魚(yú)精蛋白模擬肽及其藥用鹽與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了魚(yú)精蛋白模擬肽及其藥用鹽與應(yīng)用。魚(yú)精蛋白模擬肽是由9～20個(gè)堿性氨基酸組成的直鏈多肽，所述堿性氨基酸為精氨酸（Arg，R）、賴氨酸（Lys，K）和組氨酸（His，H）中的一種或多種。經(jīng)驗(yàn)證，系列魚(yú)精蛋白模擬肽及其藥用鹽具有魚(yú)精蛋白的功能，在血液中對(duì)肝素具有中和與拮抗作用，可替代魚(yú)精蛋白在臨床上用于中和與拮抗血液中由肝素引起的出血傾向。
【專利說(shuō)明】魚(yú)精蛋白模擬肽及其藥用鹽與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及人為設(shè)計(jì)、人工合成的由堿性氨基酸組成的直鏈多肽分子(魚(yú)精蛋白模擬肽)，該多肽分子具有魚(yú)精蛋白的功能，在血液中對(duì)肝素具有中和與拮抗作用，可替代魚(yú)精蛋白在臨床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血傾向。

【背景技術(shù)】
[0002]心血管疾病患者在實(shí)施心外循環(huán)或支架介入的手術(shù)之前需向血管中注射抗凝藥肝素，以避免在手術(shù)過(guò)程中產(chǎn)生血栓，但在手術(shù)完成后需要及時(shí)消除血管中的肝素避免發(fā)生流血不止的惡性事件。目前，臨床上用于拮抗肝素的唯一藥物是魚(yú)精蛋白，但是使用魚(yú)精蛋白具有以下缺點(diǎn)或弊端:
[0003]1、魚(yú)精蛋白是從鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、鯡魚(yú)的成熟精子的細(xì)胞核中提取的蛋白，它包含的是一類蛋白分子群，其分子量在8000道爾頓以下，主要分子區(qū)間在4000-6000道爾頓范圍，因此嚴(yán)格地說(shuō)魚(yú)精蛋白不是單一分子的純蛋白制品；
[0004]2、由于魚(yú)精蛋白成品是非均一態(tài)的分子群，因此其拮抗肝素的作用量隨制備魚(yú)精蛋白的批次不同而不同，其質(zhì)量難以達(dá)到均一性及一致性；
[0005]3、魚(yú)精蛋白是從魚(yú)的成熟精子中提取，從生產(chǎn)原料的資源角度限制并制約了魚(yú)精蛋白的出產(chǎn)。
[0006]4、魚(yú)精蛋白是外源大分子蛋白，人體會(huì)對(duì)其產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，尤其對(duì)再次使用魚(yú)精蛋白的病人可能會(huì)造成重大醫(yī)療事故，存在臨床使用的隱患和風(fēng)險(xiǎn)。
[0007]使用魚(yú)精蛋白雖存在缺點(diǎn)或弊端,但到目前為止還未有其它可拮抗肝素的魚(yú)精蛋白替代藥物出現(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一系列人為設(shè)計(jì)、人工合成的由堿性氨基酸組成的直鏈多肽分子即魚(yú)精蛋白模擬肽，該多肽分子具有魚(yú)精蛋白的功能，在血液中對(duì)肝素具有中和與拮抗作用，可替代魚(yú)精蛋白在臨床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血傾向。
[0009]本發(fā)明提供的魚(yú)精蛋白模擬肽，是由9-20個(gè)堿性氨基酸組成的直鏈多肽，所述堿性氨基酸為選自精氨酸(八找，10、賴氨酸(1^8，10和組氨酸(把8，!0中的一種或多種。
[0010]氨基酸為多種時(shí)，直鏈多肽中三種堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸和組氨酸可以在任意位置、以任意比例組合。
[0011]具體的，所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽由9~20個(gè)單純精氨酸組成(R9~R20)，或由9~20個(gè)單純賴氨酸組成(K9~K20)，或由9~20個(gè)單純組氨酸組成(H9~H20)。少于7個(gè)氨基酸的肽鏈沒(méi)有拮抗肝素的效果，由9個(gè)氨基酸組成的肽鏈開(kāi)始顯示拮抗肝素的活性，且隨著氨基酸肽鏈的延長(zhǎng)，拮抗肝素的活性增加。另一方面，肽鏈拮抗肝素的效果與組成肽鏈的氨基酸堿性強(qiáng)弱呈正相關(guān)的關(guān)系，即相同數(shù)量的氨基酸肽鏈，單純由精氨酸組成的肽鏈拮抗肝素的效果優(yōu)于單純由賴氨酸組成的肽鏈，單純由賴氨酸組成的肽鏈拮抗肝素的效果優(yōu)于單純由組氨酸組成的肽鏈。
[0012]在以上由精氨酸組成的魚(yú)精蛋白模擬肽中以一個(gè)組氨酸替換，組氨酸可處于任意位置。組氨酸在肽鏈所處的位置未對(duì)模擬肽拮抗肝素效應(yīng)有明顯的干擾。
[0013]優(yōu)選的魚(yú)精蛋白模擬肽是由9~20 (尤其優(yōu)選為15)個(gè)精氨酸組成的肽鏈。
[0014]另一優(yōu)選魚(yú)精蛋白模擬肽是由9~20 (尤其優(yōu)選為15)個(gè)精氨酸組成的肽鏈，但其中任意一個(gè)位置可替換成一個(gè)組氨酸(基于15個(gè)精氨酸的直鏈長(zhǎng)肽，由14個(gè)精氨酸和I個(gè)組氨酸組成，標(biāo)記為R15-H)。該模擬肽有利于對(duì)該藥物分子做同位素(如碘)標(biāo)記。
[0015]另外，以上所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽任何成鹽形式的化合物(藥用鹽)也屬于本發(fā)明。成鹽形式包括無(wú)機(jī)鹽形式，如硫酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽等；有機(jī)鹽形式，如馬來(lái)酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、水楊酸鹽、蘋(píng)果酸鹽等。系列魚(yú)精蛋白模擬肽的無(wú)機(jī)、有機(jī)酸成鹽形式不影響其拮抗肝素的效果。
[0016]本發(fā)明另一目的在于提供所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽及其成鹽形式的化合物在制備拮抗肝素藥物中的應(yīng)用。該藥物在臨床上用于消除與中和血液中由肝素引起的出血傾向。
[0017]本發(fā)明設(shè)計(jì)、人工合成的由氨基酸組成的直鏈多肽分子(魚(yú)精蛋白模擬肽)相對(duì)魚(yú)精蛋白具有以下優(yōu)勢(shì):
[0018]1、療效確切:本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽及其成鹽形式的化合物在血液中對(duì)肝素具有中和與拮抗作用；
[0019]2、本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽是人為設(shè)計(jì)的多肽分子，由堿性氨基酸組成，具有明確的氨基酸組成及分子序列，便于人工合成。
[0020]3、本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽可通過(guò)人工合成的方式在短時(shí)間內(nèi)、大批量、高純度地制備完成，不僅擺脫了使用天然魚(yú)類資源的問(wèn)題又滿足了臨床上大批量需求的需要。
[0021]4、本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽的分子量比魚(yú)精蛋白小，其分子量約為1500-3000范圍，經(jīng)高效液相色譜法純化后肽純度>99.0 %，達(dá)到肽類藥物制備的國(guó)際純度標(biāo)準(zhǔn)，降低了臨床使用的致敏率，因此比使用天然魚(yú)精蛋白具有更高的安全性。
[0022]5、由于本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽是由單一分子構(gòu)成，因此使用劑量將更加嚴(yán)謹(jǐn)和精確，作用更確切。
[0023]試驗(yàn)證明，上述系列魚(yú)精蛋白模擬肽及其任何成鹽形式的化合物在血液中對(duì)肝素具有中和與拮抗作用，因此，可替代魚(yú)精蛋白，以系列魚(yú)精蛋白模擬肽或其任何成鹽形式的化合物為活性成分制備拮抗肝素藥物，在臨床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血傾向。
[0024]基于上述優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明的魚(yú)精蛋白模擬肽可替代魚(yú)精蛋白在臨床上用于消除與中和血液中由肝素引起的出血傾向，在臨床上具有獨(dú)特的作用。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

【具體實(shí)施方式】
[0026]生物體的遺傳基因被存儲(chǔ)在多聚核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，它們行使著各種生物學(xué)功能維持生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個(gè)自然界存在的天然氨基酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的千差萬(wàn)別。一般來(lái)說(shuō)，含有50個(gè)以上氨基酸的分子被稱為蛋白質(zhì)，一般超過(guò)10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱為多肽，少于10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱作寡肽。目前發(fā)現(xiàn)最小的功能肽鏈只有2個(gè)氨基酸。
[0027]由于人類基因組計(jì)劃的完成和人類蛋白組計(jì)劃的開(kāi)展，已有越來(lái)越多的蛋白質(zhì)功能片段被發(fā)現(xiàn)并被作為藥物應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域中來(lái)。現(xiàn)已在臨床上得到應(yīng)用的多肽藥物有“催產(chǎn)素”、“胸腺肽α 1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改構(gòu)制備成為用于治療消化道出血和肢端肥大癥的多肽藥物“奧曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白質(zhì)中的功能片段常常能篩選到含有幾十個(gè)或小到只由二個(gè)氨基酸組成的多肽片段，它們?yōu)槿斯ず铣啥嚯墓δ芷尾⑺鼈兺度霊?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0028]1963年,美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的Robert Bruce Merrifield教授建立了固相多肽合成法，開(kāi)創(chuàng)了一種革命性的有機(jī)固相合成法，它可快捷，簡(jiǎn)便高效的合成多肽，在此基礎(chǔ)上為多肽機(jī)械自動(dòng)化合成奠定了基礎(chǔ)并在60年代末世界上首次出現(xiàn)多肽自動(dòng)合成儀的雛形，隨著技術(shù)進(jìn)步及對(duì)多肽研究的需求，多肽合成儀的種類從合成量上分，可分為微克級(jí)、毫克級(jí)、克級(jí)和公斤級(jí)；從功能上分，可分為研究型、小試型、中試型、普通生產(chǎn)型和GMP生產(chǎn)型；從自動(dòng)化程度上分，可分為全自動(dòng)、半自動(dòng)和手動(dòng)型；從通道上分，可分為單通道的和多通道合成儀。R.Merrifield教授因此獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
[0029]如今多肽合成已成為一種商業(yè)化技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目，可按照客戶的需求進(jìn)行多肽合成及多肽修飾等服務(wù)。
[0030]本發(fā)明即借鑒現(xiàn)代技術(shù)手段，提供一系列人為設(shè)計(jì)、人工合成的魚(yú)精蛋白模擬肽，使其具有與魚(yú)精蛋白相同或近似的拮抗肝素的活性。
[0031]魚(yú)精蛋白(Protamine)是從魚(yú)類精巢中提取分離出的一種堿性蛋白質(zhì)，臨床用途廣泛，是最常用的肝素中毒解毒藥。
[0032]文獻(xiàn)介紹其氨基酸序列PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR (P代表脯氨酸，R代表精氨酸，S代表絲氨酸，V代表纈氨酸，G代表甘氨酸)，分子量約3800。雖然已有人測(cè)出魚(yú)精蛋白的一種氨基酸序列，但由于魚(yú)精蛋白為天然魚(yú)類精巢中的提取物，實(shí)際包括了非均一態(tài)的分子群，并非單一構(gòu)成，結(jié)構(gòu)有不確定性，事實(shí)上難以人工復(fù)制。本發(fā)明中，所謂“模擬”的概念，是指借鑒魚(yú)精蛋白已知的序列信息，通過(guò)人為設(shè)計(jì)的方式，獲取功能與魚(yú)精蛋白相同或類似、同樣具有拮抗肝素活性的人工產(chǎn)品，作為魚(yú)精蛋白的替代品。
[0033]為清楚展示本發(fā)明，以下分段落詳述。實(shí)施例或?qū)嶒?yàn)中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，可參考《多肽藥物研究與開(kāi)發(fā)》(主編:厲保秋，人民衛(wèi)生出版社，2011-07)，《硫酸魚(yú)精蛋白生物測(cè)定法》(2010版《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》，中國(guó)醫(yī)藥出版社)。
[0034]實(shí)施例或?qū)嶒?yàn)中提到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)可獲取的途徑以達(dá)到具體公開(kāi)的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。
[0035]實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，可結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明多肽的設(shè)計(jì)、特征、功效及具體應(yīng)用進(jìn)行深入了解，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0036]實(shí)施例1:魚(yú)精蛋白模擬肽的設(shè)計(jì)
[0037]設(shè)計(jì)思路及手段:肝素(Heparin)是一種從牛肺或豬小腸粘膜中提取的天然抗凝血物質(zhì)，其平均分子量為15KD的粘多糖硫酸脂，呈強(qiáng)酸性帶大量負(fù)電荷。根據(jù)肝素的化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn)，本發(fā)明首先采用荷正電的堿性氨基酸組成的多肽用以中和或拮抗帶大量負(fù)電荷的肝素。
[0038]按照堿性強(qiáng)弱排列，三種堿性氨基酸依次為精氨酸(Arg，R) >賴氨酸(Lys，K) >組氨酸(His，H)。通過(guò)理論設(shè)計(jì)和有效的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明最終確定了一系列人為設(shè)計(jì)、人工合成的魚(yú)精蛋白模擬肽。它們是由三種堿性氨基酸組成的氨基酸數(shù)量在9~20個(gè)的直鏈多肽，所述堿性氨基酸為精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)和組氨酸(His，H)。這里:三種堿性氨基酸可以在任意位置、以任意比例組合。具體來(lái)講，可進(jìn)行以下羅列:
[0039]A組:系列魚(yú)精蛋白模擬肽是由單純精氨酸(Arg，R)組成的氨基酸數(shù)量為9~20個(gè)的直鏈多肽(可表示為R9~R20)。少于7個(gè)精氨酸的肽鏈沒(méi)有拮抗肝素的效果，由9個(gè)精氨酸組成的肽鏈開(kāi)始顯示拮抗肝素的活性，且隨著精氨酸肽鏈的延長(zhǎng)，拮抗肝素的活性增加。
[0040] B組:系列魚(yú)精蛋白模擬肽是由單純賴氨酸(Lys，K)組成的氨基酸數(shù)量為9~20個(gè)的直鏈多肽(可表示為K9~K20)。少于7個(gè)賴氨酸的肽鏈沒(méi)有拮抗肝素的效果，由9個(gè)賴氨酸組成的肽鏈開(kāi)始顯示拮抗肝素的活性，且K9~K20范圍內(nèi)，隨著賴氨酸肽鏈的延長(zhǎng)，拮抗肝素的活性增加。
[0041]C組:系列魚(yú)精蛋白模擬肽是由單純組氨酸(HiS，H)組成的氨基酸數(shù)量為9~20個(gè)的直鏈多肽(可表示為H9~H20)。少于7個(gè)組氨酸的肽鏈沒(méi)有拮抗肝素的效果，由9個(gè)組氨酸組成的肽鏈開(kāi)始顯示拮抗肝素的活性，且H9~H20范圍內(nèi)，隨著組氨酸肽鏈的延長(zhǎng)，拮抗肝素的活性增加。
[0042]實(shí)驗(yàn)證明，由單一種類堿性氨基酸(精氨酸或賴氨酸或組氨酸)組成的肽鏈(A組-C組)對(duì)肝素均顯示有拮抗作用，肽鏈拮抗肝素的效果與組成肽鏈的氨基酸堿性強(qiáng)弱呈正相關(guān)的關(guān)系(參見(jiàn)試驗(yàn)2)，即相同數(shù)量的氨基酸肽鏈，單純由精氨酸組成的肽鏈(A組)拮抗肝素的效果優(yōu)于單純由賴氨酸組成的肽鏈(B組)，單純由賴氨酸組成的肽鏈(B組)拮抗肝素的效果優(yōu)于單純由組氨酸組成的肽鏈(C組)。
[0043]D組:混合氨基酸組，基于A-C組肽鏈均具有活性，可以以其中一組為基本肽鏈，在任意一個(gè)或多個(gè)位置替換成另外一種或兩種氨基酸以此形成的直鏈多肽。按照排列組合計(jì)算，D組所形成的多肽數(shù)量是龐大的。表1以9個(gè)精氨酸為基本肽鏈，改變其中2個(gè)氨基酸為例，直觀地給出混合氨基酸組的構(gòu)成，以幫助理解。顯然，表1中仍未窮盡該方式組合的多肽。
[0044]表1:9個(gè)精氨酸改變其中2個(gè)氨基酸的混合氨基酸
[0045]

【權(quán)利要求】
1.魚(yú)精蛋白模擬肽，是由9~20個(gè)堿性氨基酸組成的直鏈多肽，所述堿性氨基酸為選自精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)和組氨酸(His，H)中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽由.9~20個(gè)單純精氨酸組成(R9~R20)，或由9~20個(gè)單純賴氨酸組成(K9~K20)，或由.9~20個(gè)單純組氨酸組成(H9~H20)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:直鏈多肽中三種堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸和組氨酸可以在任意位置、以任意比例組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽基于9~20個(gè)單純精氨酸，且其中任意一個(gè)精氨酸被組氨酸替換(R9-H~R20-H)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:所述系列魚(yú)精蛋白模擬肽基于9~20個(gè)單純賴氨酸，且其中任意一個(gè)賴氨酸被組氨酸替換(K9-H~K20-H)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:所述魚(yú)精蛋白模擬肽由15個(gè)單純精氨酸組成(R15)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚(yú)精蛋白模擬肽，其特征在于:所述魚(yú)精蛋白模擬肽為基于15個(gè)精氨酸的直鏈長(zhǎng)肽，由14個(gè)精氨酸和I個(gè)組氨酸組成(R15-H)。
8.權(quán)利要求1-7任一所述魚(yú)精蛋白模擬肽的藥用鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述魚(yú)精蛋白模擬肽的藥用鹽，其特征在于，包括無(wú)機(jī)鹽形式，如硫酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽等；有機(jī)鹽形式，如馬來(lái)酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、水楊酸鹽、蘋(píng)果酸鹽等。
10.權(quán)利要求1-7任一所述魚(yú)精蛋白模擬肽或權(quán)利要求8-9所述魚(yú)精蛋白模擬肽的藥用鹽在制備拮抗肝素藥物中的應(yīng)用，該藥物在臨床上用于消除與中和血液中由肝素引起的出血傾向。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK104072587SQ201410129611
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月1日
【發(fā)明者】竇桂芳, 韓蘇, 孟志云, 朱曉霞, 甘慧, 顧若蘭, 吳卓娜, 劉桃云, 李儉, 鄭穎, 李通 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所, 韓蘇