抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該雙特異性單克隆抗體對氯霉素和克倫特羅同時(shí)具有特異性。該單克隆抗體制備方法如下：合成氯霉素和克倫特羅的半抗原和人工抗原；利用氯霉素人工抗原制備分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；利用克倫特羅人工抗原制備分泌抗克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；抗氯霉素的雜交瘤細(xì)胞株和抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞融合后篩選得到四體雜交瘤細(xì)胞，四體雜交瘤細(xì)胞分泌抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體。本發(fā)明的雙特異性單克隆抗體性狀穩(wěn)定、檢測靈敏度高、能大量生產(chǎn)，并用這個抗體建立了ELISA分析方法，為氯霉素和克倫特羅的快速檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說明】抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫分析法(Immunoassay, IA)起始于20世紀(jì)50年代，首先應(yīng)用于體液大分子物質(zhì)的分析，I960年，美國學(xué)者Yalow和Berson等將放射性同位素示蹤技術(shù)和免疫反應(yīng)結(jié)合起來測定糖尿病人血漿中的胰島素濃度，創(chuàng)立了放射免疫分析技術(shù)。1968年，Oliver將地高辛同牛血清白蛋白結(jié)合，使之成為人工抗原，免疫動物后成功獲得了抗地高辛抗體，從而開辟了用免疫分析法測定小分子藥物的新領(lǐng)域。在RIA的基礎(chǔ)上，隨著新的標(biāo)記物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及新的標(biāo)記方法的使用，以及電子計(jì)算機(jī)、自動控制技術(shù)的廣泛應(yīng)用，派生出許多新的檢測技術(shù)，使免疫分析法逐漸發(fā)展成為一門新型的獨(dú)立學(xué)科。
[0003]由于免疫分析試劑在免疫反應(yīng)中所體現(xiàn)出的獨(dú)特的選擇性和極低的檢測限，使這種分析手段在臨床、生物制藥和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。各種標(biāo)記技術(shù)(放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、金標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光等)的發(fā)展，使免疫分析的選擇性更加突出。標(biāo)記免疫分析一般是將酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，這種標(biāo)記物既保持了抗體或抗原的活性，也不影響標(biāo)記物的活性，當(dāng)它與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以直接測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而直接對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。通過標(biāo)記物的信號放大作用，可以提高免疫分析技術(shù)的敏感性。免疫學(xué)檢測技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、檢測成本 低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，已成為21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的檢測分析技術(shù)。
[0004]目前采用免疫分析方法進(jìn)行多殘留檢測常有兩種方法，一種是采用一類藥物的共有結(jié)構(gòu)作為免疫半抗原，獲得對同類藥物具有特異性識別反應(yīng)的廣譜抗體。另一種是采用將多個藥物的半抗原偶聯(lián)到載體蛋白上制備成人工抗原，經(jīng)過動物免疫獲得對目標(biāo)農(nóng)藥有特異性識別的“寬譜特異性抗體(broad specificity antibody)”,達(dá)到多殘留檢測的目的?？贵w在多殘留免疫分析中的作用非常關(guān)鍵，抗體質(zhì)量的好壞直接影響免疫分析的準(zhǔn)確性和靈敏度，因此獲得好的抗體是多殘留免疫分析技術(shù)的首要工作，已報(bào)道的藥物多殘留免疫檢測的抗體均為多克隆抗體，由于多克隆抗體會隨著動物種類及個體差異而有變化，生產(chǎn)數(shù)量上也會受到一定的限制，制備的抗體可重復(fù)性差，在應(yīng)用中會受到一定的限制，隨著單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，解決了抗體制備過程中抗體性狀不穩(wěn)定的問題，并且單克隆抗體技術(shù)獲得的雜交瘤細(xì)胞在體外能無限量分泌性狀穩(wěn)定的抗體，因此，在小分子藥物免疫分析中單克隆抗體已逐漸取代多克隆抗體。
[0005]傳統(tǒng)的免疫快速診斷技術(shù)中使用的抗體不論是多克隆抗體還是普通單克隆抗體，一個抗體分子均只識別一種或者一類抗原，使檢測范圍受到很大的限制，隨著單克隆雜交瘤技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，Milstein等首次報(bào)道了一株能分泌雙特異性單克隆抗體(Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb)的雜交-雜交瘤(Hybrid Hybridomas)細(xì)胞，標(biāo)志著雙特異性單克隆抗體技術(shù)的創(chuàng)立。雙特異性單克隆抗體是結(jié)構(gòu)上雙價(jià)，功能上單價(jià)的免疫球蛋白分子。其基本結(jié)構(gòu)中兩個Fab端的結(jié)構(gòu)和功能不相同，能分別結(jié)合兩種不同抗原。由于雙特異性單克隆抗體在結(jié)構(gòu)上的特殊性，具有兩個不同的抗原識別位點(diǎn)，如果能把該抗體技術(shù)引入到藥物殘留快速診斷技術(shù)中來，特別是在面臨多殘留快速檢測技術(shù)需求的背景下，在一定程度上能滿足多殘留檢測所面臨的新的要求，該技術(shù)從抗體的結(jié)構(gòu)和特性上入手，區(qū)別于傳統(tǒng)的多殘留免疫分析技術(shù)在半抗原和人工抗原的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行一系列的改造，通過雜交-雜交瘤技術(shù)獲得能特異性識別兩種同類藥物甚至是結(jié)構(gòu)差異大得兩類藥物的雙特異性單克隆抗體，與傳統(tǒng)的抗體快速檢測相比具有質(zhì)的飛躍，為探索藥物多殘留快速檢測技術(shù)新的研究領(lǐng)域和發(fā)展方向方面具有重要意義。
[0006] 氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一種廣譜抗生素,對革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌均有抑制作用，是治療傷寒、副傷寒和沙門氏病的首選藥物，對乳房炎也有很好的療效，廣泛應(yīng)用于動物各種傳染性疾病的治療，造成在動物組織的殘留。其毒副作用表現(xiàn)為抑制骨髓造血功能，引起人類的早產(chǎn)兒灰色綜合癥，再生障礙性貧血等，因此動物組織中氯霉素的殘留對人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。許多國家嚴(yán)禁將氯霉素用于食品動物(特別是雞蛋和奶牛)，并規(guī)定氯霉素的MRL為0-0.01mg/kgo我國和美國均規(guī)定在動物性食品中不得檢出氯霉素(含量在Ing/mL以下)。歐盟不允許氯霉素用于產(chǎn)奶母牛和產(chǎn)蛋雞，嚴(yán)格規(guī)定肉中的氯霉素殘留量不得檢出，所以發(fā)展適宜的方法以快速、靈敏的檢測動物組織中的氯霉素殘留就顯得非常重要。目前，氯霉素殘留分析方法主要有微生物檢測法、理化檢測法和免疫檢測法等。微生物法雖然普遍適用于抗菌藥物的殘留檢測，它易受組織中其他抗生素的影響，特異性低，靈敏度也不高，但操作簡便，樣品用量少，預(yù)處理簡單，在基層大規(guī)模篩選工作中有很大的應(yīng)用價(jià)值。理化檢測法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但檢測設(shè)備昂貴，需專業(yè)人員操作，樣品前處理方法煩瑣，不適于批量樣品的篩選檢測任務(wù)，因此，開發(fā)一種簡單、快速，適于現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0007]鹽酸克倫特羅(Clenbuterol hydrochloride),又名瘦肉精,具有改變養(yǎng)分代謝途徑、提高瘦肉率等作用，被廣泛用于飼料添加劑，然而研究表明瘦肉精的毒性危害很大，為此農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第176號公告將鹽酸克侖特羅列為禁用藥品，但鹽酸克倫特羅的違規(guī)使用和濫用現(xiàn)象還時(shí)有發(fā)生，因此加強(qiáng)對鹽酸克倫特羅的快速、高通量、現(xiàn)場監(jiān)測的技術(shù)
研究非常重要。
[0008]目前，鹽酸克倫特羅的分析技術(shù)主要以儀器分析為主，儀器分析法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但檢測設(shè)備昂貴，需專業(yè)人員操作，樣品前處理方法煩瑣，不適于批量樣品的篩選檢測任務(wù)，因此，開發(fā)一種簡單、快速，適于現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0009]目前雖然有氯霉素和克倫特羅的免疫分析技術(shù)報(bào)道，但均局限于單一的分析技術(shù)和手段，在面臨多殘留分析需求的背景下，建立能同時(shí)檢測兩種或者兩類目標(biāo)化合物的免疫分析技術(shù)就顯得尤為迫切，而制備優(yōu)質(zhì)的雙特異性單克隆抗體是建立免疫多殘留分析技術(shù)的新的手段和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體及其制備方法的技術(shù)方案。
[0011]所述的一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體對氯霉素和克倫特羅同時(shí)具有特異性。
[0012]所述的一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)合成氯霉素和克倫特羅的半抗原和人工抗原；
2)利用氯霉素人工抗原篩選分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并進(jìn)行HGPRT酶或TK酶缺陷篩選；
3)利用克倫特羅人工抗原篩選分泌抗克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行TK酶或HGPRT酶缺陷篩選；
4)分泌抗氯霉素單抗的雜交瘤細(xì)胞株和分泌抗克倫特羅單抗的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合后篩選得到四體雜交瘤細(xì)胞，所述的四體雜交瘤細(xì)胞分泌抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體。
[0013]所述的抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中分泌抗氯霉素的雜交瘤細(xì)胞株通過以下方法制備得到:以琥珀酸氯霉素為半抗原，合成人工抗原后免疫 小鼠，再取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合、篩選，獲得分泌抗氯霉素的雜交瘤細(xì)胞，然后經(jīng)過含8-雜氮鳥嘌呤或5-溴-2-脫氧尿苷篩選，獲得HGPRT酶或者TK酶缺陷的分泌抗氯霉素的雜交瘤細(xì)胞株。
[0014]所述的抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞株通過以下方法制備得到:克倫特羅活化后為半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合、篩選,獲得分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞，然后經(jīng)過含5-溴-2-脫氧尿苷或8-雜氮鳥嘌呤篩選，獲得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞株。
[0015]本發(fā)明制備得到的雙特異性單克隆抗體性狀穩(wěn)定、檢測靈敏度高、能大量生產(chǎn)，并用這個抗體建立了 ELISA分析方法，為氯霉素和克倫特羅的快速檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0017]1.免疫原的制備
1.1氯霉素半抗原、免疫原和包被抗原的的制備 1.1.1琥珀酸氯霉素的合成
稱取氯霉素2.0 g和丁二酸酐0.75 g，置于100 mL三口燒瓶中，回流冷凝管接氯化鈣干燥管或抽真空充氮?dú)獗３址磻?yīng)過程無水無氧。注入15 mL -30 mL經(jīng)無水無氧處理的吡啶，攪拌溶解后60-90 °C反應(yīng)2 h-12 h，待反應(yīng)液(深玫瑰紅色)自然冷卻至室溫后，加入50 mL 7K，用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)混合液pH值為5，用乙酸乙酯30 mL提取3次，用I mol/L碳酸氫鈉水溶液3 X 25 mL提取有機(jī)相，收集水相，用乙醚3 X 15 mL，洗滌水相，棄去乙醚層，再以6 N鹽酸調(diào)節(jié)水相pH值約為5，以乙酸乙酯3 X 30 mL提取水相，收集乙酸乙酯層，以少量水洗滌乙酸乙酯，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得少量紅色粘稠液體，將其冷凍干燥，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇將固體重結(jié)晶，晶體真空干燥后得到產(chǎn)物即為琥珀氯霉素。[0018]1.1.2免疫原的合成與純化
將80 μ mo I氯霉素半抗原溶解在I mL DMF中，然后加入等當(dāng)量的DCC和NHS，讓其在室溫下攪拌反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)4000 r/ min離心10 min后，吸取上清液500 μ L緩慢滴加到6 mL溶于0.01 mol/L,pH9.6碳酸鹽緩沖溶液的20 mg/mL牛血清蛋白(BSA)溶液中，磁力攪拌反應(yīng)6-10 h，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2-4次，然后用0.01mol/L, pH7.4的PBS透析3 d，取出分裝，于-20 °C保存。
[0019]1.1.3包被抗原的合成
取氯霉素半抗原80 μπιο?用I mL DMF溶解，然后加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下攪拌反應(yīng)I h，取反應(yīng)液400 UL緩慢加入到6 mL pH 9.0，0.2 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液溶解的20 mg/ mL的OVA溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)2 h后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2次，然后用PBS透析3d后，取出分裝，于-20 °C保存。
[0020]1.2克倫特羅人工抗原的制備 1.2.1鹽酸克倫特羅的活化成 取3 mg CL，加入I mL lmol/L HCL和500 PL蒸餾水于反應(yīng)燒杯中，同時(shí)調(diào)節(jié)pH至
0.5，然后在4 1:下往其中連續(xù)緩慢加入60 μL 0.2 mol/L NaNO2,4°C低速攪拌1_3 h。
[0021]L 2.2人工抗原的合成與純化
準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)，溶于pH值7.0-8.0磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將偶氮后的鹽酸克倫特羅慢慢滴入牛血清白蛋白溶液中(鹽酸克倫特羅和蛋白載體分子比在20-30之間)，用I mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH在7.0-8.0之間，滴加結(jié)束后在暗處繼續(xù)攪拌2-5 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液置于處理過的透析袋內(nèi)，4 1:攪拌透析72 h后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]2.免疫動物
實(shí)驗(yàn)選用6-10周齡的BALB/C小鼠，20-22 g，免疫5_10只小鼠。取6 — 8周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠，將制備的CAP-HS-BSA交聯(lián)物和CL-BSA交聯(lián)物分別與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)注射，劑量為50-100 μδ/只，以后每隔3周，取抗原(與一免等劑量)和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔和皮下注射加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫共4次，末免以加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3 d后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0023]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-12:1的比例，在無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma)作為融合劑，在37 °C下水浴下加入0.5-0.7 ml，使其融合2 min，用無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500 rpm離心5 min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37 °C, 5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
[0024]4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)5 d后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔。氯霉素篩選共獲20多個對上述抗原有反應(yīng)的陽性孔，選擇其中12個呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔進(jìn)行間接ELISA，最后篩選6個較理想的陽性孔，這6個陽性孔進(jìn)行有限稀釋法克隆，最終獲得I株能分泌抗氯霉素的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞6D9，經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，該株細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。克倫特羅篩選共獲50多個對上述抗原有反應(yīng)的陽性孔，選擇其中20個呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔進(jìn)行間接ELISA，最后篩選8個較理想的陽性孔，這8個陽性孔進(jìn)行有限稀釋法克隆，最終獲得I株能分泌抗鹽酸克倫特羅的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞7C7,經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，該株細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。
[0025]5.四體雜交瘤細(xì)胞的制備
對6D9細(xì)胞株用含8-雜氮鳥嘌呤(8-AG)濃度為100-300 Pg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3-6周，使6D9細(xì)胞HGPRT酶缺失；對7C7細(xì)胞株采用含5-溴-2-脫氧尿苷(5_BrdU)濃度為50-300 Pg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4_8周，使7C7細(xì)胞胸苷激酶(TK)缺失；將上述兩種酶缺陷型細(xì)胞進(jìn)行再融合制備雜交-雜交瘤細(xì)胞，以氯霉素包被抗原和克倫特羅包被抗原進(jìn)行陽性和靈敏度篩選，以對氯霉素和克倫特羅具有較好的特異性和靈敏度為篩選依據(jù)，最終篩選獲得2株四體雜交瘤細(xì)胞7E12和9A8，經(jīng)3個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，該株細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0026]7.雙特異性單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入
5-10 X IO6個7B2雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000 rpm離心3 min，收集上清液，即為雙特異性單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加4倍體積0.06 MpH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30 μΙ/mL腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4 °C澄清I h，12000rpm離心20 min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4 °C放置2 h，3000 rpm離心20 min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4 1:流動透析24 h后即獲純化的腹水抗體，-70 °C保存。
[0027]8.雙特異性單克隆抗體ELISA分析方法的建立
8.1氯霉素ELISA分析方法的建立
采用包被抗體-酶標(biāo)半抗原的反應(yīng)模式，建立ELISA分析方法。具體步驟如下:
1.確定工作濃度。采用正交實(shí)驗(yàn)法梯度包被雙特異性單克隆抗體濃度為0.125-16Pg/mL于ELISA板，37 V 2 h，PBST洗滌三次后用I — 10%的脫脂奶粉或1 — 3% BSA或
3- 6%牛血清封閉30-60 min，加入濃度梯度為0.5-16 ng/mL酶標(biāo)半抗原CAP-HS-HRP，100 uL/孔，37 0C 1- 2 h，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD49tl的值，OD值在1.0左右的抗體-酶標(biāo)半抗原的濃度組合為初選工作濃度，然后將初選的雙特異性單克隆抗體包被ELISA板，37 V 2 h，PBST洗滌三次后用
1- 10%的脫脂奶粉或I 一 3% BSA或3 — 6%牛血清封閉30-60 min ;加入梯度稀釋的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μ 1，再加入經(jīng)緩沖液稀釋的2倍濃度的酶標(biāo)半抗原50 μ 1,37 V I 一 2h，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD49tl的值，根據(jù)抑制與濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式計(jì)
算:抑制率
【權(quán)利要求】
1.一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體，其特征在于所述的雙特異性單克隆抗體對氯霉素和克倫特羅同時(shí)具有特異性。
2.一種抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)合成氯霉素和克倫特羅的半抗原和人工抗原； 2)利用氯霉素人工抗原制備分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 3)利用克倫特羅人工抗原制備分泌抗克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 4)分泌抗氯霉素抗體的雜交瘤細(xì)胞株和分泌抗克倫特羅抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合后篩選得到四體雜交瘤細(xì)胞，所述的四體雜交瘤細(xì)胞分泌抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中分泌抗氯霉素的雜交瘤細(xì)胞株通過以下方法制備得到:以琥珀酸氯霉素為半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合、篩選,獲得分泌抗氯霉素抗體的雜交瘤細(xì)胞，然后經(jīng)過含8-雜氮鳥嘌呤或5-溴-2-脫氧尿苷篩選，獲得HGPRT酶或者TK酶缺陷的雜交瘤細(xì)胞株。
4.如權(quán)利要求2所述的抗氯霉素和克倫特羅的雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞株通過以下方法制備得到:克倫特羅活化后為半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合、篩選，獲得分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞，然后經(jīng)過含5-溴-2-脫氧尿苷或8-雜氮鳥嘌呤篩選，獲得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗克倫特羅的雜交瘤細(xì)胞株。
【文檔編號】C07K16/46GK103951755SQ201410173658
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】金仁耀, 桑永玉 申請人:浙江工商大學(xué)