多步驟的最終過(guò)濾的制作方法
【專利摘要】本文報(bào)道了包括兩個(gè)直接相連的過(guò)濾步驟的組合的用于濃縮的多肽溶液的最終過(guò)濾的方法，所述方法使用孔徑為3.0μm和0.8μm的第一個(gè)過(guò)濾器和孔徑為0.45μm和0.22的第二個(gè)過(guò)濾器。
【專利說(shuō)明】多步驟的最終過(guò)濾
[0001]本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01080044481.6，申請(qǐng)日為2010年9月29日， 優(yōu)先權(quán)日:為2009年10月I日，發(fā)明名稱為“多步驟的最終過(guò)濾”。
[0002]本文報(bào)道了包括兩個(gè)直接相連的過(guò)濾步驟的組合的用于濃縮的多肽溶液的最終過(guò)濾的方法，其中第一個(gè)過(guò)濾步驟包括使用孔徑為3.0 μ m的過(guò)濾器的預(yù)過(guò)濾和使用孔徑為0.8 μ m過(guò)濾器的主過(guò)濾，且第二個(gè)過(guò)濾步驟包括使用孔徑為0.45 μ m的過(guò)濾器的預(yù)過(guò)濾和使用孔徑為0.22 μ m的過(guò)濾器的主過(guò)濾。
[0003]發(fā)明背景
[0004]濃度超過(guò)100g/l的蛋白質(zhì)溶液在最終過(guò)濾步驟期間容易有困難，例如只具有低跨膜通量或所使用的過(guò)濾器被在配制或濃縮過(guò)程期間形成的聚集物或顆粒聚集阻塞或由于加入的賦形劑導(dǎo)致濃縮的溶液粘度增加。
[0005]粘度高和顆?；蚓奂锖吭黾咏Y(jié)合在一起經(jīng)常導(dǎo)致所使用的0.22 μ m最終過(guò)濾的過(guò)濾器的孔被阻塞。因此，或者在過(guò)濾步驟期間(即在一批被完全處理之前)必須替換過(guò)濾器，或者必須增加過(guò)濾器面積。
[0006]還已經(jīng)觀察到孔徑為0.45 μ m的過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的過(guò)濾器的組合沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，例如作為Sartobran P0.45/0.22 μ m過(guò)濾器提供時(shí)如此?？赡鼙荛_(kāi)上述問(wèn)題的增加孔徑的過(guò)濾器被用作深度過(guò)濾器或預(yù)-過(guò)濾器，但不被用作最終過(guò)濾器。
[0007]在DE420444 4中報(bào)道了從氣流除去水滴的1.2 μ m預(yù)過(guò)濾器和之后的0.2 μ m無(wú)菌過(guò)濾的組合。在US4，488，961中報(bào)道了包含兩個(gè)不同孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾器單元，其中孔徑較小的過(guò)濾器是可彎曲的，通過(guò)使過(guò)濾器的流向變彎曲以降低過(guò)濾器單元的阻力。在US5, 643, 566中使用孔徑為0.45 μ m的過(guò)濾器的預(yù)過(guò)濾和孔徑為0.22 μ m的過(guò)濾器的無(wú)菌過(guò)濾的組合。在EP0204836中報(bào)道了兩階段過(guò)濾器，該過(guò)濾器使用內(nèi)壁光滑的膜與在其下面的由帶有隆起的脹管器的硬質(zhì)的過(guò)濾支撐物支撐的薄的、能彎曲的多孔膜構(gòu)建而成。在DE3818860中報(bào)道了至少兩個(gè)具有不同的膜材料和不同的過(guò)濾器孔徑和過(guò)濾器孔幾何形狀的膜濾器單元的組合。
[0008]Aldington等人(J.Chrom.B848 (2007) 64-78)報(bào)道了按比例放大的單克隆抗體純化方法。在CS247484報(bào)道了制備針對(duì)人淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白的方法。
[0009]發(fā)明概沭
[0010]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)各自包含預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器且各自具有特別選擇的孔徑的過(guò)濾器的組合能用于在最后的封裝步驟期間過(guò)濾高度濃縮的免疫球蛋白溶液，而在過(guò)濾過(guò)程期間沒(méi)有孔阻塞的風(fēng)險(xiǎn)和替換過(guò)濾器的需求。
[0011]本文的一個(gè)方面報(bào)道了制備免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括以下步驟:
[0012]a)提供蛋白質(zhì)的濃度至少為100g/l的免疫球蛋白溶液，
[0013]b)經(jīng)第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的組合過(guò)濾所述免疫球蛋白溶液，其中第一個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器，并由此制備免疫球蛋白溶液。
[0014]本文的另一個(gè)方面報(bào)道了第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的組合的如本文報(bào)道的過(guò)濾器組合在活性藥物成分制備之前進(jìn)行的免疫球蛋白溶液的最終過(guò)濾中的應(yīng)用，其中第一個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器。
[0015]本文的另一個(gè)方面報(bào)道了制備免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0016]a)提供包含編碼免疫球蛋白的核酸的細(xì)胞，
[0017]b)培養(yǎng)所述細(xì)胞，
[0018]c)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白，
[0019]d)使用一個(gè)或多個(gè)色譜法步驟純化所述免疫球蛋白并提供免疫球蛋白溶液，和
[0020]e)經(jīng)第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的組合過(guò)濾步驟d)的免疫球蛋白溶液，其中第一個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器，并由此制備免疫球蛋白。
[0021]本文的另一個(gè)方面報(bào)道了試劑盒，其包含第一個(gè)過(guò)濾器(包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器)和第二個(gè)過(guò)濾器(包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器)。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)過(guò)濾器面積最多是第二個(gè)過(guò)濾器面積的兩倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器具有大致相同的總過(guò)濾器面積。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液包含糖和/或氨基酸和/或表面活性劑和/或鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液的濃度為100g/l至300g/l。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液的體積為3升至100升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)濾施加的壓力是0.1巴至4.0巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液的濃度為160g/l或更高，且過(guò)濾施加的壓力為1.45巴或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中壓力為1.50巴或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液包含糖和表面活性劑，且免疫球蛋白溶液濃度為125mg/ml或更高，且過(guò)濾施加的壓力為0.75巴或更低。在另一個(gè)實(shí)施方案中壓力為0.7巴或更低。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是抗-1L13受體α抗體或抗-HER2抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化過(guò)程使用蛋白A親合色譜步驟和至少一個(gè)選自以下的步驟:陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水作用色譜。
[0024]發(fā)明詳沭[0025]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)各自包含預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器和各自具有特別選擇的孔徑的過(guò)濾器或過(guò)濾器單元的組合可以用于在最后封裝步驟期間過(guò)濾高度濃縮的和粘稠的以及配制的免疫球蛋白溶液(即包含糖和表面活性劑)。尤其是包含孔徑分別為3.0 μ m和0.8 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器的第一個(gè)過(guò)濾器和包含孔徑分別為0.45 μ m和0.22 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器的第二個(gè)過(guò)濾器的組合是非常有利的。就該組合中的單個(gè)過(guò)濾器單元而言，過(guò)濾包含總計(jì)例如Ikg的抗-1L-13Ral抗體或6kg的抗-HER2抗體的高度濃縮的溶液已是可能的，而且封裝所述的量而僅有較少的材料損失已是可能的。在一個(gè)實(shí)施方案中過(guò)濾器表面積與溶液體積的比率已被確定。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液包括免疫球蛋白和賦形劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦形劑包含一種或更多種物質(zhì)，其選自糖諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖，氨基酸諸如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸，鹽諸如氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀和表面活性劑諸如聚山梨醇酯類和聚(氧乙烯-聚氧丙烯)聚合物。
[0027]本文所述的過(guò)濾在治療性抗體的制備中用作最終過(guò)濾步驟。該步驟可以在將所需的賦形劑、穩(wěn)定劑和/或抗-氧化劑加入高度濃縮的抗體溶液之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，以kg計(jì)的抗體的量與過(guò)濾器的總面積的比率為1000g/m2至10，000g/m2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述比率為1000g/m2至6000g/m2。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述比率為4000g/m2至6000g/m2。
[0028]“多肽”由通過(guò)肽鍵連接氨基酸(天然的或合成的)組成。具有少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可被稱為“肽”，而由兩個(gè)或更多個(gè)多肽組成的分子或包含一個(gè)超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基的多肽的分子可被稱為“蛋白質(zhì)”。多肽還可以包含非-氨基酸成分，諸如碳水化合物基團(tuán)、金屬離子或羧酸酯。非-氨基酸成分可通過(guò)表達(dá)多肽的細(xì)胞添加，且可根據(jù)細(xì)胞類型而不同。在本文中根據(jù)其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼其的核酸來(lái)定義多肽。一般不對(duì)添加物例如糖基進(jìn)行特別說(shuō)明，但是其可以存在。
[0029]術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”是指由一種或多種基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。已鑒定的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及極多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以多種形式存在，包括例如，F(xiàn)v, Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體。
[0030]術(shù)語(yǔ)“完整免疫球蛋白”是指包含兩條被稱為免疫球蛋白輕鏈多肽(輕鏈)和兩條被稱為免疫球蛋白重鏈多肽(重鏈)的免疫球蛋白。完整免疫球蛋白的各個(gè)免疫球蛋白重鏈和輕鏈多肽包含可變域(可變區(qū))(一般為多肽鏈的氨基末端部分)，其包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。完整的免疫球蛋白的各個(gè)免疫球蛋白重鏈和輕鏈還包含恒定區(qū)(通常為羧基末端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體結(jié)合至i)具有Fe Y受體(FcyR)的細(xì)胞，諸如吞噬細(xì)胞，或ii)具有新生Fe受體(FcRn)(又稱為Brambell受體)的細(xì)胞。其還介導(dǎo)抗體與一些因子(包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子諸如成分(Clq))結(jié)合。免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變域包含不同的片段，即4個(gè)框架區(qū)(FR)和3個(gè)高變區(qū)(CDR)。
[0031]術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白碎片”是指包含至少一個(gè)以下結(jié)構(gòu)域的多肽:重鏈的可變域、重鏈的C0I域、鉸鏈區(qū)、Ch2域、Ch3域、Ch4域、輕鏈的可變域和/或輕鏈的Q域。還包含其衍生物和變體。例如，可存在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或氨基酸區(qū)域缺失的可變域。
[0032]術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白綴合物”指包含經(jīng)肽鍵與其他多肽綴合的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽。所述其他多肽為非免疫球蛋白肽，例如激素、或生長(zhǎng)受體、或抗融合肽、或補(bǔ)體因子等。
[0033]術(shù)語(yǔ)“過(guò)濾器”是指微孔過(guò)濾器或或大孔過(guò)濾器。過(guò)濾器包括濾過(guò)膜，濾過(guò)膜自身由聚合材料構(gòu)成，所述聚合材料例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺類(尼龍，例如Zetapore?、N66Po si dyne?)、聚酯類、醋酸纖維素、再生纖維素、纖維素復(fù)合材料、聚砜類、聚醚砜類、聚芳砜類、聚苯砜類(polyphenylsulphones)、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、非織造的和織造的織物(例如
Tyvek.)、纖維材料，或者由無(wú)機(jī)材料組成，諸如zeolithe、Si02、A1203、TiO2或羥基磷灰
石。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的過(guò)濾膜由醋酸纖維素制成。
[0034] 對(duì)于重組產(chǎn)生的免疫球蛋白的純化，通常采用不同的柱色譜步驟的組合。一般，通常在蛋白A親和色譜之后再進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)分離步驟。該最后的純化步驟稱為“最終精制(polishing step)”，用于去除痕量雜質(zhì)和污染物如聚集的免疫球蛋白、殘留HCP(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))、DNA(宿主細(xì)胞核酸)、病毒或內(nèi)毒素。對(duì)于該最終精制，通常使用流通模式(flow-through mode)下的陰離子交換材料。
[0035]己經(jīng)充分確立了不同的方法并廣泛地用于蛋白質(zhì)回收和純化，例如用微生物蛋白質(zhì)的親和色譜(例如，蛋白A或蛋白G親和色譜)、離子交換色譜(例如，陽(yáng)離子交換(羧甲基樹(shù)脂)、陰離子交換(氨基乙基樹(shù)脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(例如，用β巰基基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附色譜(aromatic adsorptionchromatography)(例如，用苯基瓊脂糖凝膠、親氮雜芳基樹(shù)脂(aza-arenophilic resin)或間氨基苯硼酸)、金屬螯合親和色譜(例如，用Ni (II)-和Cu(II)-親和材料)、尺寸排阻色譜和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vi jayalakshmi, Μ.A., App1.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
[0036]本文所述的第一個(gè)方面是制備免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括:
[0037]-提供蛋白質(zhì)的濃度至少為100g/l的免疫球蛋白溶液，
[0038]-經(jīng)第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元的組合過(guò)濾所述免疫球蛋白溶液，其中第一個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑分別為3.0 μ m和0.8 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑分別為0.45 μ m和0 .22 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器，其是通過(guò)將所述溶液施加至所述過(guò)濾器組合并施加壓力而進(jìn)行的，由此制備免疫球蛋白溶液。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)濃度為100g/l至300g/l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)濃度為100g/l至200g/l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)濃度為120g/l至165g/l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液的體積為3升至100升。該溶液體積相當(dāng)于總質(zhì)量300g至50，OOOg的免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體積為3.1升至80升。蛋白質(zhì)的濃度為120g/l至165g/l時(shí)，該溶液體積相當(dāng)于總質(zhì)量370g至13，200g的免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是抗-1L13受體α抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是抗-HER2抗體。
[0040]本文的另一個(gè)方面報(bào)道了制備免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0041]-培養(yǎng)包含編碼免疫球蛋白的核酸的細(xì)胞，
[0042]-從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白，
[0043]-使用一個(gè)或多個(gè)色譜法步驟純化所述免疫球蛋白，并提供純化的免疫球蛋白溶液，和
[0044]-經(jīng)如本文報(bào)道的過(guò)濾器的組合(即第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元的組合)過(guò)濾純化的免疫球蛋白溶液，其中第一個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為3.Ομπι的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器，其是通過(guò)將所述溶液施加至所述過(guò)濾器組合并施加壓力而進(jìn)行的。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在細(xì)胞是原核細(xì)胞的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞或芽孢桿菌屬(bacillus)細(xì)胞。在細(xì)胞是真核細(xì)胞的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，在一個(gè)特定的實(shí)施方案
中所述細(xì)胞選自CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施
方案中，所述細(xì)胞是選自CH0-K1和CHO DG44的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)是在20°C至40°C的溫度進(jìn)行，且持續(xù)時(shí)間為4至28天。在一個(gè)實(shí)施方案中，純化過(guò)程使用蛋白A親合色譜步驟和至少一個(gè)選自以下的步驟:陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水作用色譜。
[0046]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含孔徑分別為3.0 μ m和0.8 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器的第一個(gè)過(guò)濾器單元和包含孔徑分別為0.45 μ m和0.22 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器的第二個(gè)過(guò)濾器單元的組合對(duì)處理(過(guò)濾)高度濃縮的免疫球蛋白溶液有利，其使得可以過(guò)濾完整批次的濃縮的免疫球蛋白溶液而不需要替換過(guò)濾器。
[0047]還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在過(guò)濾器組合中，有利于的是各過(guò)濾器單元以及過(guò)濾器組合中所使用的兩個(gè)過(guò)濾器中的每一個(gè)具有大致相等的過(guò)濾器面積，即在最小過(guò)濾器面積的兩倍之內(nèi)。
[0048]還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，視溶液中包括免疫球蛋白在內(nèi)的各組分而不同的壓力和濃度范圍有助于有利的方法。
[0049]如果所述溶液是濃度為160g/l或更高濃度(即165g/l或170g/l)的濃縮的免疫球蛋白溶液，沒(méi)有向其中加入過(guò)糖或表面活性劑，則在一個(gè)實(shí)施方案中在1.45巴或更高的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作，在另一個(gè)實(shí)施方案中在1.5巴或更高的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作。如果溶液是濃度為125g/l或更高濃度(即130g/l或135g/l)的濃縮的免疫球蛋白溶液，向其中已至少加入了糖和表面活性劑，則在一個(gè)實(shí)施方案中在0.75巴或更低的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作，在另一個(gè)實(shí)施方案中在0.7巴或更低的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作。
[0050]本文的另一個(gè)方面報(bào)道了試劑盒，其包含第一個(gè)過(guò)濾器單元(包含孔徑分別為
3.0 μ m和0.8 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器)和第二個(gè)過(guò)濾器單元(包含孔徑分別為0.45 μ m和0.22 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器)。本文的另一個(gè)方面報(bào)道了包含第一個(gè)過(guò)濾器單元(包含孔徑分別為3.0 μ m和0.8 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器)和第二個(gè)過(guò)濾器單元(包含孔徑分別為0.45 μ m和0.22 μ m的預(yù)過(guò)濾器和主過(guò)濾器)的過(guò)濾器在過(guò)濾蛋白質(zhì)的濃度至少為100g/l的濃縮的免疫球蛋白溶液中的應(yīng)用。
[0051]提供了以下實(shí)施例和附圖以助于理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍如所附權(quán)利要求所述。應(yīng)理解能夠?qū)λ龇椒ㄟM(jìn)行修改而不脫離本發(fā)明的主旨。
[0052]附圖
[0053]圖1:使用抗體濃度為222mg/ml的抗-HER2抗體溶液和2.0巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0054]圖2:使用補(bǔ)充有約200mM海藻糖和約0.05% (w/v)吐溫20的抗體濃度為125mg/ml的抗-HER2抗體溶液和2.0巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑
1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0055]圖3:使用抗體濃度為162mg/ml的抗-HER2抗體溶液和1.8巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0056]圖4:使用補(bǔ)充有約200mM海藻糖和約0.2% (w/v)泊洛沙姆的抗體濃度為141mg/ml的抗-1L13Ra抗體溶液和1.6巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑
1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。[0057]圖5:使用抗體濃度為162mg/ml的抗-HER2抗體溶液和1.1巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0058]圖6:使用補(bǔ)充有海藻糖和泊洛沙姆的抗體濃度為141mg/ml的抗_IL13Ra抗體溶液和0.8巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2μπι的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0059]圖7:使用補(bǔ)充有海藻糖和吐溫20的抗體濃度為125mg/ml的抗-HER2抗體溶液和0.8巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0060]圖8:使用補(bǔ)充有海藻糖和吐溫20的抗體濃度為125mg/ml的抗-HER2抗體溶液和0.3巴的施加的壓力獲得的滲透流的時(shí)程(菱形=包含孔徑1.2 μ m的過(guò)濾器的組合；正方形=包含孔徑3.0 μ m的過(guò)濾器的組合)。
[0061]實(shí)施例1
[0062]材料和方法
[0063]杭體
[0064]示例性的抗體是針對(duì)IL13受體蛋白質(zhì)的免疫球蛋白(抗_IL13Ra I抗體)，例
如在W02006/072564的SEQ ID N0:01至12中所報(bào)道(引入本文作為參考)。
[0065]另一個(gè)示例性的免疫球蛋白是在W092/022653、W099/057134、W097/04801、US5, 677，171和US5, 821，337 (引入本文作為參考)中所報(bào)道的抗-HER2抗體。
[0066]過(guò)濾器
[0067]本文尤其使用了 Sartobran P0.45 μ m+0.2 μ m 濾筒和 SartocleanCA3.0 μ m+0.8 μ m濾筒作為示范。這兩種濾筒可得自Sartorius AG, ( Gttitingen,德國(guó))。
[0068]分析方法
[0069]尺寸排阻色譜:
[0070]樹(shù)脂:TSK3000 (Tosohaas)
[0071]柱:300x7.8mm
[0072]流速:0.5ml/ 分鐘
[0073]緩沖液:包含250mM氯化鉀的200mM磷酸鉀，
[0074]調(diào)節(jié)至ρΗ7.0
[0075]波長(zhǎng):280nm
[0076]DNA-閾值-系統(tǒng):參見(jiàn)例如 Merrick, H.,和 Hawlitschek, G., Biotech ForumEurope9(1992)398-403
[0077]蛋白A ELISA:將微量滴定板的孔涂覆源自雛雞的多克隆抗-蛋白A-1gG。結(jié)合后，通過(guò)使用樣品緩沖液洗滌將沒(méi)有反應(yīng)的抗體除去。為結(jié)合蛋白A，將確定體積的樣品加入所述孔中。樣品中存在的蛋白A經(jīng)雛雞抗體被結(jié)合并留在板的孔中。孵育后除去樣品溶液，并將孔洗滌。然后 為檢測(cè)，加入雛雞來(lái)源的多克隆抗-蛋白A-1gG-生物素綴合物和鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶綴合物。經(jīng)過(guò)另一個(gè)洗滌步驟后，加入底物溶液加入，形成有色的反應(yīng)產(chǎn)物。顏色的強(qiáng)度與樣品的蛋白A含量成比例。一段確定的時(shí)間后停止反應(yīng)，并測(cè)定吸光度。
[0078]宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)ELISA:將微量滴定板的孔壁涂覆血清白蛋白和鏈霉抗生物素的混合物。將源自山羊的針對(duì)HCP的多克隆抗體結(jié)合于微量滴定板的孔壁。經(jīng)過(guò)洗滌步驟后，使用不同濃度的HCP校準(zhǔn)系列和樣品溶液對(duì)微量滴定板的不同的孔進(jìn)行孵育。孵育后通過(guò)使用緩沖溶液洗滌除去未結(jié)合樣品物質(zhì)。為進(jìn)行檢測(cè)，使用抗體過(guò)氧化物酶綴合物對(duì)各孔進(jìn)行孵育，以測(cè)定結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。使用ABTS孵育并在405nm檢測(cè)來(lái)檢測(cè)所固定的過(guò)氧化物酶活性。
[0079]實(shí)施例2
[0080]使用0.45 μ m和0.22 μ m孔徑的單個(gè)過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾抗-HER2抗體
[0081]在該實(shí)施例中顯示高度濃縮的免疫球蛋白溶液不能在不阻塞過(guò)濾器的孔的情況下使用孔徑0.45 μ m(預(yù)過(guò)濾器)和0.22μπι(主過(guò)濾器)的單個(gè)無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，其中負(fù)載為每平方米過(guò)濾器面積超過(guò)2，460g蛋白質(zhì)。
[0082]在該實(shí)施例中使用了孔徑為0.45 μ m和0.22 μ m和總過(guò)濾器面積為0.2平方米的單個(gè)過(guò)濾器。
[0083]表1:在單個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾中使用的溶液。
[0084]
【權(quán)利要求】
1.制備免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括: a)提供濃度至少為100g/l的免疫球蛋白溶液， b)將所述免疫球蛋白溶液施加至第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元的組合，其中第一個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器，壓力為0.1至4.0巴，并由此制備免疫球蛋白溶液。
2.制備免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: a)培養(yǎng)包含編碼免疫球蛋白的核酸的細(xì)胞， b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白， c)使用一個(gè)或多個(gè)色譜法步驟純化所述免疫球蛋白，并提供免疫球蛋白溶液， d)向該溶液中任選地加入糖、氨基酸和/或洗滌劑， e)使用選自滲濾或切向流過(guò)濾的方法任選地將所述免疫球蛋白溶液濃縮至100g/l或更高的濃度，和 f)將之前步驟的免疫球蛋白溶液施加至第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元的組合，其中第一個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為3.0 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.8 μ m的主過(guò)濾器且第二個(gè)過(guò)濾器單元包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器，壓力為0.1至4.0巴，并由此制備免疫球蛋白。
3.依據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其特征為第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元中的過(guò)濾器具有大致相等的過(guò)濾器面積。
4.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的濃度為100g/l至300g/l。
5.依據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的濃度為100g/l至200g/l。
6.依據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的濃度為120g/l至165g/l。
7.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的體積為3升至100升。
8.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的體積為3.1升至80升。
9.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白是抗-1L13受體α抗體或抗-HER2抗體。
10.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征為所述純化過(guò)程使用蛋白A親合色譜步驟和至少一個(gè)選自以下的步驟:陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水作用色譜。
11.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液的濃度為160g/l或更高，且所述施加至過(guò)濾器的組合是通過(guò)施加1.45巴或更高的壓力進(jìn)行的。
12.依據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征為所述壓力為1.50巴或更高。
13.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述溶液是濃度為160g/l或更高濃度的濃縮的免疫球蛋白溶液，沒(méi)有向其中加入過(guò)糖或表面活性劑，且在1.45巴或更高的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作。
14.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述溶液是濃度為125g/l或更高濃度的濃縮的免疫球蛋白溶液，向其中已至少加入了糖和表面活性劑，且在0.75巴或更低的施加的壓力下進(jìn)行該方法的操作。
15.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液包含糖和表面活性劑，且所述免疫球蛋白溶液的濃度為125mg/ml或更高，且所述施加至過(guò)濾器的組合是通過(guò)施加0.75巴或更低的壓力進(jìn)行的。
16.依據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征為所述壓力為0.7巴或更低。
17.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為第一個(gè)過(guò)濾器面積最多是第二個(gè)過(guò)濾器面積的兩倍。
18.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器單元具有相同的總過(guò)濾器面積。
19.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為免疫球蛋白溶液包括免疫球蛋白和賦形劑。
20.依據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征為所述賦形劑包含一種或更多種物質(zhì)，其選自糖諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖，氨基酸諸如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸，鹽諸如氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀和表面活性劑諸如聚山梨醇酯類和聚(氧乙烯-聚氧丙烯)聚合物。
21.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述免疫球蛋白溶液包含糖和/或氨基酸和/或表面活性劑和/或鹽。
22.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為以kg計(jì)的抗體的量與過(guò)濾器的總面積的比率為 1000g/m2 至 10，000g/m2。
23.依據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征為所述比率為1000g/m2至6000g/m2。
24.依據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征為所述比率為4000g/m2至6000g/m2。
25.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的過(guò)濾膜由醋酸纖維素制成。
26.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征為所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
27.依據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征為所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，所述細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞或芽孢桿菌(bacillus)屬細(xì)胞。
28.依據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征為在細(xì)胞是真核細(xì)胞，所述細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中所述細(xì)胞選自CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、PctX:#細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞。
29.依據(jù)權(quán)利要求28的方法，其特征為所述細(xì)胞是選自CHO-Kl和CHODG44的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
30.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征為培養(yǎng)是在20°C至40°C的溫度進(jìn)行，且持續(xù)時(shí)間為.4至28天。
31.試劑盒，其包含孔徑為3.Ομπι至0.8μπι的第一個(gè)過(guò)濾器和孔徑為0.45μπι至.0.22 μ m的第二個(gè)過(guò)濾器。
32.第一個(gè)和第二個(gè)過(guò)濾器的過(guò)濾器組合在活性藥物成分制備之前進(jìn)行的免疫球蛋白溶液的最終過(guò)濾中的應(yīng)用，其中第一個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為3.0ym的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為.0.8 μ m的主過(guò)濾器，且第二個(gè)過(guò)濾器包含孔徑為0.45 μ m的預(yù)過(guò)濾器和孔徑為0.22 μ m的主過(guò)濾器。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103980346SQ201410246761
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2009年10月1日
【發(fā)明者】R·法爾肯施泰因, K·施萬(wàn)德納 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司