Ehd2抗體及其在制備乳腺癌免疫組化檢測試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】EHD2抗體及其在制備乳腺癌免疫組化檢測試劑中的應(yīng)用，所述抗體能特異性識別人EHD2蛋白，所述識別位點的氨基酸序列為：503-SEQ?ID?NO：1-543。
【專利說明】EHD2抗體及其在制備乳腺癌免疫組化檢測試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是EHD2的表達與亞細胞定位與乳腺癌患者的生存具有顯著相關(guān)性，可以作為乳腺癌惡性度診斷和預(yù)后預(yù)判的一個分子指標。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性常見惡性腫瘤。全世界每年有一百萬婦女患病，自20世紀70年代末開始、我國乳腺癌的發(fā)病率一直居女性腫瘤的首位。北美、北歐原是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，現(xiàn)在我國的發(fā)病率也從五年前的十萬分之十七增加到去年的十萬分之五十二，呈快速上升趨勢，而且發(fā)病年齡也越來越年輕化，年齡最小的只有十四歲。引發(fā)乳腺癌的因素是多方面的，除遺傳因素外還有環(huán)境因素、精神因素及工作壓力太大等因素。而且經(jīng)濟越發(fā)達的城市發(fā)病率越高于農(nóng)村。目前世界各國投入較大的精力和物力來研究該病的發(fā)生、發(fā)展，以便采取積極的預(yù)防措施。
[0003]目前在臨床上對腫瘤的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對腫瘤組織和腫瘤細胞進行常規(guī)形態(tài)學觀察，它對癌細胞的分化程度和侵犯特性有較強的辨別能力，準確率可達50%-75%。然而，這種基于形態(tài)學的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗等人為因素影響，另一方面缺乏更深層次的與病人個體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)，因此亟需與現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合，才能提高判斷的準確性和特異性，特別是為個體化治療路徑與方案的選擇提供理論依據(jù)。
[0004]雖然腫瘤的發(fā)生 與多種因素相關(guān)，但最終的根源主要來自于基因水平的異常變化，包括基因的擴增、突變、缺失、異位等等，導(dǎo)致維持細胞正常生理狀態(tài)所需的多個功能蛋白在表達水平的高低、生化活性的強弱、甚至亞細胞結(jié)構(gòu)分布等方面產(chǎn)生變化，當這種變化賦予了細胞無限增殖能力及轉(zhuǎn)移能力，并不能被體內(nèi)外保護機制逆轉(zhuǎn)或殺滅時，便產(chǎn)生了腫瘤。因此，對腫瘤惡性本質(zhì)的深刻認識和有效控制的前提是明確這些功能蛋白分子的異變情況，這需要借助免疫組織化學的手段。
[0005]免疫組織化學技術(shù)應(yīng)用免疫學抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過抗體對體內(nèi)蛋白質(zhì)分子抗原的特異性識別，以及化學標記(熒光素、酶、金屬離子、同位素等)的第二抗體的顯色等作用來檢測組織細胞內(nèi)目標抗原(多肽和蛋白質(zhì))的表達量及其亞細胞定位。近年來，隨著免疫組織化學技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對腫瘤分子機制認識的不斷深入，免疫組化在腫瘤診斷與鑒別中的應(yīng)用價值受到了普遍的認可。比如雌激素受體ER、孕激素受體PR和表皮生長因子受體家族的Her2已經(jīng)被廣泛用于乳腺癌的臨床分子病理診斷，它對乳腺癌的病理分類和臨床用藥起到了積極的指導(dǎo)作用。這些成果離不開腫瘤基礎(chǔ)研究的進步，并期待新的分子指標被進一步揭不和納入臨床應(yīng)用，不斷提聞腫瘤診治水平。EHD2基因及其編碼蛋白即可能是這種新的分子指標。
[0006]EHD2(Epsin homology (EH)-domain-containing proteins)屬于EHD蛋白的一種，是一類新型膜轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白，含有高度保守的EH結(jié)構(gòu)域，此EH結(jié)構(gòu)域是一個含有約一百個氨基酸殘基的片段，早先發(fā)現(xiàn)于EGFR的激酶底物Epsl5 (Epdemal Growth Factor ReceptorPathway Substrate Clonel5)。EHD2參與胞膜轉(zhuǎn)運的各步調(diào)控,包括內(nèi)轉(zhuǎn)及前、后內(nèi)含體的過渡和調(diào)控循環(huán)通路；膜及膜蛋白的各路調(diào)節(jié)，包括消化降解及循環(huán)再生。是整個胞膜轉(zhuǎn)運機制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，對在各種細胞活動中維護物料傳輸信號傳導(dǎo)的動態(tài)平衡起著關(guān)鍵的作用，它的失調(diào)將導(dǎo)致信號應(yīng)答失當，細胞功能紊亂，并可能進而引發(fā)疾病。
[0007]中國文獻“EHD2干擾影響永生化乳腺上皮細胞的增殖和遷移”(王洪玉等，中國腫瘤臨床，2011年第38卷第11期，)公開了在乳腺腫瘤中EHD2的基因表達失調(diào)下降，提示該基因可能是一個新的乳腺抑癌基因。然而在進一步免疫組化研究中我們發(fā)現(xiàn)，雖然EHD2在總體表達量上呈現(xiàn)下降的趨勢，但這種趨勢主要在核中；相反，細胞漿中的表達卻有升高的趨勢。而且，EHD2在核中的表達水平與患者的生存情況密切相關(guān)。因此對EHD2進行免疫組化檢測將更客觀準確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個體的臨床預(yù)后情況。
[0008]現(xiàn)有的商業(yè)化EHD2抗體有十余種，由主流抗體試劑公司Santa Cruz和Abcam等提供，但是均屬于基礎(chǔ)研究用試劑，沒有依據(jù)表明這些抗體可以和我們的抗體一樣具有合格的特異性并可用于免疫組化檢測，特別是目前尚沒有任何其它EHD2抗體經(jīng)過大量組織標本的免疫組化驗證并顯示出可以通過對EHD2的亞細胞異常定位檢測來達到對腫瘤的惡性度及患者生存情況進行預(yù)后預(yù)判的目的。與本專利申請抗體相比它們有如下缺陷:
[0009]1、根據(jù)本領(lǐng)域公知常識，能夠用于免疫組化(IHC)的抗體會在其使用說明中作出明確標識和注明，按這些抗體的說明所示，大多數(shù)都不能用于免疫組化(IHC)檢測。雖然個別抗體標明可用于免疫組化(IHC)，但仔細研究發(fā)現(xiàn)并非如此。一個是南京森貝伽公司代理的EHD2抗體，但是注明了只能檢測膜定位。另一個是Proteintech公司的貨號為11440-1-AP的抗體，然而此抗體的特異性存在問題:首先免疫印跡檢測得到的主要信號位置明顯小于60kD，而70kD的正常位置信號卻很弱，說明雖然可以檢測到EHD2，但更多檢測到的是其它未知分子；其次從公司發(fā)表的該抗體對肺癌組織的免疫組化圖中可見染色信號為明顯的基質(zhì)成分的非特異性著色。
[0010]2、這些抗體均為研究用試劑，沒有經(jīng)過大樣本臨床病例試驗或驗證，沒有關(guān)鍵的對EHD2的核定位檢測能力，因此也就沒有“通過對EHD2的亞細胞異常定位檢測來達到對腫瘤的惡性度及患者生存情況進行預(yù)后預(yù)判的目的”的前提條件與基礎(chǔ)。
[0011]3、均沒有經(jīng)過嚴格的免疫印跡特異性驗證，特別是與EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、EHD3、EHD4的交叉 反應(yīng)的免疫印跡實驗驗證，而這些驗證對EHD2的免疫組化檢測方法來說尤其重要，因為它們之間具有很高的同源性(>70%)。
[0012]中國文獻“EHD2下調(diào)促進乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化的研究”(田剛等，現(xiàn)代醫(yī)學檢驗雜志，2012年第27卷第I期，49-51)公開了一種由其自制的EHD2抗體，這一抗體是采用我們的沒有經(jīng)過抗原純化的抗體，可以用于免疫印跡檢測，但不能滿足免疫組化檢測的高度特異性要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]我們在免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)，正常上皮細胞中EHD2主要分布在細胞核，同時細胞漿與膜中也有少量表達。但在乳腺癌組織中，EHD2的定位發(fā)生異變，核分布顯著下降，漿與膜分布卻出現(xiàn)升高的趨勢。臨床因素分析結(jié)果表明，EHD2的核分布情況與患者預(yù)后緊密相關(guān)，核表達越弱則患者的生存情況越差。這些發(fā)現(xiàn)表明乳腺癌的惡性度與癌組織細胞中EHD2蛋白的表達位置和表達水平發(fā)生異變的程度密切關(guān)聯(lián)，而免疫組化技術(shù)是檢測這種表達紊亂程度的唯一可靠手段。因此提供一種檢測EHD2基因的表達產(chǎn)物在癌細胞內(nèi)部不同位置特別是核中的表達情況的方法為現(xiàn)有技術(shù)中需要解決的問題。
[0014]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)手段和方案:
[0015]一種對人EHD2蛋白特異的抗體，其特征是所述抗體能特異性識別人EHD2蛋白，所述識別位點的氨基酸序列為:503-SEQ ID N0:l-543。
[0016]基因EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng)用，所述基因EHD2的GeneBank國際通用序列編號為:NM_014601，所述基因EHD2編碼蛋白的GeneBank國際通用序列編號為:NP_055416。
[0017]所述基因EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng)用，其特征是采用了前述抗體。
[0018]基因EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑中的應(yīng)用，所述基因EHD2的GeneBank國際通用序列編號為:NM_014601。
[0019]所述基因EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑中的應(yīng)用，其特征是采用了前述抗體。[0020]一種多肽，其特征是所述多肽氨基酸序列為SEQ ID NO:1，。
[0021]所述多肽，優(yōu)選以前述多肽氨基酸序列為核心序列對其進行修飾，所述修飾為在多肽N端連接一個半胱氨酸。
[0022]所述多肽在制備前述抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為作為抗原對動物進行免疫以制備EHD2抗體。
[0023]所述多肽在制備對EHD2特異的抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為對抗體進行抗原純化。
[0024]一種用于乳腺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化試劑，其特征是采用前述對人EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體。
[0025]本發(fā)明說明書中所采用的術(shù)語:
[0026]“基因EHD2的編碼蛋白“即“EHD2蛋白”。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，當說明書中提及“EHD2的表達”時，即是指“基因EHD2及其編碼蛋白的表達”。
[0027]“核心序列”為人EHD2蛋白(genebank蛋白號NP_055416)的第503至543位氨基酸序列，該核心序列對應(yīng)的多肽片段在化學合成后或重組表達后經(jīng)或不經(jīng)修飾可用于免疫以產(chǎn)生對EHD2特異的抗體。
[0028]“修飾”為對上述核心序列對應(yīng)的多肽片段用化學方法或重組DNA等常規(guī)方法進行添加氨基酸、偶聯(lián)化學基團或純化介質(zhì)，目的是用于免疫產(chǎn)生抗體或?qū)贵w進行抗原純化。
[0029]我們在研究中發(fā)現(xiàn)，基因EHD2的表達產(chǎn)物在乳腺上皮細胞癌變時表達分布出現(xiàn)紊亂趨勢，其紊亂程度尤其是核表達情況與患者的生存情況密切關(guān)聯(lián)，而采用免疫組化技術(shù)進行檢測并對結(jié)果進行人工判讀是了解這種基因在細胞內(nèi)不同位置表達紊亂程度的唯一可靠手段。但現(xiàn)有的EHD2抗體，多不能用于免疫組化檢測，而聲稱能夠用于免疫組化檢測的抗體并沒有免疫印跡證據(jù)顯示合格的特異性，特別是不能排除對EHD2的同源蛋白的交叉反應(yīng)性，且在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)或者僅能對細胞膜中的EHD2蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而不能識別重要的核中EHD2蛋白，或者檢測到的只是對間質(zhì)成分的非特異性信號。而且現(xiàn)有抗體均沒有在組織水平進行大樣本檢測和統(tǒng)計分析顯示具有識別EHD2核表達定位的特性并用于預(yù)后預(yù)判的作用。我們提供了一種對EHD2特異的經(jīng)抗原純化的抗體及其在制備免疫組織化學檢測試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的EHD2抗體具有合格的特異性，經(jīng)免疫印跡方法測試可以特異識別EHD2蛋白而不能識別高度同源的其它蛋白，可以采用免疫印跡方法進行EHD2蛋白定量檢測，還可以制備成免疫組化試劑，直接用于判斷組織細胞中EHD2的表達以及定位情況，尤其是可以用于監(jiān)測細胞核中EHD2的表達定位情況，從而可以更好的用于乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為特異性檢測實施例1中得到的免疫印跡圖；
[0031]圖2為免疫組化檢測實施例1中正常組織細胞的免疫組化圖；
[0032]圖3為免疫組化檢測實施例1中乳腺癌細胞的免疫組化圖；
[0033]圖4為免疫組化檢測實施例1中乳腺癌細胞的免疫組化圖；
[0034]圖5為免疫組化檢測實施例1中乳腺癌細胞的免疫組化圖；
[0035]圖6為免疫組化檢測實施例1中的260例樣本的無進展生存曲線圖。
【具體實施方式】:
[0036]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0037]抗體制備實施例1:對EHD2特異抗體的制備
[0038](I)實驗材料來源
[0039]新英格蘭大白兔購于上海強耀生物；
[0040]多肽CDEEFALASHLIEAKLEGHGLPANLPRRLVPPSKRRHKGSAE (該多肽是以氨基酸序列為SEQ ID NO:1的多肽為核心序列進行修飾得到的，其修飾方法為在N端連接一個半胱氨酸。)由天津賽爾生物技術(shù)有限公司定制并與KLH偶聯(lián)；
[0041]CNBr活化的凝膠珠、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自Invitrogen公司。
[0042](2)動物免疫
[0043]取4月齡新西蘭大白兔3只，將IOOug抗原多肽溶于0.2ml0.1M PBS(pH7.2)，與等體積弗氏完全佐劑充分混勻，腹部皮下多點注射。第一次免疫后第15和29天，分別用IOOug多肽/0.2mlPBS與等體積弗氏不完全佐劑充分混合后加強免疫。
[0044](3) EHD2抗血清的制備
[0045]于免疫結(jié)束后一周頸動脈取血，37°C靜置3小時后離心取血清。
[0046](4)抗原凝膠珠制備
[0047]CNBr活化的凝膠珠于ImM HCl中浸泡30分鐘，用偶聯(lián)緩沖液(含0.1MNaHC03pH8.3，和0.5M NaCl)清洗，按Img多肽加Iml凝膠的比例混合反應(yīng)體系，4度偶聯(lián)過夜，IM乙醇胺浸泡3小時后用清洗液I (含50mM Tris, IM NaCl, pH8.0)和清洗液2 (含50mM甘氨酸，IM NaCl, pH3.5)交叉清洗八遍，PBS清洗一遍。
[0048] (5 ) EHD2抗體的純化
[0049]血清與上述抗原凝膠珠按體積比為20:1的混合，加與混合后體系等體積的PBS，混勻I小時后離心，用PBS清洗凝膠珠，用pH3檸檬酸鈉溶液洗脫聯(lián)在凝膠珠上的抗體，調(diào)pH至6.5-7.5，得到純化后的EHD2抗體。
[0050]檢測實施例1:對EHD2抗體采用免疫印跡法進行特異性檢測
[0051](I)實驗材料來源:
[0052]293Τ 細胞購于美國 American Type Culture Collection(ATCC)公司；RPMI1940培養(yǎng)液、BSA、HRP標記抗兔二抗、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑、ECL化學發(fā)光檢測試劑等購于Invitrogen公司；EHD1、EHD2、EHD3、EHD4表達質(zhì)粒為自制。
[0053](2)細胞培養(yǎng)
[0054]293T細胞培養(yǎng)于RPMI1940培養(yǎng)液中，37°C、5%C02培養(yǎng)貼壁生長；細胞傳代時先棄去培養(yǎng)液，再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗兩遍,加入0.05%胰蛋白酶消化2分鐘，加入培養(yǎng)基終止消化。細胞保持良好狀態(tài)，兩天傳一代。轉(zhuǎn)染時分別加入表達EHD1、EHD2、EHD3、EHD4的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑，2天后收取細胞做免疫印跡實驗。
[0055](3)免疫印跡方法
[0056]將各種細胞預(yù)留足夠數(shù)量至離心管中，離心后RIPA裂解液裂解細胞，煮樣，再離心。制得樣品后，使用BCA檢測試劑進行蛋白濃度的測定。每個樣品分別取SOug蛋白總量進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將膠上蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫5%牛奶封閉I小時。洗滌后，與一抗(實施例1中制備的抗體以1:2000加入PBS和5%BSA)在室溫孵育I小時。然后與1:5000稀釋的抗兔二抗室溫孵育I小時。最后用化學發(fā)光檢測試劑檢測，檢測結(jié)果見圖3。從中可以看出，本 發(fā)明提供的對EHD2特異的抗體能夠特異識別EHD2蛋白，而對同源的其它EHD蛋白不能識別。
[0057](4)結(jié)果:抗EHD2抗體具有對EHD2蛋白的特異免疫識別能力，并對其它同源蛋白不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。檢測結(jié)果圖片見圖1，圖中:樣品Ve為空表達載體，無信號；樣品I過表達EHDl蛋白，無信號；樣品2過表達EHD2蛋白，在對應(yīng)分子量70kd位置呈一條主帶，信號清晰，并沒有其它明顯背景條帶；樣品3過表達EHD3蛋白，無信號；樣品4過表達EHD4蛋白，無信號。綜上，本實施例提供的抗體在正常位置70kd處具有強烈的信號，而且在其他位置均無信號，結(jié)果表明本發(fā)明提供的抗體具有很好的特異性。
[0058]免疫組化檢測實施例1:EHD2免疫組織化學檢測
[0059](I)實驗材料來源:
[0060]乳腺癌切片取自天津市腫瘤醫(yī)院腫瘤組織標本庫，常規(guī)脫蠟，樣本數(shù)量為260。一抗稀釋液、辣根過氧化物酶(HRP)標記的通用二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物、底物稀釋液等購自中杉金橋。
[0061](2)免疫組化檢測試劑組配條件及樣本組織中EHD2表達與定位的檢測方法:
[0062]方法主要步驟為:組織切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，內(nèi)源過氧化物酶阻斷，以1:200滴加實施例(I)制備得到的抗體作為一抗，4°C孵育過夜。緩沖液洗3次每次5min。滴加通用HRP酶標二抗，在室溫下孵育30分鐘。緩沖液洗3次每次5min。DAB顯色，復(fù)染，脫水封片后顯微鏡下觀察染色情況。
[0063](3)結(jié)果:
[0064]正常組織中EHD2在上皮細胞核中表達陽性，漿或膜表達弱陽性。癌組織中，EHD2表達發(fā)生紊亂，且核表達趨弱。典型免疫組化圖見圖2~圖5，圖2為正常組織的免疫組化圖，顯示出正常細胞EHD2在上皮細胞核表達，圖3~圖5為不同乳腺癌組織標本的免疫組化圖，圖3所示乳腺癌組織標本中EHD2在癌細胞核與漿中均有表達，圖4所示乳腺癌組織標本中EHD2在癌細胞核中不表達，衆(zhòng)中強表達；圖4所不乳腺癌組織標本中EHD2在乳腺癌細胞中表達整體缺失，表明EHD2在癌細胞中表達發(fā)生紊亂且核表達減弱。260例樣本的無進展生存曲線圖見圖6，該圖圖例:0為核表達陰性；1為核表達陽性，censored表示死亡。橫坐標為無進展生存月數(shù)，豎坐標為無進展生存病例百分數(shù)。從圖中可以看出核表達陰性的病例其預(yù)后明顯較核表達陽性的差。 [0065]以上實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供抗體為核心的免疫組化檢測方法，能很好地檢測乳腺癌組織細胞中EHD2的表達量和表達位置，便于從免疫組化圖中直接判讀EHD2在癌組織細胞核中的定位和表達情況以預(yù)判乳腺癌惡性度和患者生存前景。
【權(quán)利要求】
1.一種對人EHD2蛋白特異的抗體，其特征是所述抗體能特異性識別人EHD2蛋白，所述識別位點的氨基酸序列為:503-SEQ ID N0:l-543。
2.基因EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng)用，所述基因EHD2的GeneBank國際通用序列編號為:NM_014601，其特征是所述基因EHD2編碼蛋白的GeneBank國際通用序列編號為:NP_055416。
3.基因EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑中的應(yīng)用，其特征是所述基因EHD2的GeneBank國際通用序列編號為:NM_014601。
4.一種多肽，其特征是所述多肽氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征是以所述多肽氨基酸序列為核心序列對其進行修飾。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征是所述修飾為在多肽N端連接一個半胱氨酸。
7.如權(quán)利要求4-6任一所述的多肽在制備如權(quán)利要求1所述的抗體中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征是所述應(yīng)用為對抗體進行抗原純化。
9.如權(quán)利要求4-6任一所述多肽在制備對EHD2特異的抗體中的應(yīng)用。
10.一種用于乳腺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化試劑，其特征是采用如權(quán)利要求1所述的抗體作為一抗或核心抗體。
【文檔編號】C07K14/47GK103923212SQ201410125627
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】應(yīng)國光, 劉博
申請人:天津市應(yīng)世博科技發(fā)展有限公司