一種人血漿蛋白ｃ濃縮物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備人血漿蛋白C濃縮物的方法，它包括如下步驟：（1）凝膠吸附：取凝膠，充分溶脹，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血漿，加入量為凝膠的250～750倍（v/w），攪拌吸附，去上清，洗滌，洗脫，得洗脫液；（2）超濾，透析：將洗脫液超濾，得濃縮液，再透析至電導(dǎo)率低于10mS/cm；（3）S/D滅活；（4）肝素親和層析：用緩沖液平衡肝素親和層析柱，上樣，用氯化鈉濃度為0.01～0.1M的緩沖液洗滌，再用氯化鈉濃度為0.1～0.18M的緩沖液洗脫，得洗脫液；（5）超濾，透析，無菌分裝，凍干，干熱病毒滅活，即可。本發(fā)明制備方法簡單，成本低，得率很高，制得的產(chǎn)品純度高，活性強(qiáng)，工業(yè)應(yīng)用前景良好。
【專利說明】一種人血漿蛋白C濃縮物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及血液制品的制備方法，特別涉及一種制備人血漿蛋白C濃縮物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人血漿蛋白C，又稱蛋白C (protein C，PC)是一種分子量約為62kD的糖蛋白，在血漿中含量約為2-6mg/L。PC是一種維生素K依賴性血漿蛋白，與其他維生素K依賴的蛋白質(zhì)(如凝血因子I1、VI1、IX和X)理化性質(zhì)相似，通過滅活凝血因子Va、VDa，增高纖溶酶原激活因子，從而維持血液凝血和纖溶系統(tǒng)的動態(tài)平衡。由PC及其輔助因子，抑制因子組成的PC系統(tǒng)，目前已確認(rèn)為機(jī)體抗凝血機(jī)制的一個重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在抗血栓性疾病中起著重要作用。目前，蛋白C主要從血漿中分離純化而制得，得到的終產(chǎn)品通常稱為人血漿蛋白C濃縮物。[0003]目前，采用離子交換層析和單克隆免疫親和層析相結(jié)合的方法可以制備高純度蛋白C濃縮物的方法，但是，該方法需要采用單克隆免疫親和層析，成本太高，且有鼠源蛋白污染的可能性。
[0004]采用離子交換層析或者親和層析的方法分離純化，則需要采用多步離子交換或者親和層析組合，步驟繁瑣，且收率很低，難以大規(guī)模運用。如，Radosevich等(J.Chromatogr.B，2003，790:199 - 207 )公開了一種從血漿中分離純化蛋白C濃縮物的方法，具體是凝膠吸附后，再通過 DEAE Sepharose CL 6B, DEAE Sepharose FF, DMAE-Fractogel EMD 及Heparin-Sepharose CL6B四步層析純化,其獲得的人血衆(zhòng)蛋白的活性較高,約58IU/ml,但收率太低，小于10%，步驟繁瑣；沈永才等，“人血漿蛋白C的純化與鑒定”，中國生物制品學(xué)雜志，2004年06期也公開一種純化方法，具體是先采用凝膠吸附，再采用離子交換層析和肝素親和層析組合純化，其獲得的人血漿蛋白C濃縮物的純度為90.63%，但收率較低，僅12.5%，工藝也比較復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的人血漿蛋白C濃縮物的制備方法及該方法制備得到的人血漿蛋白C濃縮物。
[0006]本發(fā)明制備人血漿蛋白C濃縮物的方法，它包括如下步驟:
[0007](I)凝膠吸附:取凝膠，充分溶脹，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血漿，加入量為凝膠的250~750倍(v/w)，攪拌吸附，去上清，洗滌，洗脫，得洗脫液；
[0008](2)超濾，透析:將洗脫液超濾，得濃縮液，再透析至電導(dǎo)率低于lOmS/cm ；
[0009](3) S/D 病毒滅活；
[0010](4)肝素親和層析:用緩沖液平衡肝素親和層析柱，上樣，用氯化鈉濃度為0.01~
0.1M的緩沖液洗滌，再用氯化鈉濃度為0.1~0.18M的緩沖液洗脫，得洗脫液，其中，洗滌和洗脫采用的緩沖液中，氯化鈉濃度不同時為0.1M ；[0011 ] (5)超濾，透析，無菌分裝，凍干，干熱病毒滅活，即可。
[0012]去冷沉淀血衆(zhòng)(Cryoprecipitate-reducedplasma, CRP)是新鮮冰凍血衆(zhòng)(Freshfrozen plasma, FFP)在一定溫度條件下制備冷沉淀時分離所得的上清血衆(zhòng)。
[0013]v/w,即 L:kg。
[0014]M，即 mol/L。
[0015]步驟(1)中，所述凝膠為DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose Fast Flow 或 DEAESepharose CL6B。
[0016]步驟(1)中，攪拌吸附的轉(zhuǎn)速為50-150轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選為80轉(zhuǎn)/分鐘。
[0017]步驟(1)中,所述去冷沉淀血衆(zhòng)的加入量為凝膠的500倍(v/w)
[0018]步驟(1)中:
[0019]所述平衡液是氯化鈉濃度為0.05~0.1M的緩沖液；
[0020]所述洗滌采用的洗滌液是氯化鈉濃度為0.15~0.25M的緩沖液；
[0021 ] 所述洗脫采用的洗脫液是氯化鈉濃度為0.4~2M的緩沖液。
[0022]優(yōu)選地，所述平衡液的氯化鈉濃度為0.08M ;所述洗滌液的氯化鈉濃度為0.2M ;所述洗脫液的濃度為0.5M。
[0023]其中，所述緩沖液是濃度為0.005~0.025M的檸檬酸鈉溶液，其pH為6.8-8.0。優(yōu)選地，所述檸檬酸溶液的濃度為0.015M, pH為7.3。
[0024]步驟(1)中:
[0025]所述吸附的溫度為2~8°C，時間為20~40分鐘；
[0026]所述洗滌的次數(shù)為3~5次，每次20~40min ；
[0027]所述洗脫的次數(shù)為I~3次，每次20~40min。
[0028]優(yōu)選地，
[0029]所述吸附是的時間是30分鐘；
[0030]所述洗滌的次數(shù)為3次，每次30min ；
[0031]所述洗脫的次數(shù)為I~3次，每次30min。
[0032]步驟(4)中，洗滌采用的緩沖液中，氯化鈉濃度為0.08M ;洗脫采用的緩沖液中，氯化鈉濃度為0.16M。
[0033]步驟(4)中，平衡采用的緩沖液的電導(dǎo)率為2_8mS/cm ;洗滌采用的緩沖液的電導(dǎo)率為5-12mS/cm ;洗脫采用的緩沖液的電導(dǎo)率為10-20mS/cm。
[0034]步驟(4)中，所述緩沖液是濃度為0.001~0.01M的檸檬酸鈉溶液或者濃度為
0.01~0.02M咪唑溶液；所述緩沖液的pH為5.5~6.5。
[0035]步驟(4)中，層析的溫度范圍為2~10°C，流速為50~144cm/h。
[0036]本發(fā)明還提供了前述方法制備的人血漿蛋白C濃縮物。
[0037]本發(fā)明藥物組合物，它是以前述的人血漿蛋白C濃縮物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成。
[0038]本發(fā)明人血漿蛋白C濃縮物的制備方法通過對工藝參數(shù)的特定選擇，僅僅采用凝膠吸附與一步層析相結(jié)合的方法，就制備得到了純度高達(dá)90%、活性高達(dá)30IU/ml的人血漿蛋白C濃縮物，收率也高達(dá)30%，制備方法簡單，操作簡便，成本低廉，具有良好的市場應(yīng)用前景。[0039]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0040]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0041]實施例1用本發(fā)明方法制備人血漿蛋白C濃縮物
[0042]1、實驗方法
[0043](1)人去冷沉淀血漿的制備
[0044]符合藥典要求的人新鮮冰凍血漿約1000L (重量約為1000kg)，用酒精消毒血漿袋后，在0_5°C融化血漿，離心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血漿。
[0045](2)凝膠吸附、純化
[0046]①DEAE Sephadex A50吸附:將2kg的DEAE Sephadex A50凝膠干粉充分溶脹，用平衡液(0.015M檸檬酸鈉，0.08M氯化鈉，ρΗ7.3)平衡5次，每次60L，然后加入步驟(1)中得到的去冷沉淀血漿，在2-8°C攪拌(攪拌的轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘)吸附30分鐘，上清液并入血漿罐,收集凝膠。
[0047]②洗滌:分別用60L pH7.3的含0.015M檸檬酸鈉，0.20M氯化鈉的洗滌液洗滌凝膠3次，每次攪拌30分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘)。
[0048]③洗脫:分別用60L pH7.3的含0.015M檸檬酸三鈉，0.5M氯化鈉的洗脫液洗脫凝膠2次，每次攪拌20分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘)。將兩次洗脫得到的蛋白洗脫液混合置于潔凈的容器中。
[0049](3)超濾、透析
[0050]對步驟(2)中所得蛋白洗脫液用IOkD孔徑超濾膜超濾、透析，使最終得到的濃縮液的電導(dǎo)為5mS/cm。
[0051](4) S/D病毒滅活
[0052]將步驟(3)的濃縮液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例緩慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween80)4kg，攪拌均勻，24-26°C連續(xù)攪拌6小時(轉(zhuǎn)速:100轉(zhuǎn)/分鐘)，每I小時記錄溫度一次。
[0053](5)肝素親和層析
[0054]用0.45 μ m膜過濾經(jīng)S/D滅活后的蛋白溶液，然后泵入肝素親和層析柱(柱高20cm，底面直徑450mm)中進(jìn)行親和層析。經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到蛋白C原液，其中層析溫度范圍為2~10°C，線流速113cm/h (體積流速為180升/小時)。
[0055]①平衡:用120升平衡液(0.008M檸檬酸鈉，pH5.8，電導(dǎo)約4mS/cm)對肝素親和膠進(jìn)行平衡；
[0056]②上樣:將步驟(4) S/D病毒滅活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜過濾，泵入層析柱中；
[0057]③洗滌:用160升洗滌液(0.008M檸檬酸鈉，0.08M氯化鈉，pH5.8，電導(dǎo)約為8mS/cm)對肝素親和層析柱進(jìn)行洗滌，觀察在線紫外吸收線，至紫外吸收線趨于基線時停止洗滌；
[0058]④洗脫:對肝素親和層析柱進(jìn)行洗脫(0.008M檸檬酸鈉，0.16M氯化鈉，pH5.8電導(dǎo)為15mS/cm)，觀察在線紫外吸收圖譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液(40升)，即為蛋白C原液。
[0059](6)超濾、透析
[0060]對步驟(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.15M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的蛋白C活性單位大于30IU。
[0061](7)無菌分裝
[0062](8)凍干
[0063]①將步驟(7)分裝后的制品于_30°C預(yù)冷凍，然后置于凍干機(jī)柜；
[0064]②將隔板溫度在30分鐘內(nèi)快速降至_40°C，保持2小時；
[0065]③開啟真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0066]④1.5小時內(nèi)將隔板溫度升至_30°C，保持4小時；
[0067]⑤2小時內(nèi)將隔板溫度升至_20°C，保持6小時；
[0068]⑥4小時內(nèi)將隔板溫度升至0°C，保持20小時；
[0069] ⑦4小時內(nèi)將隔板溫度升至30°C，保持6小時；真空度控制在5Pa以下保持I小時；
[0070]⑧真空壓塑料塞出柜
[0071](9)干熱病毒滅活
[0072]100°C水浴干熱滅活30分鐘，即可。
[0073]2、檢測
[0074]蛋白C活性檢測方法:待測樣品經(jīng)蛇毒激活劑激活后，加入顯色底物37°C孵育10分鐘后，加入酸性終止液終止反應(yīng)，然后在405nm檢測吸光值。
[0075]SDS-PAGE檢測蛋白C的純度。
[0076]回收率=最后得到的蛋白C制品的活性/原料血漿中蛋白C的總活性X 100%。
[0077]3、檢測結(jié)果
[0078]經(jīng)檢測，本發(fā)明方法的回收率約為30%，制備得到的蛋白C濃縮物的活性為30IU/ml,純度為90%。
[0079]實施例2用本發(fā)明方法制備人血漿蛋白C濃縮物
[0080]1、實驗方法
[0081]( I)人去冷沉淀血漿的制備
[0082]符合藥典要求的人新鮮冰凍血漿約500L (重量約為1000kg)，用酒精消毒血漿袋后，用酒精消毒血漿袋后，在0-5°C融化血漿，離心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血漿。
[0083](2)凝膠吸附、純化
[0084]①DEAE Sephadex A50吸附:將2kg的DEAE Sephadex A50凝膠干粉充分溶脹，用平衡液(0.005M檸檬酸鈉，0.05M氯化鈉，pH6.8)平衡5次，每次60L，然后加入步驟(1)中得到的去冷沉淀血漿，在2-8°C攪拌(攪拌的轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘)吸附20分鐘，上清液并入血漿罐,收集凝膠。
[0085]②洗滌:分別用60L pH6.8的含0.005M檸檬酸鈉，0.15M氯化鈉的洗滌液洗滌凝膠3次，每次攪拌20分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘)。
[0086]③洗脫:分別用60L pH6.8的含0.005M檸檬酸三鈉，0.4M氯化鈉的洗脫液洗脫凝膠I次，每次攪拌10分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘)。將兩次洗脫得到的蛋白洗脫液混合置于潔凈的容器中。
[0087](3)超濾、透析
[0088]對步驟(2)中所得蛋白洗脫液用IOkD孔徑超濾膜超濾、透析，使最終得到的濃縮液的電導(dǎo)為5mS/cm。
[0089](4) S/D病毒滅活
[0090]將步驟(3)的濃縮液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例緩慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween 80) 4kg，攪拌均勻，24-26 °C連續(xù)攪拌6小時(轉(zhuǎn)速:100轉(zhuǎn)/分鐘)，每I小時記錄溫度一次。
[0091](5)肝素親和層析
[0092]用0.45 μ m膜過濾經(jīng)S/D滅活后的蛋白溶液，然后泵入肝素親和層析柱(柱高20cm，底面直徑450mm)中進(jìn)行親和層析。經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到蛋白C原液，其中層析溫度范圍為2~10°C，線流速50cm/h (體積流速為79.5升/小時)。
[0093]①#衡:用120升平衡液(0.008M檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，，pH 5.5，電導(dǎo)約2mS/cm)對肝素親和膠進(jìn)行平衡；
[0094]②上樣:將步驟(4) S/D病毒滅活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜過濾，泵入層析柱中；
[0095]③洗滌:用160升洗滌液(0.0OlM檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，氯化鈉，pH 5.5，電導(dǎo)約為5mS/cm)對肝素親和層析柱進(jìn)行洗滌，觀察在線紫外吸收線，至紫外吸收線趨于基線時停止洗滌；
[0096]④洗脫:對肝素親和層析柱進(jìn)行洗脫(0.008M檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，，
0.1M氯化鈉，pH 5.5電導(dǎo)為lOmS/cm)，觀察在線紫外吸收圖譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液(40升)，即為蛋白C原液。
[0097](6)超濾、透析
[0098]對步驟(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.15M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的蛋白C活性單位大于30IU。
[0099](I)無菌分裝
[0100](8)凍干
[0101]①將步驟(7)分裝后的制品于_30°C預(yù)冷凍，然后置于凍干機(jī)柜；
[0102]②將隔板溫度在30分鐘內(nèi)快速降至_40°C，保持2小時；
[0103]③開啟真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0104]④1.5小時內(nèi)將隔板溫度升至_30°C，保持4小時；
[0105]⑤2小時內(nèi)將隔板溫度升至_20°C，保持6小時；
[0106]⑥4小時內(nèi)將隔板溫度升至0°C，保持20小時；
[0107]⑦4小時內(nèi)將隔板溫度升至30°C，保持6小時；真空度控制在5Pa以下保持I小時；
[0108]⑧真空壓塑料塞出柜[0109](9)干熱病毒滅活
[0110]100°C水浴干熱滅活30分鐘，即可。
[0111]實施例3用本發(fā)明方法制備人血漿蛋白C濃縮物
[0112]2、實驗方法
[0113](I)人去冷沉淀血漿的制備
[0114]符合藥典要求的人新鮮冰凍血漿約1500L (重量約為1000 kg)，用酒精消毒血漿袋后，用酒精消毒血漿袋后，在0-5°C融化血漿，離心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血漿。
[0115](2)凝膠吸附、純化
[0116]④DEAE Sephadex A50吸附:將2kg的DEAE Sephadex A50凝膠干粉充分溶脹，用平衡液(0.025M檸檬酸鈉，IM氯化鈉，pH 8.0)平衡5次，每次60L，然后加入步驟(1)中得到的去冷沉淀血漿，在2-8°C攪拌吸附30分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘)，上清液并入血漿罐，收集凝膠。
[0117]②洗滌:分別用60L pH 8.0的含0.025M檸檬酸鈉，0.25M氯化鈉的洗滌液洗滌凝膠5次，每次攪拌30分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘)。
[0118]③洗脫:分別用60L pH8.0的含0.025M檸檬酸三鈉，2M氯化鈉的洗脫液洗脫凝膠3次，每次攪拌30分鐘(攪拌的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘)。將兩次洗脫得到的蛋白洗脫液混合置于潔凈的容器中。
[0119](3)超濾、透析
[0120]對步驟(2)中所得蛋白洗脫液用IOkD孔徑超濾膜超濾、透析，使最終得到的濃縮液的電導(dǎo)為5mS/cm。
[0121](4) S/D病毒滅活
[0122]將步驟(3)的濃縮液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例緩慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween 80) 4kg，攪拌均勻，24-26 °C連續(xù)攪拌6小時(轉(zhuǎn)速:100轉(zhuǎn)/分鐘)，每I小時記錄溫度一次。
[0123](5)肝素親和層析
[0124] 用0.45 μ m膜過濾經(jīng)S/D滅活后的蛋白溶液，然后泵入肝素親和層析柱(柱高20cm，底面直徑450mm)中進(jìn)行親和層析。經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到蛋白C原液，其中層析溫度范圍為2~10°C，線流速144cm/h (體積流速為229升/小時)。
[0125]①「平衡:用120升平衡液(0.008M檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，pH 6.5，電導(dǎo)約8mS/cm)對肝素親和膠進(jìn)行平衡；
[0126]②上樣:將步驟(4) S/D病毒滅活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜過濾，泵入層析柱中；
[0127]③洗滌:用160升洗滌液(0.008M檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，0.1M氯化鈉，pH
6.5，電導(dǎo)約為12mS/cm)對肝素親和層析柱進(jìn)行洗滌，觀察在線紫外吸收線，至紫外吸收線趨于基線時停止洗滌；
[0128]④洗脫:對肝素親和層析柱進(jìn)行洗脫(0.008M檸檬酸鈉或者0.01M咪唑溶液，
0.18M氯化鈉，pH6.5，電導(dǎo)為20mS/cm)，觀察在線紫外吸收圖譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液(40升)，即為蛋白C原液。
[0129](6)超濾、透析[0130]對步驟(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.15M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的蛋白C活性單位大于30IU。
[0131](2)無菌分裝
[0132](8)凍干
[0133]①將步驟(7)分裝后的制品于_30°C預(yù)冷凍，然后置于凍干機(jī)柜；
[0134]②將隔板溫度在30分鐘內(nèi)快速降至_40°C，保持2小時；
[0135]③開啟真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0136]④1.5小時內(nèi)將隔板溫度升至_30°C，保持4小時；
[0137]⑤2小時內(nèi)將隔板溫度升至-20°C，保持6小時；
[0138]⑥4小時內(nèi)將隔板溫度升至0°C，保持20小時；
[0139]⑦4小時內(nèi)將隔板溫度升至30°C，保持6小時；真空度控制在5Pa以下保持I小時；
[0140]⑧真空壓塑料塞出柜
[0141](9)干熱病毒滅活
[0142]100°C水浴干熱滅活30分鐘，即可。
[0143]綜上，本發(fā)明方法的收率高達(dá)30%，制備得到的蛋白C濃縮物的活性為30IU/ml，純度為90%，制備方法簡單，操作簡便，成本低廉，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種制備人血漿蛋白C濃縮物的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)凝膠吸附:取凝膠，充分溶脹，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血漿，去冷沉淀血漿的加入量為凝膠的250~750倍(v/w)，攪拌吸附，去上清，洗滌，洗脫，得洗脫液； (2)超濾，透析:將洗脫液超濾，得濃縮液，再透析至電導(dǎo)率低于lOmS/cm； (3)S/D病毒滅活； (4)肝素親和層析:用緩沖液平衡肝素親和層析柱，上樣，用氯化鈉濃度為0.01~0.1M的緩沖液洗滌，再用氯化鈉濃度為0.1~0.18M的緩沖液洗脫，得洗脫液，其中，洗滌和洗脫采用的緩沖液中，氯化鈉濃度不同時為0.1M ； (5)超濾，透析，無菌分裝，凍干，干熱病毒滅活，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述凝膠為DEAESephadexA50、DEAE Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose CL 6B ;所述去冷沉淀血衆(zhòng)的加入量為凝膠的500倍(v/w)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中: 所述平衡液是氯化鈉濃度為0.05~0.1M的緩沖液； 所述洗滌采用的洗滌液是氯化鈉濃度為0.15~0.25M的緩沖液； 所述洗脫采用的洗脫液是氯化鈉濃度為0.4~2M的緩沖液； 優(yōu)選地: 所述平衡液的氯化鈉濃度為0.08M ； 所述洗滌液的氯化鈉濃度為0.2M ； 所述洗脫液的濃度為0.5M ； 優(yōu)選地: 所述緩沖液是濃度為0.005~0.025M的檸檬酸鈉溶液，其pH為6.8-8.0 ； 進(jìn)一步優(yōu)選地:所述檸檬酸溶液的濃度為0.015M, pH為7.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中: 所述攪拌吸附的溫度為2~8°C，時間為20~40分鐘，轉(zhuǎn)速為50-150轉(zhuǎn)/分鐘； 所述洗滌的次數(shù)為3~5次，每次20~40min ； 所述洗脫的次數(shù)為I~3次，每次10~30min ； 優(yōu)選地: 所述攪拌吸附是的時間是30分鐘，轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘； 所述洗滌的次數(shù)為3次，每次30min ； 所述洗脫的次數(shù)為2次，每次20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，洗滌采用的緩沖液中，氯化鈉濃度為0.08M ;洗脫采用的緩沖液中，氯化鈉濃度為0.16M。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，平衡采用的緩沖液的電導(dǎo)率為2-8mS/cm ;洗滌采用的緩沖液的電導(dǎo)率為5-12mS/cm ;洗脫采用的緩沖液的電導(dǎo)率為.10_20mS/cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，所述緩沖液是濃度為.0.001~0.01M的檸檬酸鈉溶液或者濃度為0.01~0.02M咪唑溶液；所述緩沖液的pH為.5.5 ~6.5o
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，層析的溫度范圍為2~10°C，流速為50~144cm/h。
9.權(quán)利要求1~8任意一項所述方法制備的人血漿蛋白C濃縮物。
10.一種藥物組合物，其特征在于:它是以權(quán)利要求9所述的人血漿蛋白C濃縮物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成。
【文檔編號】C07K14/47GK103910790SQ201410122447
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】王玉梅, 王宗奎, 李長清, 杜晞, 袁靖, 陳云華, 劉欣晏, 楊剛, 夏志明, 鄧靖 申請人:貴州泰邦生物制品有限公司, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所