一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，包括以下步驟：(1)除去海鱸魚加工副產(chǎn)物中的雜蛋白及雜質(zhì)，并打開膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)；(2)加酸提取預(yù)處理后海鱸魚加工副產(chǎn)物中的膠原蛋白，冷凍干燥后得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解制備膠原蛋白肽的底物；(3)加水制成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進(jìn)行酶解，將膠原蛋白轉(zhuǎn)化成膠原蛋白肽；(4)滅酶，冷卻；(5)脫腥脫色；(6)離心，取上清液；(7)通過膜分離截留上清液中分子量1000~3000Da的膠原蛋白肽組分；(8)將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；(9)凍干成粉末。該方法是由酶法結(jié)合膜分離技術(shù)從海鱸魚加工副產(chǎn)物中制備具有傷口愈合作用的高活性的生物活性肽。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物活性肽的制備方法，尤其涉及一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈 合活性的海洋膠原蛋白肽的方法。 一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的 方法

【背景技術(shù)】
[0002] 海S盧魚(學(xué)名又稱七星S盧、花S盧，為福鰭魚綱S盧形目真 鱸科花鱸屬，分布于西太平洋，是廣東省產(chǎn)量最大的海洋經(jīng)濟(jì)魚。海鱸魚在加工過程中會(huì) 產(chǎn)生大量魚頭、魚骨和魚皮等副產(chǎn)物，通常丟棄或者加工成動(dòng)物飼料，既污染了環(huán)境又浪費(fèi) 了資源。Nagai等發(fā)現(xiàn)海鱸的魚皮、魚骨和魚鰭中膠原蛋白的含量分別為51. 4%、40. 7%和 41.6% (以干基計(jì))。膠原蛋白由于其三股螺旋結(jié)構(gòu)性質(zhì)比較穩(wěn)定，進(jìn)入人體小腸后吸收率 很低；但是降解為膠原蛋白肽以后吸收率可高達(dá)90%。因此，從魚加工副產(chǎn)物中制備生物活 性肽已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。已有報(bào)道采用木瓜蛋白酶水解魚皮明膠制備抗氧化肽，Zhuang等 采用堿性蛋白酶水解海蜇膠原蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。然而，從魚加工副產(chǎn)物 中制備具有傷口愈合作用生物活性肽的研究還很少。
[0003] 目前，針對(duì)創(chuàng)傷患者專用型臨床營(yíng)養(yǎng)品在市場(chǎng)上非常缺乏，急需開發(fā)有助于傷口 愈合的功能配料。成纖維細(xì)胞是非常重要的創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞，在傷口愈合過程中參與肉芽組 織形成，合成并分泌膠原、纖維連接蛋白和透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)來參與皮膚組織重塑過 程。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽 的方法，該方法是由酶法結(jié)合膜分離技術(shù)從海鱸魚加工副產(chǎn)物中制備具有傷口愈合作用的 高活性的生物活性肽，可以解決現(xiàn)有海鱸魚加工副產(chǎn)物浪費(fèi)得不到合理利用以及創(chuàng)傷患者 專用臨床營(yíng)養(yǎng)品配料缺乏的問題。
[0006] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈 合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，包括以下步驟： (1) 預(yù)處理：將海鱸魚加工副產(chǎn)物洗凈絞碎，依次經(jīng)堿性溶液脫雜蛋白、酸脫鈣和脫脂 處理，除去雜蛋白及雜質(zhì)，并打開膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，便于酶解； (2) 膠原蛋白的提取：加酸提取預(yù)處理后海鱸魚加工副產(chǎn)物中的膠原蛋白，冷凍干燥 后得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解制備膠原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水制成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進(jìn)行酶解，將膠原蛋白轉(zhuǎn)化成膠 原蛋白膚； (4) 滅酶：對(duì)得到的酶解液進(jìn)行滅酶，冷卻； (5) 脫腥脫色：向滅酶后的酶解液中加入適量活性炭，以脫腥脫色； (6) 離心：將脫腥脫色后的酶解液離心，取上清液； (7) 膜分離：通過膜分離截留上清液中分子量100(T3000Da的膠原蛋白肽組分； (8) 濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，便于凍干； (9) 凍干：將濃縮后上清液冷凍干燥成粉末，即為成品，于干燥條件下貯存起來。
[0007] 以海鱸魚加工副產(chǎn)物為原料，其中必存在雜蛋白、鈣、油脂等雜質(zhì)，這必會(huì)影響膠 原蛋白的純度，因而在提取膠原蛋白前必須去除上述雜質(zhì)。雜蛋白能溶解于堿性溶液中，因 此在預(yù)處理中采用堿性溶液對(duì)海鱸魚加工副產(chǎn)物進(jìn)行處理，將雜蛋白溶解除去，然后在脫 鈣脫脂。在堿性溶液對(duì)海鱸魚加工副產(chǎn)物溶解雜蛋白的同時(shí)，由于堿性溶液的水解作用，使 得膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)被打開，有利于提高后續(xù)酶解效果。
[0008] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中具體處理步驟為：往海鱸魚加工副產(chǎn)物中添加其質(zhì)量 15~20倍的0. lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡15~30h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用 其質(zhì)量15~20倍的0. 6mol/L的鹽酸浸泡15~30h以脫鈣；用蒸餾水洗至中性，最后用其質(zhì)量 2?3倍的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反復(fù)兩次，共脫脂4(T48h。
[0009] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中具體處理步驟為：脫脂完成后，海鱸魚加工副產(chǎn)物經(jīng)蒸 餾水洗滌，浙干，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min離心15?20min 后取上清，冷凍干燥后，以海鱸魚加工副產(chǎn)物的干重計(jì)，膠原蛋白得率為10-22%。
[0010] 進(jìn)一步地，所述步驟⑶中膠原蛋白溶液的質(zhì)量體積濃度為1〇%，所用蛋白酶為堿 性蛋白酶。堿性蛋白酶的酶解條件是：酶添加量為底物重量的2~3%、酶解溫度45飛0°C、酶 解時(shí)間2?4h和pH值8. 5?9. 5,在此條件下膠原蛋白肽提取率為4(Γ48. 6%。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟（4)中，滅酶操作是：9(T95°C水浴加熱l(Tl5min滅酶。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟（5)中脫腥脫色條件為：加入膠原蛋白重量4~6%的活性炭， 45°C 水浴加熱 40-50min。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟（6)中的具體操作為：4000?4500r/min離心15?20min。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟（7)中的具體操作為：依次采用3000Da和lOOODa的超濾膜截 留離心后的上清液，分離得到100(T3000Da的膠原蛋白肽組分。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟（8)中的具體操作為：將分離得到的膠原蛋白肽組分于50°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20-30min。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟（9)中的具體操作為：-80至-20°C冷凍干燥4(T48h即可得海 鱸魚膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0017] 本發(fā)明所得的海鱸魚膠原蛋白肽產(chǎn)品含苯丙氨酸20~50μ g/100mg，甘氨酸 30?50 μ g/100mg，賴氨酸 10?20 μ g/100mg。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果： (1)本發(fā)明以成纖維細(xì)胞增殖活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選采用堿性蛋白酶結(jié)合膜分 離技術(shù)來制備具有傷口愈合作用的生物活性肽，分子量在1000-3000Da，含苯丙氨酸 20?50 μ g/100mg，甘氨酸30?50 μ g/100mg，賴氨酸10?20 μ g/100mg，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該 生物活性肽可以增加傷口組織的羥脯氨酸含量和促進(jìn)傷口愈合，因此可用作創(chuàng)傷患者專用 臨床營(yíng)養(yǎng)品的配料。
[0019] 本發(fā)明制備的海鱸魚膠原蛋白肽促進(jìn)傷口愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、試驗(yàn)條件 1. 1樣品 本發(fā)明制備的海鱸魚膠原蛋白肽粉末（SBCP )。
[0020] 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，雄性，體重18-22g，SPF級(jí)，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0021] 1.3分組及處理 (1)分組 KM小鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，每組18只，包括對(duì)照組（Control)和3 個(gè)SBCP劑量組。SBCP低劑量組（Low)給藥濃度為0. 2g/ kg*bw，SBCP中劑量組（Moderate) 給藥濃度為0.66 g/ kg*bw，高劑量組（High)給藥濃度為2.0 g/ kg*bw。
[0022] (2)處理 每日除了飼喂各組小鼠2 g/10g*bw基礎(chǔ)飼料，還需在上午11 :00灌胃相應(yīng)的藥物，灌 胃體積為200yl/10g*bw。對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。分別在第5、9、15天各組隨機(jī) 挑選6只小鼠拉頸處死。
[0023] 1. 4數(shù)據(jù)分析 采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0024] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2. 1海鱸魚膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚傷口愈合率的影響如表1和圖1所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 預(yù)處理：將海鱸魚加工副產(chǎn)物洗凈絞碎，依次經(jīng)堿性溶液脫雜蛋白、酸脫鈣和脫脂 處理，除去雜蛋白及雜質(zhì)，并打開膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，便于酶解； (2) 膠原蛋白的提?。杭铀崽崛☆A(yù)處理后海鱸魚加工副產(chǎn)物中的膠原蛋白，冷凍干燥 后得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解制備膠原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水制成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進(jìn)行酶解，將膠原蛋白轉(zhuǎn)化成膠 原蛋白膚； (4) 滅酶：對(duì)得到的酶解液進(jìn)行滅酶，冷卻； (5) 脫腥脫色：向滅酶后的酶解液中加入適量活性炭，以脫腥脫色； (6) 離心：將脫腥脫色后的酶解液離心，取上清液； (7) 膜分離：通過膜分離截留上清液中分子量100(T3000Da的膠原蛋白肽組分； (8) 濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，便于凍干； (9) 凍干：將濃縮后上清液冷凍干燥成粉末，即為成品，于干燥條件下貯存起來。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（1)中具體處理步驟為：往海鱸魚加工副產(chǎn)物中添加其質(zhì)量15~20倍 的0. lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡15~30h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用其質(zhì)量 15~20倍的0. 6mol/L的鹽酸浸泡15~30h以脫鈣；用蒸餾水洗至中性，最后用其質(zhì)量2~3倍 的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反復(fù)兩次，共脫脂4(T48h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（2)中具體處理步驟為：脫脂完成后，海鱸魚加工副產(chǎn)物經(jīng)蒸餾水洗 滌，浙干，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min離心15?20min后取上 清，冷凍干燥后，以海鱸魚加工副產(chǎn)物的干重計(jì)，膠原蛋白得率為10-22%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（3)中膠原蛋白溶液的質(zhì)量體積濃度為10%，所用蛋白酶為堿性蛋白 酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方 法，其特征在于，所述堿性蛋白酶的酶解條件是：酶添加量為底物重量的2~3%，酶解溫度 45?50°C，酶解時(shí)間2?4h和pH值8. 5?9. 5,所得膠原蛋白肽提取率為4(Γ48. 6%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（4)中，滅酶操作是：9(T95°C水浴加熱l(Tl5min滅酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（5)中脫腥脫色條件為：加入膠原蛋白重量4~6%的活性炭，45°C水浴 加熱 40_50min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（7)中的具體操作為：依次采用3000Da和lOOODa的超濾膜截留離心 后的上清液，分離得到l〇〇(T3000Da的膠原蛋白肽組分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步驟（6)中的具體操作為：400(T4500r/min離心15?20min ;所述步驟（8) 中的具體操作為：將分離得到的膠原蛋白肽組分于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20-30min ;所述步驟（9) 中的具體操作為：_80至_20°C冷凍干燥4(T48h即得海鱸魚膠原蛋白肽產(chǎn)品。
10.由上權(quán)利要求1、任一項(xiàng)所述的酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠 原蛋白肽的方法制備的海洋膠原蛋白肽，其特征在于，所得的海鱸魚膠原蛋白肽的分 子量為100(T3000Da，含苯丙氨酸2(Γ50 μ g/100mg，甘氨酸3(Γ50 μ g/100mg，賴氨酸 10?20 μ g/100mg。
【文檔編號(hào)】C07K14/78GK104109705SQ201410274645
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】劉磊, 張名位, 魏振承, 張瑞芬, 鄧媛元, 唐小俊, 池建偉, 李健雄 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 廣東寶桑園健康食品有限公司, 廣州力衡臨床營(yíng)養(yǎng)品有限公司