一種誘導(dǎo)dc細(xì)胞成熟的苦蕎提取物、培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DC細(xì)胞成熟的苦蕎提取物、凝集素、誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。所述苦蕎提取物的提取方法包括：提取苦蕎種子所含蛋白質(zhì)；Resource?Q陰離子交換層析；和Sephadex?G75凝膠過濾層析，獲得包含分子量60～65kD的蛋白質(zhì)的層析餾分，所述層析餾分為所述苦蕎提取物。本發(fā)明建立了成熟、穩(wěn)定的誘導(dǎo)DC成熟的培養(yǎng)體系，所需的細(xì)胞因子少，且DC成熟度高，表面標(biāo)志物提升明顯。本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)樹突狀細(xì)胞疫苗提供了新型有效的途徑。
【專利說明】一種誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的苦蕎提取物、培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物提取物領(lǐng)域，特別涉及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的DC細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域

【背景技術(shù)】
[0002] 樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞 (Antigen presenting cells，APC)，它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有 較強(qiáng)的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中 心環(huán)節(jié)。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實(shí)體瘤內(nèi)浸潤的DC數(shù)量多則患者預(yù) 后好。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生以⑶8+T細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這也是 DC作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。
[0003] 《本草綱目》記載：苦蕎麥味苦，性平寒，益氣力，續(xù)精神，利耳目，有降氣寬腸健胃 的作用。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)觀察表明，苦蕎麥粉及其制品具有降血糖、降血脂，增強(qiáng)人體免疫力 的作用，對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、中風(fēng)等病人都有輔助治療作用。從苦蕎中提純 活性物質(zhì)，以便使其作用最大化，成為近來研究方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及一種本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)的能夠誘導(dǎo)DC成熟的苦蕎提取物及其提取方 法，和利用該苦蕎提取物制備的其誘導(dǎo)DC成熟的專用培養(yǎng)基、誘導(dǎo)方法，以及一種利用其 制備的免疫增強(qiáng)劑。
[0005] 具體而言，本發(fā)明涉及以苦蕎麥（拉丁名Fagopyrum tataricum，寥科，蕎麥屬）特 別是山西苦蕎黑風(fēng)一號(hào)種子（山西省農(nóng)科院種子資源所提供）為原料，提取、分離、純化得 到的一種具有凝集素活性的苦蕎蛋白質(zhì)類制品及其誘導(dǎo)DC成熟的專用培養(yǎng)基制備方法。
[0006] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種苦蕎提取物的提取方法，包括：提取苦蕎種 子所含蛋白質(zhì)；Resource Q陰離子交換層析；和Sephadex G75凝膠過濾層析，獲得包含分 子量約60?65kD的蛋白質(zhì)的層析餾分，所述層析餾分為所述苦蕎提取物。
[0007] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述苦蕎種子為山西苦蕎黑風(fēng)一號(hào)的種子。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述提取苦蕎種子所含蛋白質(zhì)的步驟包括：將烘干的所 述苦蕎種子脫殼粉碎；將粉碎后的所述苦蕎種子用醋酸鹽緩沖液在4°C下抽提；離心除去 沉淀；將離心后的上清液用硫酸銨沉淀，優(yōu)選使得硫酸銨的飽和度達(dá)到80%;和將得到的沉 淀用緩沖液溶解后透析，得到所述苦蕎種子所含蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種由上述方法獲得的苦蕎提取物，所述植物凝集素包含如上所 述的苦蕎提取物。所述苦蕎提取物優(yōu)選具有凝集素活性。優(yōu)選地，所述凝集素為所述分子 量約60?65kD的蛋白質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基，包含上述苦蕎提取物或植物 凝集素。
[0011] 該培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含RPMI-1640培養(yǎng)基、rhIL-4、rhGM-CSF和胎牛血清。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其中在所述培養(yǎng)基中所述苦蕎提取物中分子量為60? 65kD的蛋白質(zhì)的終濃度為45?55 μ g/mL，優(yōu)選50 μ g/mL。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的方法，所述方法包括用上述誘導(dǎo)樹突 狀細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2?3天，優(yōu)選2天。
[0014] 在用所述誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括：
[0015] 在含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入含DC的外周血單個(gè)核細(xì)胞和誘導(dǎo)因子 rhIL-4和rhGM-CSF，培養(yǎng)到第7?8天，優(yōu)選第7天時(shí)使用所述誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培 養(yǎng)基。
[0016] 本發(fā)明建立了成熟、穩(wěn)定的誘導(dǎo)DC成熟的培養(yǎng)體系，所需的細(xì)胞因子少，且DC成 熟度高，表面標(biāo)志物提升明顯。本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)樹突狀細(xì)胞疫苗提供了新型有效的途 徑。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種DC疫苗增強(qiáng)劑，包括上述苦蕎提取物或植物凝集素，優(yōu)選進(jìn) 一步包括rhIL-4和rhGM-CSF。本發(fā)明的苦蕎提取物通過誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟并促進(jìn)成熟DC 細(xì)胞增殖，不僅僅能夠由于科學(xué)研究中作為誘導(dǎo)試劑使用，還能夠調(diào)節(jié)人體免疫功能，進(jìn)而 起到改善物質(zhì)代謝、增強(qiáng)抗應(yīng)激功能、延緩衰老等作用，從而可用于保健品。
[0018] 另外，本發(fā)明的苦蕎提取物還可通過誘導(dǎo)DC成熟，提高DC疫苗的效率和細(xì)胞免疫 效果，來作為DC疫苗的增強(qiáng)劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為純化條件圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明制備的苦蕎凝集素的SDS-PAGE分析圖，其中：
[0021] 泳道1 :Mr :低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2 :Resource Q純化收集物，收集的Peak II ; 泳道3 :S印hadex G75凝膠柱純化的凝集素，收集的Peak IV ;
[0022] 圖3為流式細(xì)胞儀檢測(cè)含苦蕎凝集素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)DC成熟鑒定圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1 :苦蕎提取物的制備：
[0025] 將烘干的苦蕎麥種子，脫殼粉碎后，稱取50g粉末，加入500mL20mmol/L、pH5. 0的 醋酸鹽緩沖液，4°C抽提24h，12000r/min離心20min除去沉淀，在上中加入硫酸銨，使之 飽和度達(dá)到80 %，在4°C攪拌4h。12000r/min離心20min，收集沉淀，用30mL20mmol/L、 pH7. 0的Tris-HCl緩沖液重新溶解沉淀，并用同樣緩沖液透析，除去硫酸銨，分裝于EP管 中于-20°C的冰箱中保存?zhèn)溆?。將上述制備的蛋白粗品上樣于Resource Q柱，在AKTATM Explore進(jìn)行初步分離，收集洗脫峰。將蛋白樣品，分批上樣于Sephadex G75凝膠柱進(jìn)一步 分離純化，采用10mm〇l/L Tris-HCl緩沖液洗脫，控制流速在0. 5mL/min，收集各個(gè)洗脫峰。 將純化得到的苦蕎提取物進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，分裝于1. 5mLEP管中備用。本發(fā)明制備的苦 蕎提取物經(jīng)12. 5%，SDS-PAGE分析顯示分子量約為60?65kD(見圖1)。
[0026] 圖1 :苦蕎凝集素純化·粗蛋白上樣Resourc Q柱，經(jīng)1M NaCl Tris-HCl緩沖液 洗脫?？嗍w凝集素在Peak II中，收集Peak II，用s印hadex G75純化，洗脫得到Peak IV 具凝集活性。
[0027] 實(shí)施例2 :凝集素活性及凝集效價(jià)測(cè)定
[0028] 在"V"型血凝板中加入25μ 1生理鹽水，取凝集素樣品lmg/ml，25y 1作倍比稀釋， 每孔加入2 %的血球懸液，搖動(dòng)血凝板使溶液混勻，血凝板在室溫放置2h，肉眼或顯微鏡檢 測(cè)觀察結(jié)果。無血凝時(shí)血球沉于"V"型孔底部，呈一小圓點(diǎn)，凝集時(shí)血球相互集聚形成一片 網(wǎng)絡(luò)，血球不下沉。血凝滴度以2n(n為使血球凝集的最末孔數(shù)）表示。由表1中可見本發(fā) 明的苦蕎提取物對(duì)供試幾種血紅細(xì)胞有凝集活性，凝集滴度為28?210,證明，本蛋白制品 為一類血球凝集素。
[0029] 表1苦蕎提取物對(duì)幾種血紅細(xì)胞有凝集活性
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種苦蕎提取物的提取方法，包括： 提取苦蕎種子所含蛋白質(zhì)； Resource Q陰離子交換層析；和 Sephadex G75凝膠過濾層析， 獲得包含分子量60?65kD的蛋白質(zhì)的層析餾分，所述層析餾分為所述苦蕎提取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述苦蕎種子為山西苦蕎黑風(fēng)一號(hào)的種子及其種植 獲得的苦蕎種子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述提取苦蕎種子所含蛋白質(zhì)的步驟包括： 將烘干的所述苦蕎種子脫殼粉碎； 將粉碎后的所述苦蕎種子用醋酸鹽緩沖液在4°C下抽提； 離心除去沉淀； 將離心后的上清液用硫酸銨沉淀，優(yōu)選使得硫酸銨的飽和度達(dá)到80% ;和 將得到的沉淀用緩沖液溶解后透析，得到所述苦蕎種子所含蛋白質(zhì)。
4. 一種苦蕎提取物，所述苦蕎提取物由如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
5. 如權(quán)利要求4所述的苦蕎提取物，具有植物凝集素的活性。
6. -種誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基，包含如權(quán)利要求4或5所述的苦蕎提取物。
7. 如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，進(jìn)一步包含RPMI-1640培養(yǎng)基、rhIL-4、rhGM-CSF和胎 牛血清。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的培養(yǎng)基，其中在所述培養(yǎng)基中所述苦蕎提取物中分子量為 60?65kD的蛋白質(zhì)的終濃度為45?55 μ g/mL，優(yōu)選50 μ g/mL。
9. 一種誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述 的誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2?3天，優(yōu)選2天。
10. 如權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的方法，在用所述誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟 的培養(yǎng)基培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括： 在含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入含DC的外周血單個(gè)核細(xì)胞和誘導(dǎo)因子 rhIL-4和rhGM-CSF，培養(yǎng)到第7?8天，優(yōu)選第7天時(shí)使用所述誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的培 養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK104151413SQ201410172941
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】白崇智, 王轉(zhuǎn)花, 李玉英, 崔曉東 申請(qǐng)人:山西大學(xué)