從楊樹菇中分離的具有免疫佐劑作用的蛋白提取物及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了從楊樹菇中分離的具有免疫佐劑作用的蛋白提取物及其提取方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先從楊樹菇(Agrocybe?aegerita)中提取分離得到具有免疫佐劑作用的總蛋白混合物(Yt)，將總蛋白混合物上非極性大孔吸附樹脂柱分離得到蛋白亞組分(Yp)，利用乳糖偶聯(lián)的SepHarose6B親和層析柱進(jìn)一步從蛋白亞組分Yp中分離出單一組分凝集素AAL。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明從楊樹菇中所分離提取的總蛋白混合物(Yt)、蛋白亞組分(Yp)以及凝集素AAL均具有免疫佐劑效應(yīng)，能很好的刺激機(jī)體抗原特異性抗體分泌的增強(qiáng)，對脾淋巴細(xì)胞增殖也有一定的促進(jìn)作用。
【專利說明】從楊樹菇中分離的具有免疫佐劑作用的蛋白提取物及其提取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從真菌中分離提取的蛋白提取物及其用途，尤其涉及從楊樹菇(Agrocybe aegerita)中分離得到的蛋白提取物、從這種蛋白提取物中分離得到的蛋白亞組分以及進(jìn)一步從其中分離純化得到的凝集素AAL，本發(fā)明還涉及它們的分離純化方法及其作為疫苗免疫佐劑的應(yīng)用，屬于楊樹菇活性成分的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人口密度的不斷增加、交通的發(fā)達(dá)，帶來了越來越多的疾病的爆發(fā)和傳染，例如:新病毒、SRARS, H5N1等?？刂萍膊”l(fā)的最有效手段是疫苗，但是，目前，大多數(shù)疫苗都存在保護(hù)率低或者安全性不高的問題。為疫苗尋找高效的佐劑，則可以改善疫苗目前存在的這些問題。
[0003]鋁鹽是唯一被美國批準(zhǔn)用于人用和獸用的疫苗。在歐洲，M59和virosome于1997年分別批準(zhǔn)用于Fluad和Inflexal V流感疫苗，AS04于2005年批準(zhǔn)用于HBV疫苗，2007年批準(zhǔn)用于HPV疫苗，A S03于2008批準(zhǔn)用于Prepandrix流感疫苗。目前，有佐劑效果的佐劑很多，但獲批的佐劑卻很少，因此，需要尋找更多安全高效的佐劑用于篩選可用于臨床的佐劑。
[0004]中草藥的使用有著千余年的歷史，因其獨特的藥用價值、安全性、價格優(yōu)勢贏得了越來越多科學(xué)研究者的親睞。研究發(fā)現(xiàn)很多中草藥具有調(diào)節(jié)免疫的作用，分離得到的活性成分主要有:多糖類、苷類、生物堿類。近年來，關(guān)于這些活性成分的佐劑效果的研究也越來越多，多糖的毒性和副作用小的同時免疫調(diào)節(jié)活性也低，生物堿的副作用比較強(qiáng)，皂苷是目前比較成功的中草藥來源的佐劑，但其具有較高的凝血活性限制了其作為佐劑的應(yīng)用。因此，高效安全的中草藥來源的佐劑有待進(jìn)一步的發(fā)掘與應(yīng)用。
[0005]藥用真菌楊樹燕(Agrocybe aegerita),又名柱狀田頭燕、楊樹燕、柳松鸞等,隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬。在亞洲和歐洲，楊樹菇已經(jīng)成為特別受人們歡迎的功能食品。楊樹菇中蛋白含量高達(dá)干物質(zhì)的20% -30%，富含人體必需的八種氨基酸，其中賴氨酸高達(dá)1.75%，其營養(yǎng)價值超過香菇、金針菇等其它食用菌，民間常將其用于抗癌、降血壓，治療胃冷、腎炎、水腫等，其蛋白組分是主要的抗腫瘤活性成分。迄今為止，尚未有從楊樹燕(Agrocybe aegerita)中分離的蛋白成分具有免疫佐劑功效的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一類從楊樹菇中提取分離的具有免疫佐劑作用或提高機(jī)體免疫力功效的總蛋白混合物；
[0007]本發(fā)明的目的之二是從所分離的楊樹菇總蛋白混合物中進(jìn)一步分離得到具有免疫佐劑作用或提高機(jī)體免疫力功效的蛋白亞組分；
[0008]本發(fā)明的目的之三是從楊樹菇的總蛋白混合物中分離得到具有免疫佐劑作用或提聞機(jī)體免疫力功效的凝集素AAL ；
[0009]本發(fā)明的目的之四是將所提取分離的楊樹菇總蛋白混合物、蛋白亞組分以及凝集素AAL應(yīng)用于疫苗的免疫佐劑以提高疫苗的防治效果。
[0010]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0011]一種從楊樹菇中提取分離的具有免疫佐劑作用或提高機(jī)體免疫力功效的總蛋白混合物，該總蛋白混合物通過以下方法制備得到:
[0012](I)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提，得到抽提液；
[0013](2)將步驟(1)所得到抽提液用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀；
[0014](3)將沉淀用水或磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，即得。
[0015]為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，優(yōu)選的，步驟(1)將楊樹菇子實體烘干粉碎后用水或緩沖液浸泡抽提2-3次；
[0016]優(yōu)選的，步驟(2)中將抽提液過濾，將濾液用硫酸銨進(jìn)行沉淀；其中，所述的分段硫酸銨鹽析法優(yōu)選為:首先向濾液中加入硫酸銨至0.1-40%飽和度，攪拌、離心，棄沉淀，取上清；向上清中加入硫酸銨至41-80%飽和度，離心，取沉淀。
[0017]一種從楊樹菇中提取分離的具有免疫佐劑作用或提高機(jī)體免疫力功效的蛋白亞組分，該蛋白亞組分通過以下方法制備得到: [0018](I)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提，得到抽提液；
[0019](2)將步驟(1)所得到抽提液采用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀；
[0020](3)將沉淀用水或磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，得到蛋白提取物；
[0021](4)將蛋白提取物用水或磷酸鹽緩沖液重懸后得到藥液，將藥液循環(huán)上樣過非極性大孔吸附樹脂柱，將藥液中的蛋白質(zhì)成分和小分子成分相分離，收集蛋白質(zhì)成分；收集穿透峰至藥液顏色變淺到不再變化為至，所收集的穿透峰即為藥液中的蛋白質(zhì)亞成分。
[0022]其中，步驟(4)中所述的非極性大孔吸附樹脂柱優(yōu)選為大孔吸附樹脂HP-20柱；本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣的藥液的濃度超過10mg/mL時容易造成死吸附,所以藥液的濃度不超過10mg/mL時為最好,藥液的上樣速度優(yōu)選為0.5-lmL/min。
[0023]大孔吸附樹脂是不帶離子交換基團(tuán)、大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，主要由苯乙烯、二乙烯苯等原料交聯(lián)聚合而成。良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積使其可以通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵等物理吸附從溶液中有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離的目的。本發(fā)明優(yōu)選采用日本三菱產(chǎn)非極性大孔吸附樹脂HP-20分離蛋白提取物中蛋白組分Yp與色素組分Ys。
[0024]大孔吸附樹脂的前處理要求比較嚴(yán)格，否則有效成分易流失。本發(fā)明將準(zhǔn)備裝柱使用的新樹脂用2倍左右體積的甲醇或其它水溶性溶劑(如乙醇、丙酮)浸泡2小時，并不時攪動，使樹脂充分溶脹。將已充分溶脹的吸附樹脂裝柱，以每小時3-4倍床體積的流速，將5-8倍的甲醇或其他水溶性的溶劑(如乙醇、丙酮)通過樹脂層至流出液加水稀釋不變混。甲醇處理后，以每小時6-8倍床體積的流速將去離子水通過樹脂層，置換出甲醇即可使用。
[0025]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種從楊樹菇中提取得到的具有免疫佐劑作用或提高機(jī)體免疫力功效的凝集素AAL，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示，編碼氨基酸的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。[0026]本發(fā)明還公開了所述凝集素AAL的分離純化方法，其包括以下步驟:
[0027](I)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提；
[0028](2)將步驟(1)所得到抽提液用硫酸銨進(jìn)行沉淀；
[0029](3)將沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，得到蛋白提取物；
[0030](4)將蛋白提取物用磷酸鹽緩沖液重懸后得到藥液，將藥液循環(huán)上樣過非極性大孔吸附樹脂柱，收集穿透峰至藥液顏色變淺到不再變化為至。
[0031](5)將步驟(4)所收集的穿透峰過乳糖偶聯(lián)的SepHaroseeB的親和層析柱，以洗脫劑洗脫、分離，得到凝集素AAL。
[0032]其中，步驟(5)中所述的洗脫劑優(yōu)選為乳糖。[0033]從楊樹菇中分離得到總蛋白混合物(Yt)作為滅活禽流感病毒H9N2免疫佐劑的實驗表明，0.2mg/mL Yt處理組小鼠血清中的IgG P/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，增長了 36.2% ；0.5mg/mL Yt處理組P/N值的平均值與無佐劑組相比差異顯著(P〈0.05)，增長了 32.4%。以上數(shù)據(jù)表明從楊樹菇中分離得到總蛋白混合物(Yt)對滅活禽流感病毒H9N2具有免疫佐劑的活性。對IgG亞型IgGl和IgG2a含量進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，lmg/mL Yt>0.5mg/mL Yt>0.2mg/mL Yt處理組小鼠血清中IgGlP/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，分別增長了 144.1 %、167.2 %、196.9 %。Yt各濃度處理組小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值與無佐劑組沒有顯著性差異。取Yt各濃度處理組與滅活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞，體外用H9N2病毒刺激，檢測細(xì)胞分泌IFN-Y的量。0.5mg/mL Yt處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的量為244.53pg/mL,與生理鹽水組相比差異顯著(P〈0.05)。Yt體外刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗表明，0.625μ g/mLYt、l.25 μ g/mLYt與ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率分別為210.8%和187.5%，與未處理組之間差異極顯著(P〈0.01)。這些結(jié)果表明，從楊樹菇中分離得到總蛋白混合物(Yt)可能是通過激活脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th2細(xì)胞活性，從而發(fā)揮免疫佐劑作用。
[0034]本發(fā)明將從楊樹菇中分離得到總蛋白混合物上大孔吸附樹脂柱，將蛋白組分(Yp)和小分子組分(Ys)相分離；通過對Yp和Ys組分進(jìn)行免疫佐劑活性的鑒定，實驗結(jié)果表明，各濃度的Ys處理組小鼠血清中IgG P/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比沒有表現(xiàn)出顯著差異，說明Ys不是Yt中具有免疫佐劑活性的有效組分。亞組分Yp作為禽流感病毒H9N2免疫佐劑的實驗表明，0.5mg/mL Yp>0.2mg/mL Yp>0.lmg/mL Yp處理組小鼠血清中的IgG P/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，分別增長了 39.2%、47.2^^24.1?^以上數(shù)據(jù)表明Yp對滅活禽流感病毒H9N2具有免疫佐劑的活性。對IgG亞型IgGl和IgG2a含量進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，0.5mg/mL Yp,0.lmg/mL Yp處理組小鼠血清中IgGlP/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，分別增長了 201.1%,274.7%。Yp各處理組小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值與無佐劑組沒有顯著性差異。取Yp各濃度處理組與滅活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞，體外用H9N2病毒刺激，檢測細(xì)胞分泌IFN-Y的量。0.5mg/mLYp處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-Y的量為146.21pg/mL，與生理鹽水組相比差異顯著(P〈0.05)。Yp亞組分體外刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗表明，0.625 μ g/mL Yp、l.25 μ g/mL Υρ、2.5μ g/mL Yp與ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率分別為265.4%、321.1%和347.1 %，與未處理組之間差異極顯著(P〈0.01)。這些結(jié)果表明，亞組分Yp是Yt中具有免疫調(diào)節(jié)活性的有效活性組分，免疫調(diào)節(jié)活性與Yt相似，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th2亞群細(xì)胞活性。
[0035]半乳糖凝集素AAL是Yp中的主要成分，本發(fā)明對AAL作為禽流感病毒H9N2免疫佐劑的效果進(jìn)行了研究，試驗結(jié)果表明，0.2mg/mL AAL、0.lmg/mL AAL處理組小鼠血清中IgGP/N值的平均值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，分別增長了 98.01%和157.5%。結(jié)果表明AAL對滅活禽流感病毒H9N2具有免疫佐劑的活性。對IgG亞型IgGl和IgG2a含量進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，0.5mg/mL AAL>0.2mg/mL AAL、0.lmg/mL AAL處理組小鼠血清中的IgGlP/N值與陰性對照無佐劑組相比差異極顯著(P〈0.01)，分別增長了 399.1%,362.3%、251.6%。AAL各處理組小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值與無佐劑組沒有顯著性差異。取AAL各濃度處理組與滅活病毒$N2共同免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞，體外用H9N2病毒刺激，檢測細(xì)胞分泌IFN-Y的量。0.05mg/mL AAL處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN- Y的量為174.64pg/mL,與陰性對照無佐劑組相比差異顯著(P〈0.05)。AAL體外刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗表明，12.5 μ g/mL AAL與ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為134.1 %，與未處理組之間差異極顯著(P〈0.01) ；6.25 μ g/mLAAL與ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為131.2%，與未處理組之間差異顯著(P〈0.05)。由此可見單一組分半乳糖凝集素AAL是楊樹菇中具有免疫佐劑效應(yīng)的主要成分。
[0036]綜上所述，本發(fā)明通過對楊樹菇提取物Yt，其蛋白質(zhì)亞組分Yp、單一組分AAL免疫佐劑效應(yīng)的鑒定，最終確定Yt、Yp和AAL都具有免疫佐劑活性，這些成分通過刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th2亞細(xì)胞活性，增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高抗原免疫的抗體滴度。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0037]圖1通過15%的SDS-PAGE分離從楊樹菇中提取總蛋白混合物(Yt)的結(jié)果；蛋白樣品經(jīng)過15%的SDS-PAGE分離，1-4號區(qū)域切膠酶解，SPITC處理，脫鹽，經(jīng)過質(zhì)譜序列測定；分子量Marker從上到下:116,66.2、45。
[0038]圖2從楊樹菇中提取總蛋白混合物(Yt)通過HP20分離成Yp，Ys組分；Α.ΗΡ20分離Yt示意圖，樣品過ΗΡ20的穿透峰為Υρ，使用75%乙醇洗脫峰為Ys ;Β.使用10%的SDS-PAGE分析100 μ g的Yt、Yp、Ys，考馬斯亮藍(lán)染色。Ys中幾乎不含蛋白/多肽，Yp與Yt相比，低分子量蛋白得到富集。
[0039]圖3從楊樹菇中分離的凝集素AAL經(jīng)SDS-PAGE測定結(jié)果。
[0040]圖4Yt作為佐劑對H9N2特異性抗體IgG的影響；各個處理組與無佐劑對照組比較；**表示極顯著差異(ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0041]圖5Yt作為佐劑對H9N2特異性抗體IgGl和IgG2a的影響；各個處理組與無佐劑對照組比較；**表示極顯著差異(P〈0.01)，*表示顯著差異(P〈0.05)。
[0042]圖6Yt作為H9N2病毒疫苗佐劑免疫小鼠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN- Y。各個處理組與生理鹽水對照組比較；**表示極顯著差異(P〈0.01)，*表示顯著差(P〈0.05)。
[0043]圖7Yt與ConA共同刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用。各個處理組與空白對照組比較；**表示極顯著差異(ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0044]圖8Ys作為佐劑對H9N2特異性抗體IgG的影響。各個處理組與陰性對照無佐劑組比較；**表示極顯著差異(p〈0.01)，*表示顯著差異(P〈0.05)。[0045]圖9Yp作為佐劑對H9N2特異性抗體IgG的影響；各處理組與陰性對照無佐劑組比較，**表示極顯著差異(Ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0046]圖1OYp作為佐劑對H9N2特異性抗體IgGl和IgG2a的影響。各處理組與陰性對照無佐劑組比較，**表示極顯著差異(P〈0.01)，*表示顯著差異(P〈0.05)。
[0047]圖1lYp作為H9N2病毒疫苗佐劑免疫小鼠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN- Y ；各個處理組與生理鹽水對照組比較；**表示極顯著差異(P〈0.01)，*表示顯著差(P〈0.05)。
[0048]圖12Yp與ConA共同刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用，各個處理組與空白對照組比較；**表示極顯著差異(ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0049]圖13AAL作為佐劑對H9N2特異性抗體IgG的影響；各處理組與陰性對照無佐劑組比較；**表示極顯著差異(ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0050]圖14AAL作為佐劑對H9N2特異性抗體IgGl和IgG2a的影響；各處理組與陰性對照無佐劑組比較；**表示極顯著差異(p〈0.01)，*表示顯著差異(P〈0.05)。
[0051]圖15AAL作為H9N2病毒疫苗佐劑免疫小鼠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN- Y ；各個處理組與生理鹽水對照組比較；**表示極顯著差異(P〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0052]圖16AAL與ConA共同刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用，各個處理組與空白對照組比較；**表示極顯著差異(ρ〈0.01)，*表示顯著差異(Ρ〈0.05)。
【具體實施方式】
[0053]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0054]試驗材料
[0055]1.1生物材料
[0056]楊樹菇子實體，H9N2禽流感病毒(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實驗室惠贈)
[0057]1.2試驗動物
[0058]18_22g雄性昆明小鼠購于湖北省疾病預(yù)防控制中心，所有小鼠在溫度24土 1°C、濕度50± 10%環(huán)境下飼養(yǎng)，每天12小時光照，自由采食，自由飲水。
[0059]1.3實驗藥品
[0060]小牛血清(杭州四季青);RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司);3_(4，5)雙甲基_2噻唑(2，5)-二苯基溴化四氮唑蘭MTT(Biosharp);小鼠淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；四甲基聯(lián)苯胺TMB(Biosharp);弗氏完全佐劑(Therom);弗氏不完全佐劑(Therom);鋁鹽佐劑(Therom);小鼠IFN_YELISA檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)；羊抗鼠IgG - HRP(博士德生物工程有限公司)；羊抗鼠IgGl - HRPSothernBiotech ;羊抗鼠 IgG2a — HRP(SothernBiotech) ;BSA(Biosharp) ；ConA(Sigma)；
[0061]1.4常用試 劑的配制
[0062]1.4.1血凝試驗[0063]阿氏液的配制:2.05g葡萄糖,0.8g檸檬酸鈉,0.42g NaCl，0.055g梓檬酸，加ddH20100mL,調(diào) pH 值至 6.1
[0064]0.85%生理鹽水:8.5g NaCl 溶于 IL ddH20 中
[0065]I %雞紅細(xì)胞懸液:用注射器吸取阿氏液約lmL，取健康公雞的血約2_4mL，與阿氏液混合，放入裝IOmL阿氏液的離心管中混勻，將離心管中的血液經(jīng)1500-1800r/min離心8分鐘,棄上清液,沉淀物加入0.85%生理鹽水,輕輕混合,再經(jīng)1500-1800r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入一定體積的0.85%生理鹽水，輕輕混合成1% (V/V)雞紅細(xì)胞懸液，4°C保存?zhèn)溆?，不超過5天。
[0066]1.4.2RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基
[0067]RPMI1640干粉一袋溶于500mL ddH20,攪拌溶解，將2.0g NaHCO3溶于水倒入混勻，加水定容至1000mL,用IN HCl調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2，用已滅菌的0.22 μ m微孔濾膜過濾培養(yǎng)液裝入已滅菌好的玻璃瓶中，注上名稱、配制日期，經(jīng)檢查無菌后4°C保存?zhèn)溆?。臨用前加入10%的小牛血清，100IU/mL青霉素，100 μ g/mL硫酸鏈霉素配成完全營養(yǎng)液。
[0068]1.4.3ELISA 稀釋緩沖液
[0069]PBS(IL):8g NaCl.0.2g KCl、1.44g Na2HP04,0.24g KH2PO4，用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的 pH值至7.4，在151 bf/in2(1.034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，保存于室溫。
[0070]ELISA 包被緩沖液(0.05M 碳酸鹽緩沖液):1.59g Na2CO3, 2.93g NaHCO3,ddH201000mL,調(diào) pH 值 到 9.0-9.6
[0071]洗滌緩沖液(PBST):1OOOmL PBS, ImL 吐溫 20。
[0072]ELISA 封閉液:0.5g 牛血清白蛋白(BSA)，PBSTlOOmL
[0073]ELISA樣品稀釋液:0.1g牛血清白蛋白(BSA)，PBSTlOOmL
[0074]終止液(2MH2SO4):178.3mL ddH20，21.7mL98%濃硫酸
[0075]ELISA 底物緩沖液:25.7mL0.2M Na2HPO4 (28.4g/L)，24.3mL0.1M 檸檬酸(19.2g/L)，50ml ddH20,調(diào) pH 值到至 5.5
[0076]四甲基聯(lián)苯胺(TMB)使用液:0.5mL TMB (10mg/5ml)，IOmL底物緩沖液(ρΗ5.5)，臨用前加入 32 μ L0.75% H2O2
[0077]實施例1從楊樹菇中提取總蛋白混合物(Yt)
[0078]I)取楊樹燕干粉,加蒸懼水浸泡三次，分別加650mL, 600mL, 35OmL蒸懼水,每次浸泡3-4小時，每次浸泡后用六層紗布過濾。
[0079]2)收集三次過濾濾液，9000rpm,離心10min,收集上清，定容；用0% -40 %(NH4) 2S04沉淀，根據(jù)(NH4) 2S04飽和溶解度，IL溶液需要加226g (NH4) 2S04, (NH4) 2S04需要研磨，邊加邊攪拌，以防止局部濃度過高導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性，持續(xù)攪拌lh，沉淀過夜。
[0080]3)將溶液分裝，9000印111，離心101^11，棄沉淀，收集上清，用41%-80% (NH4)2SO4沉淀，根據(jù)(NH4) 2S04飽和溶解度，IL溶液需要加329g (NH4) 2S04,持續(xù)攪拌lh，沉淀4h。
[0081]4)將溶液分裝，9000rpm,離心10min,棄上清,取沉淀,用少量蒸懼水溶解沉淀,分裝入透析袋，放入蒸餾水中透析，除鹽四次，每4h換水一次。
[0082]5)收集透析袋中溶液，9000rpm，離心10min，除去未溶解蛋白質(zhì)沉淀，將溶液重新加入透析袋中，用PEG20000濃縮至原體積的1/3。
[0083]6)用水沖凈透析袋外的PEG20000，用濾紙吸干表面水分，分裝，凍干，得到總蛋白混合物(Yt)。所提取的總蛋白混合物(Yt)通過15%的SDS-PAGE分離結(jié)果見圖1。
[0084]實施例2從楊樹菇中所提取總蛋白混合物(Yt)中分離蛋白組分(Yp)及小分子組分(Ys)
[0085]I)大孔吸附樹脂預(yù)先用甲醇浸泡過夜。
[0086]2)裝入10*10規(guī)格層析柱中，用ddH20水洗約10個柱體積。
[0087]3)將實施例1所制備的總蛋白混合物(Yt)溶于蒸餾水或磷酸鹽緩沖液中(濃度為0.1-lOmg/mL),循環(huán)上樣，上樣速度0.5-lmL/min,同時收集穿透峰(即為蛋白組分Yp)至柱子顏色不變時，先用蒸餾水洗出柱內(nèi)殘留的Yt，約洗3-4個柱體積。
[0088]4)再用75%乙醇洗脫，洗脫速度lmL/min。洗脫至柱子顏色基本不變，收集洗脫峰得到小分子組分(Ys)，約2-3個柱體積。
[0089]圖2中的A為HP20(日本三菱產(chǎn)非極性大孔吸附樹脂HP-20)分離Yt示意圖，樣品過HP20的穿透峰為Yp，使用75%乙醇洗脫峰為Ys。圖2中的B為使用10%的SDS-PAGE分析100 μ g的Yt、Yp、Ys考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，從結(jié)構(gòu)可見Ys中幾乎不含蛋白/多肽，Yp與Yt相比，低分子量蛋白得到富集。
[0090]實施例3從所分離蛋白組分(Yp)中分離純化得到凝集素AAL
[0091]I)將即將要過親和層析柱的Yt溶液(實施例1所制備)用等體積的結(jié)合緩沖液(Tris-HCl緩沖液，濃度為0.05mol/L)混勻。再用0.45mm的微孔濾膜抽濾，徹底除去溶液中的雜質(zhì)，以防堵塞儀器。
[0092]2)用結(jié)合緩沖液預(yù)先平衡層析柱，平衡體積3-5個柱體積，流速lmL/min。
[0093]3)將混勻的Yt-結(jié)合緩沖液通過親和層析柱，流速lmL/min?？裳h(huán)上樣，使得柱子與配體結(jié)合充分。
[0094]4)再用洗滌緩沖液(Tris-HCl緩沖液，濃度為0.05mol/L)清洗殘余未結(jié)合的蛋白，流速lmL/min。
[0095]5)用乳糖溶液競爭洗脫，流速lmL/min。收集洗脫峰。
[0096]6)用SDS-PAGE檢測收集的目的蛋白(圖3)，并透析凍干剩余蛋白。
[0097]試驗例I從楊樹菇中提取的總蛋白混合物(Yt)的免疫佐劑效應(yīng)的試驗
[0098]1.試驗材料及方法
[0099]1.1供試材料
[0100]實施例1中從楊樹菇中提取的總蛋白混合物(Yt)。
[0101]1.2試驗方法
[0102]1.2.1H9N2禽流感病毒的增殖、血凝試驗和病毒純化
[0103]1.2.1.1 病毒增殖
[0104]將H9N2型禽流感病毒原液作10倍稀釋，接種于9~11日齡無母源抗體的雞胚尿囊腔，接種數(shù)枚雞胚，每枚接種0.2mL，以石蠟封口，至于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h觀察，死胚棄去，收集24~72h間死亡的雞胚尿囊液和接種后72h存活胚4°C過夜收集其尿囊液，作血凝試驗(微量法)，出現(xiàn)血凝陽性(滴度大于128)者混勻，1000Orpm離心后分裝，于一70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0105]1.2.1.2血凝試驗方法:
[0106] I)在微量反應(yīng)板的I孔~12孔均加入50 μ L生理鹽水，換槍頭。[0107]2)吸取50 μ L H9N2病毒雞胚尿囊液加入第I孔，混勻。
[0108]3)從第I孔吸取50 μ L病毒液加入第2孔,混勻后吸取50 μ L加入第3孔,如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取50 μ L棄之，換槍頭。
[0109]4)每孔均加入50 μ L體積分?jǐn)?shù)為I %雞紅細(xì)胞懸液(將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入)
[0110]5)振蕩混勻，在室溫(20~25°C)下靜置40min后觀察結(jié)果(如果環(huán)境溫度太高，可置4°C環(huán)境下反應(yīng)1小時)。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。
[0111]6)結(jié)果判定
[0112]將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果(見表1)。
[0113]表1血凝試驗結(jié)果判斷
[0114]
【權(quán)利要求】
1.從楊樹燕(Agrocybeaegerita)中提取分離的具有免疫佐劑作用的總蛋白混合物，其特征在于，該總蛋白混合物的提取方法包括: (1)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提得到抽提液； (2)將步驟(1)所得到抽提液用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀； (3)將步驟(2)所獲得的沉淀用水或磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的總蛋白混合物，其特征在于:步驟(1)將楊樹菇子實體烘干粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提2-3次；步驟(2)中將抽提液過濾，將濾液采用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀。
3.按照權(quán)利要求2所述的總蛋白混合物，其特征在于:所述的分段硫酸銨鹽析法為:按體積比計，向濾液中加入硫酸銨至0.1-40%飽和度,攪拌、離心,棄沉淀,取上清；向上清中加入硫酸銨至40-80 %飽和度，離心，取沉淀。
4.從楊樹燕(Agrocybeaegerita)中提取分離的具有免疫佐劑作用的蛋白組分,其特征在于，該蛋白組分的提取方法包括: (1)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提； (2)將步驟(1)所得到抽提液采用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀； (3)將沉淀用水或磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，得到蛋白提取物； (4)將蛋白提取物用水或磷酸鹽緩沖液重懸后得到藥液，將藥液循環(huán)上樣過非極性大孔吸附樹脂柱，將藥液中的蛋白質(zhì)成分和小分子成分相分離，收集蛋白質(zhì)成分，即得。
5.按照權(quán)利要求4所述的蛋白組分，其特征在于:步驟(1)將楊樹菇子實體烘干粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提2-3次；步驟(2)中將抽提液過濾，將濾液用分段硫酸銨鹽析法進(jìn)行沉淀；所述的分段硫酸銨鹽析法為:向濾液中加入硫酸銨至0.1-40%飽和度，攪拌、離心，棄沉淀，取上清；向上清中加入硫酸銨至41-80%飽和度，離心，取沉淀；步驟(4)中所述的非極性大孔吸附樹脂柱為大孔吸附樹脂HP-20柱；步驟(4)中所述藥液的濃度為0.1-lOmg/mL ;藥液的上樣速度為0.5-lmL/min。
6.權(quán)利要求1-3任何一項所述的總蛋白混合物作為疫苗免疫佐劑或在制備提高機(jī)體免疫力藥物中的用途。
7.權(quán)利要求4-6任何一項所述的蛋白組分作為疫苗免疫佐劑或在制備提高機(jī)體免疫力藥物中的用途。
8.從楊樹菇中分離純化的凝集素AAL，其特征在于:其氨基酸序列為SEQID N0.2所示。
9.編碼權(quán)利要求7所述凝集素AAL的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列為SEQID N0.1 所示。
10.權(quán)利要求8所述的凝集素AAL作為疫苗免疫佐劑或在制備提高機(jī)體免疫力藥物中的用途；權(quán)利要求9所述的基因在制備疫苗佐劑或提高機(jī)體免疫力藥物中的用途。
【文檔編號】C07K1/16GK103923165SQ201410181698
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】馬立保, 孫慧, 黃敏, 張金林, 胡曉芬, 吳艷麗, 吳曉明 申請人:武漢華揚動物藥業(yè)有限責(zé)任公司