Hederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)的應(yīng)用。本發(fā)明采用化學(xué)提取分離手段得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside，再結(jié)合其理化性質(zhì)和MS、NMR等現(xiàn)代光譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，對該化合物進(jìn)行了抗植物病原菌活性試驗(yàn)，結(jié)果表明Hederagenin-3-O-arabinopyranoside對立枯絲核菌Rhizoctonia?solani?Kühn和串珠鐮孢菌Fusarium?moniliforme?Sheld有較好的抑制作用，可以作為制備生物農(nóng)藥的抑菌劑成分進(jìn)一步研究。
【專利說明】Hederagen i n-3-0-arab i nopyranos i de 抗植物病原菌的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside (常春藤阜苷兀-3-0-阿拉伯糖)在抗植物病原菌方面的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病原菌是導(dǎo)致植物病害的主要原因之一，每年農(nóng)作物因遭受病害造成的減產(chǎn)為總產(chǎn)量的12%左右。目前防治植物病害的主要手段為化學(xué)農(nóng)藥?；瘜W(xué)農(nóng)藥因其品種多、見效快、使用方便、價(jià)格低廉等特點(diǎn)在農(nóng)藥市場中占據(jù)主導(dǎo)地位，但存在著在使用中產(chǎn)生了環(huán)境污染、人畜中毒、農(nóng)藥殘留等問題。當(dāng)前，開發(fā)生物活性高、對非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好的生物農(nóng)藥已成為發(fā)展的新趨勢。部分研究表明植物提取物對植物病原菌有較好的抑制作用，植物源殺菌劑具有低殘留、低毒、與環(huán)境和諧、對非靶標(biāo)生物相對安全等優(yōu)點(diǎn)，所以從植物中尋找具有殺菌、抑菌活性物質(zhì)，是新型天然植物源殺菌劑研制的一條非常重要的途徑。
[0003]植物病原菌的種類很多，其中立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)是一種重要的植物病原真菌，寄主范圍廣，可為害43科263種植物(彭紹裘等，1986)。該菌除了為害水稻引起紋枯病外，還能侵害其它禾谷類作物以及蔬菜、花卉等經(jīng)濟(jì)作物，引起諸如立枯、粹倒、葉枯、鞘枯等多種癥狀，對作物的為害極大。此外，串珠鐮孢菌Fusariummoniliforme Sheld.是鐮孢菌屬Fusarium Link中最重要的植物病原菌之一,可侵染多種作物引起嚴(yán)重病害，特別是在禾谷類作物上，如玉米穗腐病、小麥赤霉病、水稻惡苗病、高粱穗腐病等(Whitel999 ；Parry etal.1995 ；Nyvall etal.1999 ；Frederiksen&0dvody2000 ；Leslie etal.2005)。在谷物儲藏期間，它還可以引起谷物霉變，產(chǎn)生多種真菌毒素污染谷物，如鐮孢菌酸(fusaric acid)、鐮孢菌素(fusarins)、赤霉素(gibberellins)、串珠菌素(moniIifomin)及伏馬菌素(fumonisins),進(jìn)而危害人和動物引起中毒癥狀(Nelsonl992 ;Nelson etal.1994 ； Summere 11 etal.2001)。同時(shí)，這類鐮孢菌也和其他鐮孢菌一樣可以引起人體多種疾病，侵染人的眼、鼻、耳、皮膚、肝、肺、骨髓等，危害免疫力缺乏人群的身體健康，特別是白血病、HIV患者，甚至導(dǎo)致死亡(Nelson et al.1994)。因而，研究這兩種植物病原菌的殺菌劑無論是在病理上還是在經(jīng)濟(jì)上都具有極其重要的意義。
[0004]Hederagenin-3-O-arabinopyranoside是一種阜苷類化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道存在于Il粟蓮花(Anemoclema glaucifolium)、紅毛七(Caulophyllum robustum Maxim)、白頭翁(Pulsatilla chinensis)等植物中。本發(fā)明首次從冬青科植物中分離得到Hederagenin-3-0-arabinopyranoside,并首次進(jìn)行了抗植物病原菌藥理試驗(yàn)。結(jié)果顯示Hederagenin-3-0-arabinopyranoside 對立枯絲核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和串珠鍵抱菌 Fusariummoni liforme Sheld有較好的抑制作用。
[0005]毛冬青為冬青科(Aquffoliaceae)冬青屬植物毛冬青Ilex pubescens Hook.etAm.的干燥根，是我國南方常用中藥，在《廣西中草藥》、《浙江民間常用中草藥》、《新編中醫(yī)學(xué)概要》和《廣西實(shí)用中草藥新選》中均有記載，曾收載于1997版《中國藥典》。毛冬青性平，味微苦甘，無毒，具有清熱解毒，活血通絡(luò)之功效。分布于廣東、廣西、安徽、福建、浙江、江西、臺灣等地。夏、秋采，切片曬干。
[0006]查閱文獻(xiàn)可知，自1983年以來許多學(xué)者對毛冬青的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其主要成分是五環(huán)三萜皂苷類化合物，也是其活性成分。目前對毛冬青藥理的研究主要集中在心血管方面，對抗植物病原菌的活性研究未見報(bào)道。所以本發(fā)明首次對從毛冬青中分離到的Hederagenin-3-O-arabinopyranoside進(jìn)行11種植物病原菌的抑制活性篩選，為制備生物農(nóng)藥提供一定的藥物基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是研究化合物Hederagenin-3-O-arabinopyranoside (常春藤阜苷元-3-0-阿拉伯糖)在抑制抗植物病原菌方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明是基于發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)研究而完成的。研究分兩大部分:
[0009]Hederagenin-3-0-arabinopyranoside 的制備；
[0010]Hederagenin-3-0-arabinopyranoside 在抑制植物病原菌中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0012]一> Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 的制備
[0013]稱取毛冬青干燥根，采用70%?75%乙醇回流提取，提取時(shí)間2?4h，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏；稱取總浸膏，加入蒸餾水(1.5L/kg?3L/kg)，制成懸浮液，再依次用石油醚、正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位減壓濃縮真空干燥，水溶解上大孔樹脂柱，分別用水、30%甲醇、50%甲醇、95%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到50%甲醇洗脫部位；取50%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫,薄層色譜跟蹤,合并相同懼份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(5: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)娃膠柱層析，得到 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 純品。
[0014]稱取毛冬青莖葉，采用70%?75%乙醇回流提取，提取時(shí)間2?4h，合并提取液，回收20%?80%的溶劑，靜置沉淀，過濾，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔樹脂柱，分別用水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、95%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到70%甲醇洗脫部位；取70%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜跟蹤，合并相同懼份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(10: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，得到 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 純品。
[0015]二、Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 抗植物病原菌試驗(yàn)
將11種植物病原菌(4種細(xì)菌和7種真菌)分別活化并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)數(shù)天，制備成麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)0.5 的菌液。在 96 孔板中分別加入菌液和 Hederagenin-3-0-arab inopyranos ide,使 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 終濃度為 20 μ g/ml、30 μ g/ml、40 μ g/ml、50 μ g/ml,設(shè) 3 個(gè)平行重復(fù)。35°C搖床培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，肉眼觀察抑制菌生長的最低濃度即最小抑制濃度(MIC)。結(jié)果顯不表明 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 對立枯絲核菌 Rhizoctonia solaniKiihn和串珠鍵抱菌Fusarium moni liforme Sheld有抑制作用，MCI分別是33.1 μ M,66.2 μ Mo
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】
附圖是 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 的結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例和數(shù)據(jù)對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0018]實(shí)施例1 HederageninK-arabinopyranoside 的制備
[0019]稱取毛冬青干燥根10kg，加入70%乙醇回流提取3次，3h/次；合并提取液，減壓濃縮得總浸膏；稱取總浸膏，加入蒸餾水(2L/kg)，制成懸浮液，依次用石油醚和正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位減壓濃縮真空干燥，水溶解上DlOl大孔樹脂柱，分別用水、30%甲醇、50%甲醇和95%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到50%甲醇洗脫部位；取50%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，等量收集，進(jìn)行TLC點(diǎn)板,合并相同流份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(5: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside純品。該純品可以用于制備抗植物病原菌的藥物。
[0020]實(shí)施例2 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 的制備
[0021]稱取毛冬青莖葉10kg，采用70%乙醇回流提取，提取時(shí)間4h，合并提取液，回收20%?80%的溶劑，靜置沉淀，過濾，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔樹脂柱，分別用水、30 %甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、95 %甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到70 %甲醇洗脫部位；取70%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜跟蹤，合并相同懼份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(10: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside純品。該純品可以用于制備抗植物病原菌的藥物。
[0022]理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù):該化合物為白色粉末，溶于甲醇、二甲基亞砜，ES1-MS m/z:637 [M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 譜信息，確定分子式為 C35H56O815 1H-NMR 譜(300MHz, MeOH) δ:
5.30 (1Η, m, H-12)，4.29 (1H, d, J = 7.5Hz, H_1' )，1.35 (3H, s’ H-27)，1.07 (3H, s’ H-26)，
0.97 (3H, s’ H-30)，0.96 (3H, s’ H_25)，0.87 (3H, s’ H_29)，0.80 (3H, s’ H_24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)到的Hederagenin-3-0-arabinopyranoside (常春藤阜苷元-3-0-阿拉伯糖)波譜數(shù)據(jù)比較一致，故鑒定該化合物為Hederagenin-3-O-arabinopyranoside (常春藤阜苷元-3-0-阿拉伯糖)。
[0023]實(shí)施例3 Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 抗植物病原菌試驗(yàn)
[0024]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0025]細(xì)菌:枯草芽孢桿菌CICC10283、化膿鏈球菌ATCC19615、結(jié)核分枝桿菌CGMCC1.562、藤黃微球菌 CMCC10240
[0026]真菌:新型隱球菌ACCC20337、立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kiihn、辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian、串珠鍵抱菌 Fusarium moni liforme ShelcU爺鏈格抱菌Alternaria solani Jones et Grout、核盤菌Sclerotinia sclerot1rum de Bary、稻痕病菌 CGMCC3.3283
[0027]培養(yǎng)基:MH培養(yǎng)基(上海士峰生物科技有限公司)，1640培養(yǎng)基(HyClone)，PDA
[0028]陽性對照:兩性霉素B，制霉菌素
[0029]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0030]細(xì)菌:用鑷子夾取滅菌牙簽挑取平板上的單菌落，置于滅菌的液體MH培養(yǎng)基中(4ml試管)，35°C搖床過夜培養(yǎng)，使菌種活化；接著轉(zhuǎn)接80?500 μ I菌液至新的液體培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)接量視菌體生長情況而定)，35 °C搖床培養(yǎng)2?6h，將菌液先稀釋至麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)0.5，再用無菌水稀釋20倍備用。
[0031 ] 將預(yù)先配好的濃度均為lmg/ml的化合物加入到96孔板中，每孔2 μ I。用排槍取菌液加到96孔板中，藥物終濃度為20 μ g/ml>30 μ g/ml>40 μ g/ml>50 μ g/ml,設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。35°C搖床培養(yǎng)16?20h，肉眼觀察抑制菌生長的最低濃度即最小抑制濃度(MIC)。
[0032]真菌:從真菌培養(yǎng)斜面上挑取菌體用點(diǎn)接法接到PDA平板上，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，使菌種活化；接著收集孢子，用滅菌的0.9%生理鹽水從平板上洗出孢子，用細(xì)胞篩過濾，稀釋至麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)0.5備用。
[0033]將預(yù)先配好的濃度均為lmg/ml的化合物加入到96孔板中，每孔2 μ I。取15 μ I孢子，加入含0.2%葡萄糖的1640培養(yǎng)基30ml，混合均勻，加入到96孔板中，藥物終濃度為20 μ g/ml、30 μ g/ml、40 μ g/ml、50 μ g/ml，設(shè) 3 個(gè)平行重復(fù)。35°C搖床培養(yǎng) 48 ?72h，肉眼觀察抑制菌生長的最低濃度即最小抑制濃度(MIC)。
[0034]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0035]以兩性霉素B和制霉菌素為陽性對照，初步評價(jià)受試藥物對植物病原菌的抑制作用，結(jié)果如下所示:
[0036]表1:受試藥物對植物病原菌的抑制作用
[0037]
立枯絲核菌串珠鐮孢菌

Rhizoctonia solani KiihnFusarium moniliforme Sheld
iiedJgenin33.1μΜ66.2μΜ
,..,20ug/ml40ug/ml
-arabinopyranoside
兩性霉素B5.4μΜ
(陽性藥)5μ^/ιη1——
制霉菌素__36.2μΜ
(陽性藥)ΙΟμ^/ml
[0038]注:數(shù)字表不MIC 值，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 對其余 9 種植物病原菌無抑制作用。
[0039]以上結(jié)果顯不:Hederagenin-3-0-arab inopyranos ide 對立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kiihn 和串珠德抱菌 Fusarium moniliforme Sheld 有抑制作用，MCI分別是 33.1 μ M，66.2 μ Μ。表明本發(fā)明的 Hederagenin-3-0_arabinopyranoside 具有抗植物病原菌作用。
【權(quán)利要求】
1.化合物Hederagenin-3-O-arabinopyranoside常春藤阜苷元-3-0-阿拉伯糖在制備抗植物病原菌劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗植物病原菌的ederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌的應(yīng)用，其特征在于所述的植物病原菌為實(shí)體菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Hederagenin-3-O-arabinopyranoside是按下述方法制備得到的: 稱取毛冬青干燥根，采用70%?75%乙醇回流提取，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏；稱取總浸膏，加入蒸餾水(1.5L/kg?3L/kg)，制成懸浮液，再依次用石油醚、正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位減壓濃縮真空干燥，水溶解上大孔樹脂柱，分別用水、30%甲醇、50%甲醇、95%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到50%甲醇洗脫部位；取50%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜跟蹤，合并相同懼份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(5: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 純品。 稱取毛冬青莖葉，采用70 %?75 %乙醇回流提取，合并提取液，回收20 %?80 %的溶齊U，靜置沉淀，過濾，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔樹脂柱，分別用水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、95%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮真空干燥得到70%甲醇洗脫部位；取70%甲醇洗脫部位，硅膠(100?200目)拌樣后硅膠柱層析(200?300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20:1)、二氯甲烷-甲醇(10: I)、二氯甲烷-甲醇(5: I)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜跟蹤，合并相同懼份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(10: I)洗脫部位，以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside 純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗植物病原菌的ederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌應(yīng)用，其特征在于所述的植物病原菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kiihn。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗植物病原菌的ederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌應(yīng)用，其特征在于所述的植物病原菌為串珠鐮孢菌Fusarium moniIiformeSheldo
【文檔編號】C07H15/256GK104170821SQ201410224698
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】林麗萍, 李英 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所