新型肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型肽。本發(fā)明的目的在于提供一種具有在生物體內(nèi)促進整聯(lián)蛋白或膠原蛋白等的表達的效果的新型物質(zhì)。所述新型物質(zhì)為一種由下述的式(I)：Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ?ID?NO：1)所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有1或多個氨基酸的添加、缺失和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
【專利說明】新型肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的目的在于提供一種具有促進生物體內(nèi)的整聯(lián)蛋白或膠原蛋白等的表達的效果的新型物質(zhì)。而且，本發(fā)明還涉及一種利用經(jīng)由整聯(lián)蛋白等細胞粘附因子的細胞粘附來提高生長因子或激素等功能肽的活性的方法等。

【背景技術(shù)】
[0002]在生物體的組織內(nèi)，細胞和細胞外基質(zhì)通過粘附而相互作用并在細胞內(nèi)部傳遞信號，誘導(dǎo)或抑制基因或蛋白質(zhì)等的各種因子，由此進行細胞的分化或增殖等的細胞質(zhì)的控制及代謝產(chǎn)物的分泌等。另外，膠原蛋白等細胞外基質(zhì)自身也通過與細胞粘附而使膠原蛋白纖維束的格子狀的立體結(jié)構(gòu)增強、穩(wěn)定化，保持肌膚的張力及彈性。因此，根據(jù)紫外線等外部因子及年齡增加等原因，細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附變?nèi)鯐r，不僅對細胞的信號傳遞沒有成功且細胞的作用(各種因子的產(chǎn)生等)變?nèi)?，而且由基質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化引起肌膚的張力及彈力的降低，招致皺紋及松弛等皮膚的老化癥狀等。而且，已知構(gòu)成作為在皮膚組織中存在于表皮和真皮之間的細胞外基質(zhì)的基膜的主要蛋白質(zhì)的層粘連蛋白與位于細胞表面的整聯(lián)蛋白相互作用，參與細胞粘附。而且，通過這種層粘連蛋白和整聯(lián)蛋白之間的結(jié)合，基膜和細胞牢固地粘附，由此，作為基膜的重要作用的從真皮向表皮的營養(yǎng)因子及增殖因子的移動變得平滑(7 A — <)，能夠關(guān)聯(lián)到維持健康的皮膚狀態(tài)。因此，基膜和細胞之間的粘附能力變?nèi)鯐r，皮膚整體的健康狀態(tài)變得不良，有可能招致表皮的薄化等，此外，阻礙經(jīng)由基膜的各種因子的移動招致代謝不良，與此同時也容易引起斑點(黑色素的蓄積)或暗淡等。因此，提高使細胞和細胞外基質(zhì)粘附的因子的作用是非常重要的。
[0003]作為細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附因子，存在于細胞膜上的整聯(lián)蛋白是眾所周知的。另外，在細胞外基質(zhì)中參與和整聯(lián)蛋白的粘附的纖連蛋白及層粘連蛋白等因子也廣義地被稱為細胞粘附因子。因此，得到使這些因子的表達量增加的物質(zhì)是有用的。
[0004]但是，在使生長因子及激素、拮抗劑、激動劑之類的對于細胞具有生理活性的功能性因子對生物體起作用的情況下，認為細胞粘附促進因子的利用是有益的。即，通過同時使用意圖作用于細胞的功能肽和細胞粘附促進因子，該功能性因子與細胞相互作用的概率提高，可以期待發(fā)揮高的效果。
[0005]從如上所述的觀點出發(fā)，一直希望探索可以促進細胞粘附因子的表達并促進對細胞的粘附的物質(zhì)。
[0006]迄今為止，作為促進細胞和膠原蛋白之間的粘附的物質(zhì)，已知具有特定序列的肽(專利文獻1、2)。另外，也提出了含有來自作為功能肽的TGF-β的特定氨基酸序列和細胞附著氨基酸序列的TGFP-CAP肽(專利文獻3)。但是，一直在希望開發(fā)提高細胞粘附因子的表達量并能夠促進對細胞的粘附的更有用的新型物質(zhì)。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008]專利文獻
[0009] 專利文獻1:美國專利申請公開第2004/0141939號說明書
[0010]專利文獻2:國際公開第2012/144546號小冊子
[0011]專利文獻3:國際公開第2008/130082號小冊子


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
[0013]本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)而完成的發(fā)明，其目的在于，提供一種可以使整聯(lián)蛋白等細胞粘附因子的表達量增加、另外對促進膠原蛋白等的產(chǎn)生也有用的新型物質(zhì)。
[0014]用于解決課題的方法
[0015]本發(fā)明人等為了解決上述課題而進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有特定的氨基酸序列的短鏈肽可以使整聯(lián)蛋白、纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白之類的細胞粘附因子，及膠原蛋白、彈性蛋白微原纖維界面因子(EMILIN)、透明質(zhì)酸合酶(hyaluronan synthase)、彈性蛋白、TIMP金屬肽酶抑制劑之類的細胞外基質(zhì)中存在的成分或參與其形成的成分的表達量增加，此外，通過使用該肽，實際上也能夠發(fā)揮促進膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白產(chǎn)生的活性。而且，本發(fā)明人等重復(fù)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過將該肽作為與對細胞起作用的功能肽融合的融合肽，可以用于容易發(fā)揮該功能肽對細胞的作用，直至完成了本發(fā)明。
[0016]即，本發(fā)明提供以下發(fā)明。
[0017][I] 一種由下述的式(I):
[0018]Gly-Arg-1le-Ar g-Val-Leu(SEQ ID NO:1)
[0019]所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
[0020][2]如[I]的肽或者該肽的衍生物、或它的鹽，為Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:1)、Gly-Arg-1le-Arg-Val(SEQ ID NO:
4), Arg-1le-Arg-Val-Leu (SEQ ID NO:5), Gly-Arg-1Ie-Arg(SEQ ID NO:6)、Gln-Tyr-Gly-Arg-1le-Arg(SEQ ID NO:8) > Tyr-Gly-Arg-1le-Arg-Val(SEQ ID NO:9)、Arg-1le-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO:10), Ile-Arg-Val-Leu-Gln-Arg(SEQ ID NO:7)、Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO:11) > Tyr-Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:3)、或 Gly-Arg-1Ie-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO:2)。
[0021][3]如[I]或[2]所述的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽，具有4~8殘基的氨基酸長度。
[0022][4] 一種組合物，所述組合物含有[I]~[3]中任一種肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
[0023][5]如[4]的組合物，所述組合物用于美容。
[0024][6]如[4]或[5]的組合物，所述組合物用于改善或預(yù)防皮膚的皺紋、松弛、張力降低、彈性降低、代謝不良、斑點、暗淡或表皮薄化。
[0025][7]如[4]~[6]中任一種組合物，所述組合物用于使肌膚緊致。
[0026][8]如[4]~[7]中任一種組合物,所述組合物用于促進選自由膠原蛋白、整聯(lián)蛋白及纖連蛋白構(gòu)成的組中的至少I種的產(chǎn)生。
[0027][9]如[4]~[8]中任一種組合物，所述組合物使編碼細胞粘附因子、細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或參與細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)的基因的表達增加。
[0028][10] 一種融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，由對細胞起作用的功能肽和[I]~[3]中任一種肽融合而成。
[0029][11]如[10]的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽選自由生長因子、激素、拮抗劑、激動劑及它們的部分構(gòu)成的組中的I種以上。
[0030][12]如[10]或[11]的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽為來自轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)的片段肽或來自促黑素細胞激素(MSH)的片段肽。
[0031][13]如[10]~[12]中任一種融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽和[I]~[3]中任一種肽通過接頭融合。
[0032][14]如[10]~[13]中任一項所述的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，[I]~[3]中任一種肽與細胞粘附。
[0033][15] 一種組合物，所述組合物含有[10]~[14]中任一種融合肽或該融合肽的衍生物、或它們的鹽。
[0034]本發(fā)明的肽或者其衍生物、或它們的鹽具有使整聯(lián)蛋白等細胞粘附因子及膠原蛋白等細胞外基質(zhì)中的成分或參與其形成的成分的表達量增加的活性。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種能夠促進細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附、另外促進膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白的產(chǎn)生的新型物質(zhì)。通過利用該新型物質(zhì)，促進細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附，進而可以對于有效地改善皮膚的皺紋及松弛、張力降低、彈性降低、代謝不良及與其相伴的斑點、暗淡、表皮薄化等，使肌膚緊致等有益，可以制備對美容有用的組合物。
[0035]而且，通過利用提高細胞粘附效果的上述新型物質(zhì)，能夠提高對細胞起作用的功能肽(例如生長因子、激素、拮抗劑、激動劑)對細胞的活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1是表示實施例3的膠原蛋白產(chǎn)生促進效果的評價結(jié)果的圖。
[0037]圖2是表示實施例4的細胞粘附試驗的評價結(jié)果的圖。
[0038]圖3是表示利用實施例6的本發(fā)明的肽的促進整聯(lián)蛋白α 3的表達的圖。
[0039]圖4是表示利用實施例6的本發(fā)明的肽的促進纖連蛋白的表達的圖。

【具體實施方式】
[0040]以下，對本發(fā)明詳細地進行說明。在本說明書的整體范圍內(nèi)，單數(shù)形式的表現(xiàn)只要沒有特別其它提及，則應(yīng)理解為也包含其復(fù)數(shù)形式的概念。另外，在本說明書中所使用的術(shù)語只要沒有特別其它提及，則應(yīng)理解為以該領(lǐng)域中通常使用的含義進行使用的。另外，在本說明書中，有時用眾所周知的三字符簡寫或單字符簡寫表示氨基酸。
[0041 ] <能夠促進整聯(lián)蛋白或膠原蛋白等的表達的肽>
[0042]本發(fā)明提供一種由下述的式⑴:
[0043]Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(單字符簡寫:GRIRVL,SEQ ID NO:1)表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
[0044]用于本發(fā)明的肽可以為上述式⑴表示的GRIRVL肽，或可以為由在該氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽(以下也稱為肽變體)。優(yōu)選為GRIRVL肽、GRIRV肽或RIRVL肽，更優(yōu)選為GRIRVL肽。
[0045]在此，氨基酸的保守性置換是指:原來的氨基酸和被置換的氨基酸為具有共同的性質(zhì)的氨基酸之間的置換。更具體而言，作為疏水性氨基酸，可以列舉在色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)及丙氨酸(A)中的氨基酸間的置換；作為堿性氨基酸，可以列舉在精氨酸(R)、賴氨酸(K)及組氨酸(H)中的氨基酸間的置換；作為小型氨基酸，可以列舉在甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蛋氨酸(M)、蘇氨酸(T)中的氨基酸間的置換等。
[0046]用于本發(fā)明的肽變體只要能夠發(fā)揮本發(fā)明的效果，可以為在式(I)表示的氨基酸序列中具有添加、缺失或保守性置換的任一種的變體，或者可以為在上述氨基酸序列中具有如添加及缺失、添加及保守性置換、或缺失及保守性置換等2個以上的改變的變體。為了更可靠地得到高的本發(fā)明的效果，優(yōu)選使用在式(I)表示的氨基酸序列中具有添加和/或缺失的肽變體，更優(yōu)選使用在式(I)表示的氨基酸序列的N末端和/或C末端上具有添加和/或缺失的肽變體。
[0047]而且，本發(fā)明的肽變體可以為由在式(I)表示的氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置換的任意的氨基酸序列構(gòu)成的肽變體，但優(yōu)選為由具有I~3個、更優(yōu)選為由具有I~2個、特別優(yōu)選為由具有I個氨基酸的添加、缺失和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽變體。
[0048]另外，用于本發(fā)明的肽變體的氨基酸殘基的長度只要可以產(chǎn)生本發(fā)明的效果，就沒有特別限制，優(yōu)選為4~8殘基、更優(yōu)選為5~7殘基。
[0049]更具體而言，作為用于本發(fā)明的肽變體的實例，可以列舉:在式⑴表示的氨基酸序列的N末端或C末端上具有添加的肽變體(例如GRIRVLQ(SEQ ID NO:2)、YGRIRVL(SEQID NO:3))、在式(I)表示的氨基酸序列的N末端或C末端上具有缺失的肽變體(例如GRIRV(SEQ ID NO:4)、RIRVL(SEQ ID NO:5)、GRIR(SEQ ID NO:6))、在式⑴表示的氨基酸序列的N末端及C末端上具有缺失及添加的肽變體(例如IRVLQR(SEQ ID NO:7)、QYGRIR(SEQ ID NO: 8)、YGRIRV(SEQ ID NO:9)、RIRVLQ(SEQ ID NO: 10)、RVLQRF(SEQ ID NO:11))等。從可以期待能夠更可靠地發(fā)揮高的效果的觀點出發(fā)，優(yōu)選為GRIRVLQ(SEQ ID NO:2)、YGRIRVL(SEQ ID NO:3)、GRIRV(SEQ ID NO:4)、RIRVL(SEQ ID NO:5)、IRVLQR(SEQ IDNO:7)，更優(yōu)選為 GRIRVLQ (SEQ ID NO:2)、YGRIRVL (SEQ ID NO:3)、GRIRV (SEQ ID NO:4)、RIRVL(SEQ ID NO:5)。
[0050]在本說明書中，“肽的衍生物”是指例如將肽(含有肽變體及后述的融合肽)乙?；?、棕櫚?；⑹耐榛?、酰胺化、丙烯酸化、丹酰化、生物素化、磷酸化、琥珀酰化、酰苯胺化、芐氧羰基化、甲?；?、硝基化、硫化、醛化、環(huán)狀化、糖基化、單甲基化、二甲基化、三甲基化、胍基化、脒化、馬來?；⑷阴；被柞；?、三硝基苯基化、硝基環(huán)庚三烯酮化或乙酰乙?；傻难苌锏?。
[0051]在本說明書中，“鹽”是指肽(含有肽變體及后述的融合肽)或其衍生物的藥理學(xué)上可接受的任意的鹽(含有無機鹽及有機鹽)，例如可列舉:肽或其衍生物的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、有機酸鹽(乙酸鹽、三氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、丙酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、苦味酸鹽、苯磺酸鹽等)等，優(yōu)選為銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽或三氟乙酸鹽，更優(yōu)選為銨鹽、乙酸鹽或三氟乙酸鹽。
[0052]本發(fā)明的肽(含有肽變體及后述的融合肽)或者其衍生物、或它們的鹽可以為水合物或非水合物。另外，本發(fā)明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可以為溶劑化物或非溶劑化物。
[0053]本發(fā)明的肽可以通過本領(lǐng)域中公知的方法來制備。例如，本發(fā)明的肽可以通過化學(xué)合成方法(例如，固相法(例如Fmoc法)、液相法等)來合成，另外，也可以通過基因重組表達等方法來制備。另外，構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸可以為L-型，也可以為D-型，但優(yōu)選為L-型。
[0054]進而，本發(fā)明的肽可以通過如下操作來制備:通過蛋白酶處理等公知的方法從含有目標氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中切出由目標氨基酸序列構(gòu)成的肽。
[0055]本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮蛋白酶的序列特異性等，為了從含有目標氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中切出由目標氨基酸序列構(gòu)成的肽，可適宜選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌浮Ａ硗?，在用蛋白酶將蛋白質(zhì)水解時使用的反應(yīng)條件沒有特別限制，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)技術(shù)常識適宜選擇而得到。利用蛋白酶的水解處理后，根據(jù)需要通過本領(lǐng)域中公知的方法進行精制，由此，可以精制目標肽。
[0056]如上所述，將天然的蛋白質(zhì)用蛋白酶水解而得到的肽與用化學(xué)合成方法制備的情況相比，從成本方面考慮是有利的。進而，認為將天然的蛋白質(zhì)用蛋白酶水解而得到的肽對生物體是更安全的。因此，如上得到的肽可優(yōu)選用于針對向生物體的適用要求更高的安全性的內(nèi)服劑、食品、敏感肌膚用化妝品、飼料等。其中，食品是指包含飲用品的全部的飲食物。
[0057]本發(fā)明的肽的衍生物可以通過本領(lǐng)域中公知的任意的方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備而得到。
[0058]本發(fā)明的肽的鹽也可以通過本領(lǐng)域中公知的任意的方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備而得到。
[0059]本發(fā)明可使用具有上述的特定序列的肽或者其衍生物、或它們的鹽中的任一種，但為了更可靠地得到高的本申請效果，可優(yōu)選使用肽或其鹽，特別優(yōu)選使用肽。
[0060]本發(fā)明的肽或其變體或者該肽的衍生物、或它們的鹽可以使編碼整聯(lián)蛋白等細胞粘附因子及股原蛋白等細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或參與細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)的基因的表達增加。以下，將本發(fā)明的肽或其變體或者該肽的衍生物、或它們的鹽稱為本發(fā)明的肽類。具體而言，作為利用本發(fā)明的肽類而表達增加的細胞粘附因子及細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或參與細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)，可以列舉:整聯(lián)蛋白(integrin)、纖連蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白(Iaminin)、膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、TIMP 金屬妝酶抑制劑(TIMP metallopeptidase inhibitor)、彈性蛋白纖維關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)(elastin microfibril interfacer)(也稱為彈性蛋白微原纖維界面因子)、透明質(zhì)酸合酶(hyaluronan synthase)等。
[0061] 整聯(lián)蛋白為細胞表面蛋白質(zhì)的一種，參與對細胞外基質(zhì)的粘附、來自細胞外基質(zhì)的信號傳遞。纖連蛋白為細胞外基質(zhì)的一種，參與和整聯(lián)蛋白的粘附。另外，纖連蛋白也與膠原蛋白等細胞外基質(zhì)成分粘附，起到使細胞和細胞外基質(zhì)粘附的作用。層粘連蛋白為基膜(細胞外基質(zhì)的一種)的主要蛋白質(zhì)，已知與整聯(lián)蛋白相互作用，參與細胞粘附等。膠原蛋白為細胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)，在各種細胞的粘附、細胞的分化或增殖方面特異性地起作用，也具有作為細胞功能的調(diào)節(jié)因子的作用。膠原蛋白的減少有時引起角膜潰瘍等角膜疾患，風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾患，炎癥性疾病等各種疾病。另外，在皮膚真皮的細胞外基質(zhì)中，通過膠原蛋白纖維形成網(wǎng)眼狀的束而賦予適當(dāng)?shù)膹埩ΑＴ谀z原蛋白中存在I~X I X型等各種類型的膠原蛋白，但本發(fā)明的肽類特別可以使I型膠原蛋白(膠原蛋白類型I)及IV型膠原蛋白(膠原蛋白類型IV)或XVIII型膠原蛋白(膠原蛋白類型XVIII)的表達增加。彈性蛋白為構(gòu)成細胞外基質(zhì)的彈性纖維的構(gòu)成成分。TIMP金屬肽酶抑制劑具有阻礙參與細胞外基質(zhì)的分解的肽酶的活性的作用，其結(jié)果，TIMP抑制細胞外基質(zhì)的過量的分解，在組織的動態(tài)平衡中擔(dān)負重要的作用。彈性蛋白微原纖維界面因子為構(gòu)成細胞外基質(zhì)的多聚體糖蛋白(多量體糖々 々質(zhì))的一種，存在于彈性蛋白和微小纖維之間，認為參與彈性纖維形成及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化等。透明質(zhì)酸合酶作為局部存在于細胞膜的酶進行作為細胞外基質(zhì)的主要成分的一種的透明質(zhì)酸的合成。已知透明質(zhì)酸除支撐細胞外空間的結(jié)構(gòu)并參與營養(yǎng)因子及廢物的物質(zhì)輸送之外，具有強力的保水作用，因此，對皮膚的彈力及張力產(chǎn)生影響。
[0062]上述的各種蛋白質(zhì)直接或間接地參與細胞外基質(zhì)和細胞的粘附，因此，這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量增加，例如細胞粘附因子增加時，進而細胞外基質(zhì)增加，因此，促進成纖維細胞及角化細胞等皮膚細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附。
[0063]而且，本發(fā)明的肽類不直接地參與細胞和細胞外基質(zhì)的粘附，但可以增加或減少編碼能夠?qū)ζつw產(chǎn)生作用的蛋白質(zhì)的基因的表達。其中，對皮膚產(chǎn)生作用是指:例如，可以有效地改善皮膚的皺紋及松弛、張力降低、彈性降低、代謝不良及與其相伴的斑點、暗淡、表皮薄化等，使肌膚緊致等有益的對于皮膚的良好作用，除此之外，產(chǎn)生誘導(dǎo)皮膚的炎癥及黑色素產(chǎn)生等對于皮膚的不良作用。本發(fā)明的肽類使對皮膚產(chǎn)生良好作用的基因的表達增加，另外，可以使對皮膚產(chǎn)生不良作用的基因的表達減少。
[0064]作為為能夠?qū)ζつw產(chǎn)生良好作用的蛋白質(zhì)、且利用本發(fā)明的肽類而基因表達增加的蛋白質(zhì)，可以列舉:過氧化氫酶(catalase)、雙向調(diào)節(jié)蛋白(amphiregulin)、去乙?；?sirtuin)、端粒酶(telomerase)等。
[0065]過氧化氫酶為過氧化氫分解酶，由于其將由紫外線照射等產(chǎn)生的對皮膚有害的過氧化氫進行分解，所以，其表達量增加可以期待對皮膚良好的效果。雙向調(diào)節(jié)蛋白為EGF家族的基因的一種，控制細胞的增殖、分化，可以期待表皮的代謝促進及抗皺紋效果。去乙?；敢脖环Q為抗老化基因。通過活化去乙酰化酶基因，可以期待細胞壽命延長效果。端粒酶為端粒伸長酶，其也可以期待細胞壽命延長效果。
[0066]例如，在本發(fā)明的肽類的存在下，例如在以0.5mg/ml或lmg/ml的濃度含有本發(fā)明的肽類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)正常人真皮成纖維細胞的情況下，編碼上述的整聯(lián)蛋白等細胞粘附因子及股原蛋白等細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、或參與細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)、以及對皮膚能夠產(chǎn)生良好作用的蛋白質(zhì)的基因的mRNA產(chǎn)生量增加約10%以上、優(yōu)選約15%以上、更優(yōu)選約20%以上、進一步優(yōu)選約25%以上、特別優(yōu)選約30%以上。
[0067]另外，作為為對皮膚能夠產(chǎn)生不良作用的蛋白質(zhì)、且利用本發(fā)明的肽類而基因表達減少的蛋白質(zhì)，可列舉:前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxidesynthase)(前列腺素合成酶)、白細胞介素_6 (IL-6:1nterleukin6)等。
[0068]前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(前列腺素合成酶)及白細胞介素-6(IL_6)分別為在炎癥體系中起作用的酶及細胞因子。通過使這些基因的表達量降低，期待對炎癥的抑制有益。另外，這些基因表達產(chǎn)物直接或間接地促進黑色素產(chǎn)生，因此，通過使其表達量降低而抑制黑色素產(chǎn)生，可以期待美白效果。
[0069]例如，在本發(fā)明的肽類的存在下，例如在以0.5mg/ml或lmg/ml的濃度含有本發(fā)明的肽類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)正常人真皮成纖維細胞的情況下，編碼上述的對皮膚能夠產(chǎn)生不良作用的蛋白質(zhì)的基因的mRNA產(chǎn)生量減少約20%以上、優(yōu)選約30%以上、更優(yōu)選約40%以上、進一步優(yōu)選約70%以上、特別優(yōu)選約80%以上。
[0070]這些基因的表達是否增加及其增加量、或者是否減少及其減少量通過如下操作測定:例如，在本發(fā)明的肽類的存在下及非存在下培養(yǎng)正常人真皮成纖維細胞，從該細胞中提取RNA，使用固定有將認為對皮膚可以起作用的基因或其片段的DNA芯片測定RNA量，將在本發(fā)明的肽類的存在下進行培養(yǎng)的細胞中的RNA量和在非存在下進行培養(yǎng)的細胞中的RNA量進行比較即可。作為固定有將認為對皮膚可以起作用的基因或其片段的DNA芯片，可以使用例如人類版(卜版)皮膚芯片(SKNH-LX)Genopal U 二)一>)(注冊商標)(三菱Rayon(公司))?；虻谋磉_是否增加及其增加量、或者是否減少及其減少量也可以通過例如與上述同樣地進行處理對提取的RNA進行定量PCR(qPCR)來評價。
[0071]利用本發(fā)明的肽類，參與細胞和細胞外基質(zhì)的粘附的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量增加時，成纖維細胞及角化細胞等細胞在生物體的真皮或表皮內(nèi)與細胞外基質(zhì)粘附，增強細胞和細胞外基質(zhì)的結(jié)合。特別是成纖維細胞表面的整聯(lián)蛋白在生物體的真皮內(nèi)與細胞外基質(zhì)粘附，增強成纖維細胞和細胞外基質(zhì)的結(jié)合。另外，成纖維細胞在生物體的真皮內(nèi)與細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白粘附，膠原蛋白牢固地形成纖維束結(jié)構(gòu)，由此增強成纖維細胞和細胞外基質(zhì)的結(jié)合。其結(jié)果，使細胞和細胞外基質(zhì)的拉伸強度增加且緊致真皮、保持肌膚的張力及彈性。因此，本發(fā)明的肽類可以用于改善起因于細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的皮膚的皺紋及松弛、或者用于恢復(fù)肌膚的張力及彈性。而且，表皮角化細胞與基膜的細胞外基質(zhì)粘附，使表皮和基膜牢固地固著，由此抑制松弛(例如毛孔的松弛)及皺紋，還促進角化細胞的增殖，因此，也可以用于促進代謝、以及改善由其引起的斑點、暗淡。其中，代謝是指:在皮膚中，表皮的角化細胞在皮膚的基底層產(chǎn)生后形成角層，最終脫落。通過代謝，表皮的細胞替換為新的細胞。通過代謝促進，縮短了代謝所需要的時間。另外，通過促進真皮或表皮和基膜的粘附，向表皮的營養(yǎng)供給及轉(zhuǎn)錄因子的移動等變?yōu)槠交?，可以接近于更健康的皮膚狀態(tài)(例如沒有產(chǎn)生表皮的薄化的狀態(tài))。因此，本發(fā)明的肽類也可以用于改善起因于成纖維細胞或角化細胞和細胞外基質(zhì)(特別是基膜)之間的粘附能力降低的松弛及皺紋、代謝降低、斑點、暗淡、表皮的薄化。
[0072]而且，本發(fā)明的肽類使對皮膚能夠產(chǎn)生良好作用的基因的表達增加，其另一方面，使對皮膚能夠產(chǎn)生不良作用的基因的表達減少。其結(jié)果，可以使皮膚的狀態(tài)成為更健康良好的狀態(tài)。
[0073]本發(fā)明也包含含有上述的肽類作為有效成分的組合物。該組合物例如可優(yōu)選用作藥物組合物、化妝品組合物、食品組合物或飼料組合物，進而可優(yōu)選用于闡明與細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附性相關(guān)的生理狀態(tài)、或用于闡明皮膚狀態(tài)的研究試劑。優(yōu)選為用于美容的藥物組合物、化妝組合物、食品組合物或飼料組合物。在本發(fā)明中，用于美容的組合物(即美容組合物)是指:以美化面容及身體(例如對于皮膚的美化肌膚效果等的美容)為目的而使用的組合物。
[0074]作為藥物組合物，可列舉例如:起因于以人類為主的哺乳動物中的細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的疾病的預(yù)防劑和/或治療劑等。具體而言，本發(fā)明的藥物組合物，例如可以作為起因于由于年齡增加等而產(chǎn)生的成纖維細胞或角化細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的皮膚的皺紋或松弛的預(yù)防劑和/或治療劑、作為對于起因于上述粘附能力降低的皮膚的張力或者彈性降低的預(yù)防劑和/或治療劑、或者作為使肌膚緊致的劑、作為起因于上述粘附能力降低的皮膚的代謝不良及與其相伴的斑點或暗淡的預(yù)防劑和/或治療劑、或者作為起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的預(yù)防劑和/或治療劑等使用。含有本發(fā)明的肽類的藥物組合物對于預(yù)防和/或治療如上所述的皺紋、松弛、張力及彈性的降低、使肌膚緊致等是有益的，其也由后述的實施例3或6中所示的膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白產(chǎn)生促進效果的結(jié)果得知。
[0075]作為化妝品組合物，例如，也可作為用于預(yù)防和/或改善起因于以人類為主的哺乳動物中的細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的狀態(tài)的化妝品。具體而言，本發(fā)明的化妝品組合物，例如可以作為用于預(yù)防和/或改善起因于由于年齡增加等產(chǎn)生的成纖維細胞或角化細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的皮膚的皺紋或松弛的化妝品、作為用于預(yù)防和/或改善對于起因于上述粘附能力降低的皮膚的張力或彈性的降低的化妝品、或者作為用于使肌膚緊致的化妝品、作為用于預(yù)防和/或改善起因于上述粘附能力降低的皮膚的代謝不良及與其相伴的斑點或暗淡的化妝品、或者作為用于預(yù)防和/或改善起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的化妝品等使用。含有本發(fā)明的肽類的化妝品組合物對預(yù)防和/或改善如上所述的皺紋、松弛、張力及彈性的降低、使肌膚緊致等是有益的，其也由后述的實施例3或6中所示的膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白產(chǎn)生促進效果的結(jié)果得知。
[0076]作為食品組合物，例如也可用于預(yù)防和/或改善起因于以人類為主的哺乳動物中的細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的狀態(tài)的食品。具體而言，本發(fā)明的食品組合物，例如可以作為用于預(yù)防和/或改善起因于由于年齡增加等產(chǎn)生的成纖維細胞或角化細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的皮膚的皺紋或松弛的食品、作為用于預(yù)防和/或改善對于起因于上述粘附能力降低的皮膚的張力或彈性的降低的食品、或者作為用于使肌膚緊致的食品、作為用于預(yù)防和/或改善起因于上述粘附能力降低的皮膚的代謝不良及與其相伴的斑點或暗淡的食品、或者作為用于預(yù)防和/或改善起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的食品等使用。含有本發(fā)明的肽類的食品組合物對預(yù)防和/或改善如上所述的皺紋、松弛、張力及彈性的降低、使肌膚緊致等是有益的，其也由后述的實施例3或6中所示的膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白產(chǎn)生促進效果的結(jié)果得知。
[0077]本發(fā)明的食品組合物包括健康食品、特定保健用食品、營養(yǎng)功能食品、健康輔助食品等。這些組合物包括美容健康食品。特定保健用食品是指標有在飲食生活中以特定的保健的目的進行攝取、通過該攝取可以期待該保健目的的食品。這些食品在特定的實施方式中，可作為附有用于如上所述的用途的標識的食品來提供。即，可作為附有用于美容的標識、具有美化肌膚作用的標識、用于肌膚改善的標識、用于使皮膚的張力及彈性恢復(fù)的標識、用于預(yù)防或改善皮膚的皺紋及松弛的標識、用于使肌膚緊致的標識、用于預(yù)防或改善皮膚的代謝不良及與其相伴的斑點或暗淡的標識、用于附有預(yù)防或改善表皮薄化的標識的食品提供。
[0078]作為飼料，例如可以列舉:起因于牛、豬、雞、羊、馬等家畜及狗、貓等寵物中的細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附能力降低的狀態(tài)的預(yù)防用和/或改善用的飼料，起因于生物體內(nèi)的膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白量的減少的狀態(tài)的預(yù)防用和/或改善用的飼料等。
[0079]本組合物中的本發(fā)明的肽類的含量也根據(jù)組合物的劑型等而不同，一般而言，從得到高的細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附促進效果、或膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白產(chǎn)生促進效果的觀點出發(fā)，優(yōu)選為0.0001~100重量％，更優(yōu)選為0.001~95重量％，進一步優(yōu)選為0.01~90重量％，特別優(yōu)選為0.1~80重量％。
[0080]本發(fā)明的組合物可以通過在實現(xiàn)本發(fā)明的目的的范圍內(nèi)適宜配制除本發(fā)明的肽類之外在制劑領(lǐng)域或食品領(lǐng)域等的領(lǐng)域中通常使用的載體、基劑、和/或添加劑等來制備。
[0081]作為載體，例如可組合使用I種或2種以上糖類、纖維素類、水不溶性橡膠類、交聯(lián)乙烯基聚合物、脂質(zhì)類等。作為基劑，例如可組合使用I種或2種以上7K、油脂類、礦物油類、蠟類、脂肪酸類、硅酮油類、留醇類、酯類、金屬皂類、醇等。作為添加劑，例如可組合使用I種或2種以上表面活性劑、可溶化成分、乳化劑、油分、穩(wěn)定化劑、增粘劑、防腐劑、粘合劑、潤滑劑、分散劑、PH調(diào)節(jié)劑、保濕劑、紫外線吸收劑、螯合劑、經(jīng)皮吸收促進劑、抗氧化劑、崩解劑、增塑劑、緩沖劑、維生素類、氨基酸類、著色劑、香料等。
[0082]進而，為了根據(jù)需要附加其它有用的作用，也可以在本發(fā)明的組合物中組合配合I種或2種以上美白成分、抗炎癥成分、抗菌成分、細胞活化成分、收斂成分、抗氧化成分、粉刺改善成分、膠原蛋白等生物體成分合成促進成分、血液循環(huán)促進成分、保濕成分、抗老化成分等各種成分。
[0083]本發(fā)明的組合物可以為內(nèi)服劑(包括食品及飼料)或外用劑(包括化妝品)等任意的劑型。作為內(nèi)服劑(包括食品及飼料)，例如能夠以片劑、丸劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、干糖漿劑、液劑(包括清涼劑、懸浮劑、糖漿劑)、凝膠劑、脂質(zhì)體劑、提取劑、酊劑、檸檬水劑、果凍劑等任意的形態(tài)使用。
[0084]另外，在制成食品的情況下，也可以作為面包、面、家常菜、肉類加工食品(例如火腿、香腸等)、水產(chǎn)加工食品、調(diào)味料(例如調(diào)味汁等)、乳制品、點心(例如餅干、糖果、果凍、冰激凌等)、湯、果汁等含有在任意的通常的食品中的食品形態(tài)來提供。在形成這種形態(tài)的情況下，上述的水解物可依賴于目標食品的性質(zhì)等，由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用公知的方法適宜配制。
[0085]作為外用劑，例如能夠以液狀、乳液狀、霜狀、化妝水狀、膏狀、奶油狀、凝膠狀、片狀(攜帶基材)、氣霧狀、噴霧狀等任意的形態(tài)使用。
[0086]作為化妝品，例如能夠以化妝水、乳液、霜、油、潤膚膏等基礎(chǔ)化妝品、還有粉底霜、腮紅、口紅等化妝的化妝品、進而洗面奶、清潔卸妝膏、沐浴露等清潔劑、入浴劑等任意的形態(tài)使用。
[0087]作為飼料，由于能夠以任意的形態(tài)使用，因此，沒有特別限定。
[0088]本發(fā)明還包含一種促進細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附的方法、及促進膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白的產(chǎn)生的方法，其特征在于，使用上述肽類。在本發(fā)明的方法中，只要以可得到細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附促進效果的有效量以上、或可得到膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白的產(chǎn)生促進效果的有效量以上的量使用上述肽類即可。即，本發(fā)明的方法中的上述肽類的使用量通常在內(nèi)服劑的情況下，優(yōu)選對于成人每人體重約50kg為約0.001~1000mg/天,更優(yōu)選為約I~100mg/天,進一步優(yōu)選為約I~10mg/天。外用劑的情況下該使用量通常優(yōu)選對于成人每人體重約50kg為約0.1 μ g~2g/天。而且，用作外用劑的情況下，對上述肽類的皮膚的適用量優(yōu)選為約Ing~500 μ g/cm2、更優(yōu)選為約0.01 ~50 μ g/cm2、進一步優(yōu)選為約 0.1 ~10 μ g/cm2。
[0089]本發(fā)明還提供上述肽類用于制備用作促進細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附的組合物的用途。而且，本發(fā)明還提供上述肽類用于制備促進膠原蛋白、整聯(lián)蛋白和/或纖連蛋白的產(chǎn)生的組合物的用途。
[0090]就上述肽類的使用量而言，只要以成為上述組合物中的含量的方式使用即可。
[0091]<功能肽與融合肽>
[0092]如后述的實施例的結(jié)果所示，得知:由式⑴表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽或其肽變體可以使細胞中的整聯(lián)蛋白的表達量增加。而且也可以確認:由式(I)表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽或其肽變體實際上可以與細胞粘附。因此，通過使用本發(fā)明的肽或其肽變體，期待能夠增強意圖對細胞起作用的功能肽的細胞的活性。
[0093]因此，進一步從其它的觀點出發(fā)，本發(fā)明還提供一種包含(A)對細胞起作用的功能肽(以下，也稱為(A)要素)、和⑶由式⑴表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽或由在該氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽(以下，也稱為(B)要素)的融合肽。這種融合肽促進(B)要素通過整聯(lián)蛋白等的細胞粘附，能夠發(fā)揮細胞粘附促進效果，因此，可以提高(A)要素與細胞接觸的概率，進而有效地容易發(fā)揮(A)要素對細胞的作用。即，由本發(fā)明的式(I)表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽或其肽變體和功能肽的融合肽與細胞作用，當(dāng)上述融合蛋白質(zhì)存在于細胞的附近時，通過本發(fā)明的肽或肽變體的作用，整聯(lián)蛋白在細胞中的表達增加。而且，由本發(fā)明的式(I)表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽或其肽變體直接與細胞粘附。其結(jié)果，上述融合蛋白質(zhì)利用細胞粘附效果，與細胞接觸的概率升高，其結(jié)果，功能肽攝入于細胞中，或者與細胞表面的受體結(jié)合，能夠?qū)毎l(fā)揮其功能。
[0094]作為成為本發(fā)明的融合肽的構(gòu)成要素的㈧功能肽，可以為意圖對細胞發(fā)揮功能的任意的肽，具體而言，可以為生長因子、激素、拮抗劑、激動劑、或它們的一部分等。
[0095]生長因子(growth factor)也被稱為增殖因子或細胞增殖因子，是對特定的細胞的增殖及分化產(chǎn)生影響的蛋白質(zhì)的總稱。具體而言，可以列舉:轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、上皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(TOGF)、肝細胞增殖因子(HGF)等。優(yōu)選為轉(zhuǎn)化生長因子、上皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、肝細胞增殖因子。在本發(fā)明的融合肽中可以使用作為上述生長因子的一部分的肽。作為這樣的一部分肽，可以使用國際公開第2008/130082號小冊子中所記載的源自TGF-β的片段肽(例如具有Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr序列(SEQ IDNO: 12)的妝)等。
[0096] 激素是指作用于細胞并調(diào)節(jié)細胞的活性的生理活性物質(zhì)。在本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)中用作功能性因子的激素優(yōu)選為肽激素。作為肽激素，具體而言，可以列舉:促黑素細胞激素(MSH)、心房性鈉利尿肽(ANP)、心房性鈉利尿因子(ANF)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、催產(chǎn)素、血管加壓素等。優(yōu)選為促黑素細胞激素。在本發(fā)明的融合肽中可以使用作為上述肽激素的一部分的肽，作為這樣的一部分肽，可以使用美國專利第6245342號、美國專利第7737119號中所記載的a -MSH的片段肽(例如具有 Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly 序列(SEQ ID NO:13)的肽)等。
[0097]拮抗劑是指具有與細胞的受體作用而阻礙配體向該受體的結(jié)合的作用的物質(zhì)的總稱。具體而言，可以列舉RAGE拮抗劑等。RAGE拮抗劑是指對于由認為是老化現(xiàn)象之一的蛋白質(zhì)的糖化產(chǎn)生的終末糖化產(chǎn)物(也被稱為AGE)的受體(RAGE =Receptor for AGE)拮抗性地作用、阻礙配體的結(jié)合的物質(zhì)。在本發(fā)明的融合肽中也可以使用RAGE拮抗劑的一部分，作為這樣的一部分肽，可以使用美國專利申請公開第2010/0249038號中所記載的RAGE拮抗劑的一部分等。
[0098]激動劑是指與細胞的受體作用而發(fā)揮與作用于該受體的配體相同的作用的物質(zhì)的總稱。在本發(fā)明的融合肽中也可以使用作為這種激動劑的一部分的肽。
[0099]予以說明，在本發(fā)明的融合肽中，作為(A)要素的功能肽、和作為(B)要素的式(I)表示的肽或其肽變體的融合的順序沒有特別限定，可以為㈧要素在N末端側(cè)且⑶要素在C末端側(cè)，也可以為其相反。予以說明，在融合肽中，有時將N末端側(cè)的肽稱為頭部肽，將C末端側(cè)的肽稱為尾部肽。
[0100]另外，本發(fā)明的融合肽可以為僅由(A)要素及(B)要素構(gòu)成的融合肽，也可以為含有(A)要素及(B)要素以外的其他氨基酸序列的融合肽。而且，本發(fā)明的融合肽既可以為直接連接(A)要素和(B)要素的融合肽，也可以為在(A)要素和(B)要素之間含有作為接頭的氨基酸序列的融合肽。通過接頭融合㈧要素和⑶要素的情況下，㈧要素及(B)要素的各自的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性升高，可以期待容易發(fā)揮更高的效果。因此，本發(fā)明的融合肽優(yōu)選在(A)要素和(B)要素之間含有接頭。另外，本發(fā)明的融合肽含有多個功能肽作為(A)要素的情況下，優(yōu)選以在各功能肽間也含有接頭的方式構(gòu)成。
[0101]本發(fā)明的融合肽中所含的接頭只要對(A)要素和(B)要素的各自的功能發(fā)揮沒有影響，就可以為任意的接頭序列。作為接頭的一個實例，可以列舉由氨基酸構(gòu)成的接頭。其中，作為可用于接頭的氨基酸，為在同一分子內(nèi)具有氨基(-NH2基)和羧基(-C00H基)兩者的有機化合物，既可以為氨基和羧基結(jié)合于同一碳的α-氨基酸(例如，甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸)、蘇氨酸、蛋氨酸)，也可以為丙氨酸、氨基丁酸(例如4-氨基丁酸)、氨基戊酸(例如5-氨基戊酸)、氨基己酸(例如6-氨基己酸)、氨基庚酸(例如7-氨基庚酸)、氨基辛酸(例如8-氨基辛酸)、氨基壬酸(9-氨基壬酸)、氨基癸酸(例如10-氨基癸酸)、氨基十一烷酸(例如ll-氨基^^一烷酸)、氨基月桂酸(例如12-氨基月桂酸)、氨基十三烷酸(例如13-氨基十三烷酸)、氨基十四烷酸(例如14-氨基十四烷酸)、氨基十五烷酸(例如15-氨基十五烷酸)、氨基棕櫚酸(例如16-氨基棕櫚酸)等碳數(shù)2~50左右、優(yōu)選碳數(shù)2~30左右、更優(yōu)選碳數(shù)2~20左右、進一步優(yōu)選碳數(shù)2~15左右的氨基羧酸。優(yōu)選可以列舉由甘氨酸、絲氨酸、和/或碳數(shù)2~20的氨基羧酸構(gòu)成的接頭，更優(yōu)選可以列舉由甘氨酸和/或碳數(shù)2~15的氨基羧酸構(gòu)成的接頭，進一步優(yōu)選可以列舉僅由甘氨酸構(gòu)成的接頭。
[0102]接頭的氨基酸長度沒有特別限定，通常為I~20殘基，優(yōu)選為I~15殘基，更優(yōu)選為I~10殘基，進一步優(yōu)選為I~5殘基，更進一步優(yōu)選為I~3殘基。
[0103]更簡便而言，本發(fā)明的融合肽可以用本領(lǐng)域中公知的化學(xué)合成方法(例如固相法(例如Fmoc法)、液相法等)來制備?；瘜W(xué)合成融合肽的情況下，可以個別地準備㈧要素、(B)要素及根據(jù)需要的接頭等其它肽之后使它們?nèi)诤?，或者可以預(yù)先設(shè)計含有(A)要素及(B)要素、以及根據(jù)需要的接頭等的融合肽的一系列的氨基酸序列，以從N末端或C末端逐個合成的形式制備這樣設(shè)計的融合肽的氨基酸序列。
[0104]另外，本發(fā)明的融合肽以能夠起作用的形式符合讀框地連接編碼作為(A)要素的功能肽的DNA和編碼作為(B)要素的式(I)表示的肽或其肽變體的DNA，將該融合DNA導(dǎo)入到表達載體，通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎袑?dǎo)入該載體而使其表達，由此，在基因工程方面可以作為重組肽進行制備。此時，可以以能夠起作用的形式連接啟動子及終止子等要素。另外，在配置僅由遺傳性地被編碼的氨基酸構(gòu)成的接頭的情況下，可以在編碼作為(A)要素的功能肽的DNA和編碼作為(B)要素的式(I)表示的肽或其肽變體的DNA之間插入編碼上述的接頭肽的DNA。
[0105]另外，也可以以與上述相同的目的使用將本發(fā)明的融合肽進行了衍生物化的物質(zhì)、或使本發(fā)明的融合肽或其衍生物作為鹽的形態(tài)的物質(zhì)。融合肽的衍生物、或融合肽或其衍生物的鹽可以為與前述的本發(fā)明的肽類相同的衍生物或鹽的形態(tài)。
[0106]本發(fā)明也包含含有上述融合肽的組合物。該組合物可以作為用于使功能肽作用于細胞的組合物進行使用。該組合物中的融合肽類的配合量、及其它能夠配合的成分(載體、基劑或添加劑等)的種類及配合量或組合物的形態(tài)等與含有前述的本發(fā)明的肽類的組合物是相同的。另外，該組合物的用途既可以與含有前述的本發(fā)明的肽類的組合物相同，也可以根據(jù)該功能肽的效果進一步用于其它的用途。例如，在與期待發(fā)揮對皮膚有良好作用(例如，皮膚的皺紋、松弛、張力降低、彈性降低、代謝不良、斑點、暗淡、或表皮薄化的預(yù)防和/或改善；使肌膚緊致和/或美白；皮膚中的炎癥的預(yù)防和/或改善；皮膚中的蛋白質(zhì)的糖化(AGE生成)等皮膚老化癥狀的預(yù)防和/或改善等)的功能肽融合的情況下，除利用本發(fā)明的肽類自身的作用之外，可以為了得到基于該功能肽產(chǎn)生的作用的效果而有益地使用。
[0107]【實施例】
[0108]以下，基于實施例，對本發(fā)明詳細地進行說明，但本發(fā)明并不受這些實施例限制。
[0109]實施例1:GRIRVL (Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu)肽的制備
[0110](I)肽的合成:
[0111]使用肽自動合成裝置(島津制作所制:PSSM8)，通過利用Fmoc法的固相合成法合成GRIRVL肽。具體的步驟如下所述:首先,使Fmoc-Leu-OH的C末端與固相合成用樹脂結(jié)合后，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，接著，將該樹脂中和、清洗后，將Fmoc-Val-OH導(dǎo)入Leu的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，再次將該樹脂中和、清洗后，將Fmoc-Arg (Pmc) -OH導(dǎo)入Val的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和、清洗后，將Fmoc-1le-OH導(dǎo)入Arg的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和、清洗后,將Fmoc-Arg(Pmc)-OH導(dǎo)入Ile的N末端。接著,通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，再次將該樹脂中和、清洗后，將Fmoc-Gly-OH導(dǎo)入Arg的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，從該樹脂中切出肽鏈。通過利用TFA(三氟乙酸)切斷Arg的Pmc基來進行脫保護。最后，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)物來進行精制，由此得到GRIRVL。
[0112](2)肽的純度檢定:
[0113]將得到的精制物附于分析用反相高效液相色譜法[柱=Inertsil ODS-3 (內(nèi)徑:
4.6_、長度:250mm), GL Sciences社制；移動相:溶劑八(0.05%三氟乙酸)及溶劑B (0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(O分鐘(溶劑B = 0%)~30分鐘(溶劑B = 11%));流速:1ml/分鐘；檢測法:波長220nm中的吸光度]，其結(jié)果，在5.5分鐘顯示單一的尖銳的峰，純度為99.9%ο
[0114]實施例2:利用微陣列測定基因表達
[0115]使用含10%胎牛血清(FBS)達爾伯克改良MEM(DMEM) (GIBCO)在12孔微孔板上以
3.0 X 14細胞/cm2的細胞密度接種正常人真皮成纖維細胞(KF-4009;倉敷(^ 9 #々))。接種24小時后，以指定的濃度(0.5mg/ml或lmg/ml)與含有上述實施例1中制備的GRIRVL肽的DMEM進行交換，培養(yǎng)48小時。另外，作為對照(無處理組)，準備用不含有被驗肽的DMEM進行了交換的孔，同樣地培養(yǎng)48小時。接著，使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN制)和QIA shredder (QIAGEN制)，從GRIRVL肽處理組及無處理組的成纖維細胞中各自提取RNA。對提取的各RNA，使用人類版皮膚芯片(SKNH-LX)Genopal (夕二 ^ 一 >)(注冊商標)(三菱Rayon (公司)制)，比較GRIRVL肽處理組和無處理組的基因表達譜。在該人類版皮膚芯片上將與肌膚的形成及新陳代謝有關(guān)的基因及與炎癥及毒性有關(guān)的有可能作用于皮膚的139個基因固定化。關(guān)于139個基因中的通過GRIRVL肽處理看到表達的增減的基因，作為將無處理組中的表達量設(shè)定為100時的GRIRVL肽處理組中的表達量之比算出的結(jié)果表示于下述的表1~4中。表1及表2所示的基因為可直接或間接地參與細胞和細胞外基質(zhì)的粘附的基因，表3及表4所的基因不直接參與細胞和細胞外基質(zhì)的粘附，但為對皮膚能夠產(chǎn)生良好作用或不良作用的基因。
[0116 ]【表1】

【權(quán)利要求】
1.一種由下述的式(I):
Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:1) 所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有I或多個氨基酸的添加、缺失和/或保守性置換的氨基酸序列構(gòu)成的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽，為Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:1), Gly-Arg-1le-Arg-Val(SEQ ID NO:4)、Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:5) , Gly-Arg-1le-Arg (SEQ ID NO:6)、Gln-Tyr-Gly-Arg-1le-Arg(SEQ ID NO:8) > Tyr-Gly-Arg-1le-Arg-Val(SEQ ID NO:9)、Arg-1Ie-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO:10), Ile-Arg-Val-Leu-Gln-Arg(SEQ ID NO:7)、Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO:11) > Tyr-Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO:3)、或 Gly-Arg-1le-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO:2)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽，具有4~8殘基的氨基酸長度。
4.一種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1~3中任一項所述的肽或者該肽的衍生物、或它們的鹽。
5.如權(quán)利要求 4所述的組合物，所述組合物用于美容。
6.如權(quán)利要求4或5所述的組合物，所述組合物用于改善或預(yù)防皮膚的皺紋、松弛、張力降低、彈性降低、代謝不良、斑點、暗淡或表皮薄化。
7.如權(quán)利要求4~6中任一項所述的組合物，所述組合物用于使肌膚緊致。
8.如權(quán)利要求4~7中任一項所述的組合物，所述組合物用于促進選自由膠原蛋白、整聯(lián)蛋白及纖連蛋白構(gòu)成的組中的至少I種的產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求4~8中任一項所述的組合物，所述組合物用于使編碼細胞粘附因子、細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或參與細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)的基因的表達增加。
10.一種融合肽或者該融合肽的衍生物或它們的鹽，由對細胞起作用的功能肽和權(quán)利要求I~3中任一項所述的肽融合而成。
11.如權(quán)利要求10所述的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽選自由生長因子、激素、拮抗劑、激動劑及它們的一部分構(gòu)成的組中的I種以上。
12.如權(quán)利要求10或11所述的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽為來自轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)的片段肽或來自促黑素細胞激素(MSH)的片段肽。
13.如權(quán)利要求10~12中任一項所述的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，功能肽和權(quán)利要求1~3中任一項所述的肽通過接頭融合。
14.如權(quán)利要求10~13中任一項所述的融合肽或者該融合肽的衍生物、或它們的鹽，其中，權(quán)利要求1~3中任一項所述的肽與細胞粘附。
15.一種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求10~14中任一項所述的融合肽或該融合肽的衍生物、或它們的鹽。
【文檔編號】C07K19/00GK104072582SQ201410120069
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】熊澤益德, 池山芳史, 黑瀨沙予, 中田溫子, 本多裕之, 加藤竜司 申請人:樂敦制藥株式會社