6M-3M-1.5M-0.75M-0M-0M)，pH 梯度逐漸減少(9.0-9.0-8.5—8.0-7.5-7.4)，靜水壓采用0.5-1.0kP，添加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽質(zhì)量比10: 1，甘油濃度遞減(20% -15% -10% -5% -0% -0% )最終得到溶于PBS中的IL-24蛋白。方法使IL-24的變性效率和復(fù)性效率分別提高了 50.52%和83.78%。
[0062]上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)制備含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌； (2)重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (3)發(fā)酵培養(yǎng)后得到的菌體進(jìn)行超聲破碎得到包涵體； (4)對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌； (5)對(duì)洗滌后的包涵體進(jìn)行變性與復(fù)性，得到白細(xì)胞介素-24蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的制備含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌時(shí)，表達(dá)質(zhì)粒為pET28a(+)，表達(dá)宿主為BL21 (DE3)pLysS，白細(xì)胞介素-24的基因序列如Genbank號(hào)NM-006850所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的制備含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌的步驟如下: 1)編碼人源IL-24基因的cDNA的序列如Genbank號(hào)NM-006850所示,根據(jù)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物I含有Nde I酶切位點(diǎn)，引物2含有Hind III酶切位點(diǎn)，引物序列如下: 引物 1:5' ~GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT~3/，橫畫線表示Nde I 酶切位占.引物 2:5' ~CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG~3/，橫畫線表示Hind III 酶切位占.2)編碼人源白細(xì)胞介素-24基因的cDNA在引物I和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物； 3)PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle-PureKit純化后，用Nde I和Hind III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-28a(+)，驗(yàn)證正確的陽性克隆即為含有白細(xì)胞介素-24基因的重組大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，接種量為2~4wt%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)包括誘導(dǎo)前培養(yǎng)與誘導(dǎo)后培養(yǎng)兩個(gè)過程； 誘導(dǎo)前培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)溫度為28-37°C，pH值為6.5-7.5，當(dāng)菌種濃度OD600達(dá)到0.4-1.0時(shí)，用終濃度為0.05-0.2mM的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)； 誘導(dǎo)后培養(yǎng)采用優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基，控制誘導(dǎo)溫度為25-37°C，pH值為6.5-7.5 ;所述的優(yōu)化過的LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10 — 15g/L，酵母粉5-10g / L，NaC15_10g / L，MgSO41-2g/L, CaCl21-2g / L 和 MnSO4.H2O0.2-1.0g / L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的超聲破碎方法為:將菌體重懸于TE緩沖液，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，將破碎溶液離心收獲包涵體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌時(shí)，依次使用三種洗滌緩沖液及去離子水洗滌包涵體；所述的三種洗滌緩沖液為: 洗滌緩沖液 1:含有 20mM Tris-HClUOmM EDTAUOOmM NaCl、體積百分比 1.0% TritonX-100 及 2M Urea, pH 為 8.5 ;洗滌緩沖液I1:含有20mM Tris-HClUOmM EDTA、體積百分比2.0% Triton X-100及4M Urea, pH 為 8.5 ; 洗滌緩沖液 II1:含有 20mMTris-HClUOmM EDTA、體積百分比 1.0% Triton X-100 及4M Urea, pH 為 9.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度白細(xì)胞介素-24包涵體的制備方法，其特征在于，對(duì)洗滌后的包涵體進(jìn)行變性與復(fù)性的方法如下: 1)洗滌后的包涵體溶解于變性緩沖液中攪拌過夜，離心后取上清液； 所述的變性緩沖液中含有20mM TrisUOmM EDTA及8M urea, pH為9.0 ; 2)采用透析復(fù)性方法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到溶于PBS中的白細(xì)胞介素-24蛋白； 在進(jìn)行復(fù)性時(shí)，靜水壓采用0.5-1.0kPa，按重量比10: I比例添加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽，尿素濃度梯度依次為6Μ、3Μ、1.5Μ、0.75M、0M、0M，pH梯度依次為9.0、9.0、8.5、8.0、7.5、7.4，甘油體積濃度梯度依次為 0% ,15% ,10% ,5% ,0% ,0% ?
【文檔編號(hào)】C07K14/54GK103864914SQ201410119737
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】孫愛友, 魏東芝, 王學(xué)東, 王曉娟, 白超剛, 張艦, 呂欣欣 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)