布魯氏菌omp31抗原表位及其單克隆抗體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了布魯氏菌omp31抗原表位及其抗體和應(yīng)用，表位的序列為GGYIGINAGYAGGKFK。本發(fā)明還公開了識別上述表位的單克隆抗體，及上述表位與單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病試劑或藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】布魯氏菌〇mp31抗原表位及其單克隆抗體和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種布魯氏菌〇mp31抗原表位，以及使用該表位刺激得到的抗布魯氏 菌omp31蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌?。˙rucellosis)是目前世界上流行最廣的人畜共患傳染病之一，據(jù)世 界衛(wèi)生組織統(tǒng)計表明，全世界每年出現(xiàn)50萬例人布魯氏菌病，每年造成的經(jīng)濟損失達30億 美元。我國布病的流行以羊種布氏桿菌為主的混合感染，羊種占流行株的80%。
[0003] 布魯氏菌病臨床癥狀復(fù)雜，引起的發(fā)熱、流產(chǎn)等病理損害易與某些常見疾病混淆； 醫(yī)生很難單憑有無病畜接觸史來診斷布氏菌感染，給診斷帶來了一定的困難，容易導(dǎo)致誤 診，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治療手段，抗生素的大量長期使用仍很難見效，且 容易引起耐藥性問題。因此，布魯氏菌的疫苗預(yù)防和早期快速診斷對布菌的防控具有重大 的現(xiàn)實意義；其中疫苗的免疫效果和布菌診斷的準確性就顯得尤為重要。目前，布魯氏菌病 的免疫制劑種類主要包括弱毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、抗獨特性疫苗和DNA疫苗 等。
[0004] 由于熱滅活菌缺乏活性抗原刺激，不能在體內(nèi)誘發(fā)可檢測的IL-12,并且抑制 IL-12的產(chǎn)生，免疫效果不佳，而且死菌誘發(fā)的多是無保護力的體液免疫應(yīng)答。而亞單位疫 苗雖然可起到短期的保護作用，但并不能誘發(fā)有效的長期免疫，只有活菌才能誘發(fā)細胞免 疫。
[0005] 我國主要是以布魯氏菌弱毒菌苗株M5-90來免疫羊。它對成年羊有很好的免疫保 護效果，但會導(dǎo)致妊娠羊流產(chǎn)。〇mp31蛋白為膜孔蛋白，與弱毒菌苗株毒力相關(guān)，并含有保護 性抗原表位，其基因序列在不同的種屬之間的同源性高達98%以上，在牛種菌中缺失，在羊 種和豬種之間存在大約9個核苷酸的差異，并存在氨基酸序列的改變，故omp31蛋白的單克 隆抗體可能能夠鑒別診斷不同生物型的布魯氏菌感染。若將M5-90疫苗株攜帶的omp31基 因全部敲除，則影響弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于M5-90免疫的動物和野毒菌株自然 感染的動物現(xiàn)有診斷方法不能鑒別，嚴重影響了布魯氏菌病的檢驗和疫苗免疫預(yù)防。因此， 針對omp31蛋白的抗原表位進行修飾或改造標記疫苗，可建立該表位多肽ELISA診斷方法 及其診斷試劑，進而解決布魯氏菌病鑒別診斷和基因工程標記弱毒菌苗株的技術(shù)難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種布魯氏菌omp31抗原表位。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述omp31抗原表位在制備布魯氏菌病診斷試劑 中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的又一個目的在于提供由上述表位刺激產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0009] 本發(fā)明的再一個目的在于提供上述單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌 病診斷試劑或藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 布魯氏菌〇mp31抗原表位，其序列為GGYIGINAGYAGGKFK ( SEQ ID N0:6)。
[0011] 一種抗布魯氏菌〇mp31蛋白的單克隆抗體，其制備方法為： 1) 將權(quán)利要求1所述的布魯氏菌〇mp31抗原表位免疫動物； 2) 取經(jīng)免疫的動物脾細胞與瘤細胞融合，得到可穩(wěn)定分泌抗布魯氏菌omp31蛋白的雜 交瘤細胞； 3) 收集、純化雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，即為抗布魯氏菌omp31蛋白的單克隆抗 體。
[0012] 作為優(yōu)選的，所述單克隆抗體的重鏈為IgM、輕鏈為K鏈，該單克隆抗體能與上述 的布魯氏菌抗原多肽特異性結(jié)合。
[0013] 作為優(yōu)選的，產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動物的血清間接ELISA效價不低于1 :51200。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的〇mp31抗原多肽能有效激活分泌INF-γ的T細胞，推測該抗原多肽為 omp31 T和B淋巴細胞重疊表位，偶聯(lián)之后可用于檢測羊血清中的布魯氏菌病，建立 Peptide-ELISA檢測方法。本發(fā)明的單克隆抗體，對omp31蛋白具有很好的特異性識別能 力，可以精確地識別布魯氏菌的表位。本發(fā)明的〇mp31抗原多肽極其單克隆抗體可用于制 備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病的試劑或藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是PCR擴增目的序列的電泳圖； 圖2是omp31重組蛋白表達電泳鑒定圖； 圖3是omp31重組蛋白純化電泳鑒定及Western-Blot血清鑒定圖； 圖4是Western-Blot試驗檢測單克隆抗體omp31-2D2與布魯氏菌疫苗株M5-90中提 取的天然膜蛋白的反應(yīng)性結(jié)果圖； 圖5是多肽-ELISA測定單克隆抗體株omp31-2D2抗原表位結(jié)果圖； 圖6是ELLISpot檢測分泌INF- γ T細胞水平結(jié)果圖； 圖7是間接免疫熒光試驗檢測單克隆抗體omp31-2D2與感染帶有omp31基因的慢病毒 的293FT細胞反應(yīng)性結(jié)果圖； 圖8是酶免疫染色試驗檢測單克隆抗體omp31-2D2與羊種布魯氏菌菌涂片反應(yīng)性結(jié)果 圖。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例，進一步說明本發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明使用的布魯氏菌M5-90疫苗株購自蘭州獸醫(yī)研究所，為本行業(yè)所公知的疫 苗株。
[0018] omp31重組蛋白表達載體的構(gòu)建 以新疆石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫教授提供的布菌基因組為模板擴增目的基因序列，利用 GenBank 中提供的羊布魯氏菌omp31 基因序列，GenBank accession No. gi|333601402,用 生物學(xué)軟件〇lig〇7設(shè)計引物擴增截短N端19個氨基酸信號肽的omp31基因，選用PET-30a 載體，分別在5'端和3'端引入Nde I及Xho I酶切位點，斜體加粗為酶切位點。
[0019] 上游引物 F : 5-GGAATTra7?7^GCCGACGTGGTTG-3 (SEQ ID N0:28 ) 下游引物R:5-CCG?77ΓG^GAACTTGTAGTTCAGAC-3(SEQIDN0:29) PCR 擴增目的基因：25 μ L 體系包括 dNTP 1· 5 μ L，10XPCR Buffer 2· 5 μ L，PI、P2 各 〇· 5 μ L，模版 DNA1 μ L，F(xiàn)ast Star 酶 0· 5 μ L，H20 18. 5 μ L。PCR 反應(yīng)條件為：95 °C預(yù)變性 2min，95 °C 45s，50 °C 30s，72 °C 70s，擴增 30 個循環(huán)后，72 °C延伸 lOmin。PCR 結(jié)果 在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(見圖1，由圖1可知目的基因片段680bp)，并用膠回收試劑盒 回收。將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接并按照pMD19-T載體說明書進行，感受態(tài)的制 備、轉(zhuǎn)化與陽性克隆的鑒定均按《分子克?。ǖ谌妫凡僮鳌Ｌ羧MD19-T/ omp31陽性 克隆交由英濰捷基(上海）貿(mào)易有限公司。測序成功后，用Nde 1/ Xho I雙酶切pMD19-T/ omp31，回收小片段即為目的基因片斷。與經(jīng)過相應(yīng)核酸內(nèi)切酶雙酶切的pET-30a質(zhì)粒連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，陽性克隆提取質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增及Nde 1/ Xho I雙酶切 鑒定后，交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。測序正確，成功構(gòu)建表達載體pET-30a-〇mp31。
[0020] 布魯氏菌重組膜蛋白omp31的制備 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a-〇mp31 (新疆石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫教授惠贈）轉(zhuǎn)化感受態(tài) BL21。將重組菌搖至對數(shù)生長期后，以終濃度ImM IPTG加入誘導(dǎo)目的蛋白表達。誘導(dǎo)后超聲 破碎，經(jīng)鑒定目的蛋白主要處于沉淀中。將包涵體以2M尿素濃度的包涵體洗滌液（1 XPBS， 2M脲，0. 5% TritonX-100，lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗滌后，目的蛋白純度達85%以上。將洗 滌后的沉淀用6M鹽酸胍（1XPBS，6M鹽酸胍，pH8.0)溶解后進行梯度透析復(fù)性，復(fù)性后將 蛋白濃縮并測定蛋白濃度并用Western Blot分析其免疫原性(見附圖2, 3,圖2, Μ :蛋白分 子質(zhì)量標準；1 :〇. 2 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后沉淀；2 :0. 6 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后沉淀；3 :1. 0 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后沉淀；4 :重組子未誘導(dǎo)全菌對照；5 :0. 2 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后上清；6 :0. 6 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后上清；7 :1. 0 mM IPTG誘導(dǎo)破菌后上清；圖3,圖A，M :marker ;1 :蛋白 復(fù)性與濃縮后上清；2 :洗滌后未溶解包涵體；圖B，1 :一抗為免疫羊陽性血清；2 : -抗為陰 性血清)。
[0021 ] 當(dāng)然，也可以使用其他方法制備得到的布魯氏菌重組膜蛋白omp31，或直接購買純 化的布魯氏菌重組膜蛋白〇mp31。
[0022] 制備重組膜蛋白omp31的單克隆抗體 1.小鼠免疫 1) 選擇6周齡的純系雌性BALB/c小鼠，用純化的重組omp31蛋白作為免疫抗原免疫小 鼠，將omp31蛋白與等體積的弗氏完全佐劑（CFA)乳化后，背部或腹腔皮下多點注射； 2) 初次免疫后2周將純化的omp31與等體積的弗氏不完全佐劑（IFA)乳化后，背部或 腹腔皮下多點注射； 3) 2周后，小鼠尾部取血，離心獲得血清將血清倍比稀釋采用間接-ELISA方法測效價， 效價需不低于1 :51200 ; 4) 融合前三天，腹腔注射omp31蛋白； 三次免疫抗原的量分別為1〇〇 μ g/鼠、50 μ g/鼠、50 μ g/鼠。
[0023] 2.細胞融合 斷頸處死上述免疫好的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞按 5:1在50% PEG4000融合劑下融合，融合后以HAT選擇培養(yǎng)基鋪板置于37°C 5%C02培養(yǎng)。
[0024] 3.陽性克隆篩選及克隆 利用純化的重組〇mp31蛋白以間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞株，將陽性孔擴大 培養(yǎng)后，用有限稀釋法進行細胞克隆，經(jīng)過三次克隆獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗〇mp31蛋 白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株〇mp31-2D2。
[0025] 單克隆抗體的鑒定 1.單克隆抗體的亞類鑒定 參照Hycult Biotechnol公司鼠源抗體分型試劑盒說明書對雜交瘤細胞omp31-2D2進 行鑒定，經(jīng)鑒定〇mp31-2D2重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈。
[0026] 2. Western-Blot 鑒定 按Bio-rad膜蛋白提取試劑盒說明書提取布魯氏菌M5-90疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋 白按1:1加入2XSDS上樣緩沖液，沸水浴中煮5min，12000rpm離心lmin，取上清10 μ 1進 行分離膠12%，濃縮膠5%的SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脫 脂奶粉TBST封閉2h，隨后以各株單抗的細胞上清1:3稀釋孵育lh，TBST洗膜三次，每次 lOmin ;辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG & IgM作為二抗孵育lh，TBST洗膜后發(fā)光顯影。 試驗中以HCV NS3的一株單抗作為陰性對照。試驗結(jié)果顯示omp31-2D2與天然膜蛋白在約 為31KDa處有一明顯條帶，而陰性對照HCV NS3的單抗不與膜蛋白反應(yīng)（圖4)。
[0027] Peptide-ELISA鑒定單克隆抗體omp31_2D2抗原識別表位 根據(jù)pET-30a-〇mp31測序結(jié)果設(shè)計并合成了 27條重疊肽，長度11?16個氨基酸， 每兩條多肽之間重疊7個氨基酸(包括所有< 8個氨基酸殘基的表位）（表1)。重組蛋白 omp31以及27條重疊多肽0MP31 (P01-P27)每條多肽終濃度5 μ g/ml，每孔100 μ 1包被過 夜；洗滌液PBST洗滌4次后，以PBS+4%BSA，每孔200 μ 1 37°C封閉一小時；洗滌液洗滌4次 后，以50 μ 1各單克隆抗體株細胞上清+50 μ 1抗體稀釋液（PBST+1%BSA)為一抗37°C孵育 45min ;洗滌液洗滌6次后，1:10000抗體稀釋液稀釋的HRP標記羊抗鼠 IgG+IgM為二抗，每 孔100μ 1，37°C孵育30min ;洗滌液洗滌6次后，加入ΤΜΒ-Η202，每孔100μ 1避光顯色10min， 每孔50μ1 2M H2S0^S止反應(yīng)。測量450nm波長下每孔的光密度（0D)。以雜交瘤細胞SP2/0 細胞上清作為抗體對照，以重組蛋白〇mp31作為抗原對照。以待測孔0D450nm彡2. 1倍陰 性對照0D450nm判為陽性。經(jīng)過測定，單抗omp31-2D2和P06特異性反應(yīng)。
[0028] 表1.重疊 7個氨基酸的合成多肽 Peplide Sequence PCbn KKQ ID KO; Fill ΙΙ·Λ?ΛΛΜ M2 1 FCI2 LASIAAXfF：YrSAMAA0 6-21 2 ?ΠΒ I'SAMAADVVVHHPSAF 15*30 3 PCM VSHPSAFrAAmyrFS 24-39 4 P05 /Wn-l.yrFSWTC.iGYlGK 33-48 5 mm ?κ?γκηκΑ--ΥΛ?Κ?κψκ 4247 e IH)7 YAOCIKFKIIPFSSFDKE 51-66 7 130S FHSFDKKDNl^QVSGSL 6CK75 li P09 EyVSGSUWTAGGFVG 69-M 9 Is 10 l；'\<Ki!-:\XiCn-Q.\GYN\VQ 7K?93 10 Ι?Ι QA(l^^NWQI J)XG V\1 XiA K7^102 II 1?2 KCiVVIXIAKTl)F(JCiS^V 96*111 12 IJI3 DF^CtSSVTGSISAGAK 105-120 13 PI4 SlSAik\m-LEQKAETK 114-129 14 P15 ECjKAHTRVHWFCillliA 123-08 15 F16 \VFCrr\'RARl.iiYl1AlT：R 132?14? 16 PI7 GY 丁ATERLM'TGTOOL 141-156 17 HH VYCri'OCiLAYClKVKSAf 150165 IX P19 CiK\?KSAFKLXjDDASAI., 159-174 19 P20 ODDAMUrrWSDKTKA K泰 IS3 20 P2I WSDKTK...UiWTI-XL.W-L 訊 177^192 21 P22 11..,a:\(i.\iiY,\KXXWTL 186-20! 22 P23 iKSKwnKmiYixrm, 195*210 23 ￥24 KYLYTDIXIKRXI.VDVD 204-219 24 P2$ RXI.VOX ONSFLHXKVN 213?22X 25 Ρ2? FLESK^'KFirrVRVCiLN 222-137 26 ls27 1?ΚΥ(ι1Λ"ΥΚΙ:， 231-240 27 ELI Spot檢測分泌IFN- γ T細胞水平 于羊免疫M5-90減毒活疫苗前與免疫后1，2, 2. 5個月使用多肽刺激羊PBMC檢測分泌 IFN-γ的細胞數(shù)量，以反映對應(yīng)時間的T細胞反應(yīng)應(yīng)答水平。步驟如下： ⑴包板：取〇.5mg/ml bIFN-γ- I 150ul以滅菌的PBS稀釋至10ml;將ELISpot板 取出，以50ul/孔70%乙醇孵育2min，倒掉；以滅菌水200ul/孔洗滌5次；lOOul/孔抗體 稀釋液，4°C冰箱過夜。
[0029] (2)封閉：去除包被液，滅菌的PBS洗滌5次；200ul/孔R10細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37°C， 5% C02 孵育 lh。
[0030] (3)外周血單核細胞分離及細胞鋪板：肝素鈉抗凝管頸靜脈采血20ml，將新鮮采 集的血液以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋一倍，于5個15ml離心管中分別加入4ml人淋巴細胞分 離液，沿著管壁緩慢加入8ml稀釋后的血液，805 X g離心40min，吸取白膜層合至一新15ml 離心管中，加入適量RPMI-1640培養(yǎng)基，400Xg離心6min。離心后以適量RM10重懸，細胞 計數(shù)后將細胞稀釋至4X106 cells/ml,按照每孔50μ 1加入板內(nèi)，然后將濃度為20μ g/ml 肽池或多肽稀釋液按照每孔50 μ 1加入孔內(nèi)，不混勻不震蕩，直接放于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37°C， 5% C02培養(yǎng)18h，期間嚴禁移動。
[0031] (4)檢測抗體孵育與顯色：倒掉板內(nèi)的細胞，并以200 μ 1/well PBS洗滌5次；取 0.5mg/ml PAN-BIOTIN 5ul 稀釋至 10ml ,ΙΟΟμΙ/well 37°C孵育2h;PBS洗滌5次，以PBS 1:1000 稀釋 Streptavidin-ALP 100ul/well，37°C孵育 lh;PBS 洗漆 5 次，ΙΟΟμΙ/well BCIP/NBT plus 37°C顯色15min或者至BCIP/NBT plus變色；純水終止反應(yīng)并晾干。
[0032] (5)讀數(shù)和質(zhì)控：使用C. T. L公司的Immunospot S5 analyzer進行斑點的讀取， 計數(shù)和質(zhì)控；無細胞孔斑點數(shù)必須為零，否則重做；計數(shù)時通過Gating嚴格控制多肽空白 對照孔的斑點數(shù)不超過50 SFC/1 million cell，以去除一些非特異性斑點；將所得斑點數(shù) 進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為1〇〇萬PBMC中斑點數(shù)，匯總分析。
[0033] 間接免疫熒光試驗鑒定單克隆抗體omp31-2D2與感染帶有omp31基因慢病毒的 293FT細胞反應(yīng) 感染帶有〇mp31基因慢病毒的293FT細胞于96孔板中培養(yǎng)16小時后，棄原培養(yǎng)基， 每孔100ul 4°C預(yù)冷的100%甲醇，于-20°C固定20min。棄甲醇，每孔100ul IF Buffer (0.01M ρΗ7·4 PBS+l%BSA+2.5 mM EDTA)，室溫孵育 1 h。棄 IF Buffer，以 50μ1 omp31-2D2 單克隆抗體株細胞上清+50 μ 1抗體稀釋液（PBST+1%BSA)為一抗4°C孵育過夜。PBS洗滌4 遍后，1 :1000抗體稀釋液稀釋的熒光素標記羊抗鼠 IgG+IgM每孔100ul，37°C孵育1 h ;PBS 洗滌4遍后熒光顯微鏡下觀察。
[0034] 酶免疫染色試驗鑒定單克隆抗體omp31-2D2與羊種布魯氏菌菌涂片反應(yīng) 3%過氧化氫處理菌涂片，0. 01M PH7. 4 PBS洗滌后滴加50ul omp31-2D2單克隆抗體 株細胞上清，37°C孵育1 h。PBS洗滌后滴加 PBS1:10000稀釋的HRP標記羊抗鼠 IgG+IgM 50ul，37°C孵育45min。PBS洗滌后，滴加50ul DAB-H202，避光顯色15min，純水終止反應(yīng)；中 性樹膠封片后油鏡下觀察。以菌體膨大，呈黃棕色至棕黑色判定為陽性結(jié)果；不顯色或僅呈 淺黃色判定為陰性。以大腸桿菌菌涂片作為抗原對照，HCV NS3單克隆抗體3E5作為抗體 對照。經(jīng)鑒定，〇mp31-2D2能與羊種布魯氏菌菌涂片反應(yīng)。 〈11〇>南方醫(yī)科大學(xué) 〈120>布魯氏菌omp31抗原表位及其單克隆抗體和應(yīng)用 <130> <160> 27 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 1 Met Lys Ser Val lie Leu Ala Ser lie Ala Ala Met 1 5 10 〈210〉 2 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 2 Leu Ala Ser lie Ala Ala Met Phe Ala Thr Ser Ala Met Ala Ala Asp 15 10 15 〈210〉 3 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 3 Thr Ser Ala Met Ala Ala Asp Val Val Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro 15 10 15 〈210〉 4 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 4 Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val Asp Thr Phe Ser 15 10 15 〈210〉 5 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 5 Ala Pro Val Asp Thr Phe Ser Trp Thr Gly Gly Tyr lie Gly lie Asn 15 10 15 〈210〉 6 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 6 Gly Gly Tyr lie Gly lie Asn Ala Gly Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Lys 15 10 15 〈210〉 7 <211> 16 〈212> PRT 〈213>人工序列 <400> 7 Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu 15 10 15 〈210〉 8 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 8 Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu Asp Asn Glu Gin Val Ser Gly Ser Leu 15 10 15 〈210〉 9 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 9 Glu Gin Val Ser Gly Ser Leu Asp Val Thr Ala Gly Gly Phe Val Gly 15 10 15 〈210〉 10 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 10 Thr Ala Gly Gly Phe Val Gly Gly Val Gin Ala Gly Tyr Asn Trp Gin 15 10 15 〈210〉 11 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 11 Gin Ala Gly Tyr Asn Trp Gin Leu Asp Asn Gly Val Val Leu Gly Ala 15 10 15 〈210〉 12 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 12 Asn Gly Val Val Leu Gly Ala Glu Thr Asp Phe Gin Gly Ser Ser Val 15 10 15 〈210〉 13 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 13 Asp Phe Gin Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser lie Ser Ala Gly Ala Ser 15 10 15 <210> 14 〈211〉 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 14 Ser lie Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys 15 10 15 〈210〉 15 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 15 Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys Val Glu Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala 15 10 15 〈210〉 16 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 16 Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala Arg Leu Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg 15 10 15 〈210〉 17 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 17 Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg Leu Met Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu 15 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 18 Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Lys Val Lys Ser Ala Phe 15 10 15 〈210〉 19 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 19 Gly Lys Val Lys Ser Ala Phe Asn Leu Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 15 10 15 〈210〉 20 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 20 Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp Lys Thr Lys Ala 15 10 15 〈210〉 21 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 <400> 21 Trp Ser Asp Lys Thr Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu 15 10 15 〈210〉 22 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 22 Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala lie Asn Asn Asn Trp Thr Leu 15 10 15 〈210〉 23 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 23 lie Asn Asn Asn Trp Thr Leu Lys Ser Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu 15 10 15 〈210〉 24 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 24 Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu Gly Lys Arg Asn Leu Val Asp Val Asp 15 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT 〈213>人工序列 <400> 25 Arg Asn Leu Val Asp Val Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ser Lys Val Asn 15 10 15 〈210〉 26 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 26 Phe Leu Glu Ser Lys Val Asn Phe His Thr Val Arg Val Gly Leu Asn 15 10 15 〈210〉 27 〈211〉 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 27 Thr Val Arg Val Gly Leu Asn Tyr Lys Phe 1 5 10
【權(quán)利要求】
1. 布魯氏菌〇mp31蛋白抗原表位，其序列為GGYIGINAGYAGGKFK ( SEQ ID N0:6)。
2. 權(quán)利要求1所述布魯氏菌omp31蛋白T細胞表位在制備布魯氏菌病診斷試劑或治療 藥物中的應(yīng)用。
3. 抗布魯氏菌omp31蛋白的單克隆抗體，其制備方法為： 1) 將權(quán)利要求1所述的布魯氏菌〇mp31蛋白T細胞表位免疫動物； 2) 取經(jīng)免疫的動物脾細胞與瘤細胞融合，得到可穩(wěn)定分泌抗布魯氏菌omp31蛋白的雜 交瘤細胞； 3) 收集、純化雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，即為抗布魯氏菌omp31蛋白的單克隆抗 體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗布魯氏菌omp31蛋白的單克隆抗體，其特征在于：所述單 克隆抗體的重鏈為IgM、輕鏈為κ鏈，該單克隆抗體能與權(quán)利要求1所述的布魯氏菌 omp31 蛋白T細胞表位特異性結(jié)合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗布魯氏菌omp31蛋白的單克隆抗體，其特征在于：產(chǎn)生免 疫反應(yīng)的動物的血清間接ELISA效價不低于1 :51200。
6. 權(quán)利要求3?5任一項所述的單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病試劑 或藥物中的應(yīng)用。
7. 穩(wěn)定分泌權(quán)利要求3?5任一項所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
8. 分泌權(quán)利要求3?5任一項所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株omp31-2D2。
【文檔編號】C07K14/23GK104086634SQ201410259448
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王文敬, 吳靜波, 廖卿宇, 黎誠耀 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)