一種動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)菌素及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)菌素及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。本發(fā)明提供的雙歧桿菌細(xì)菌素，是發(fā)酵動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium?animals)BB04?CGMCC?№.7790，得到的細(xì)菌素。本發(fā)明提供了動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium?animals)BB04?CGMCC?No.7790代謝產(chǎn)細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)條件。本發(fā)明還提供了動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)菌素的提取純化方法，即通過pH值吸附解吸法粗提，陽(yáng)離子交換樹脂層析及凝膠過濾層析純化得到細(xì)菌素純品。本發(fā)明所提供的雙歧桿菌細(xì)菌素分子量為1198.6832Da，是一種新型雙歧桿菌細(xì)菌素，具有非常良好的食品加工特性，抑菌譜廣，安全性高，可用于天然食品生物防腐劑的開發(fā)。
【專利說明】一種動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)菌素及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)菌素及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株，屬于食品生 物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物與人類健康密切相關(guān)，常常自然存在于食品或被有意識(shí) 地引進(jìn)食品產(chǎn)品中，從而使食品擁有人們渴望的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)及安全性。乳酸菌活性代謝產(chǎn)物 主要涉及乳酸、細(xì)菌素、胞外多糖、共軛亞油酸等。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中通 過核糖體機(jī)制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi) 可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為天然食品生物防腐劑研究與開 發(fā)的熱點(diǎn)。
[0003] 幾乎每個(gè)乳酸菌屬菌株都可以產(chǎn)生細(xì)菌素，目前已報(bào)道的乳酸菌細(xì)菌素已有40 余種。雙歧桿菌（Bifidobacterium spp.)是寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的典型有益乳酸菌， 它可以對(duì)宿主發(fā)揮生物屏障、營(yíng)養(yǎng)、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，極少 數(shù)雙歧桿菌屬菌株也可產(chǎn)生細(xì)菌素，如兩歧雙歧桿菌（B. bifidum)NCFB1454、嗜熱雙歧桿菌 (B. thermophilum)RBL67、嬰兒雙歧桿菌（B. infants) BCRC14602 等。
[0004] 雙歧桿菌是人體腸道健康的重要指標(biāo)，在食品工業(yè)中也占有重要地位，其所產(chǎn)細(xì) 菌素也越來越受到人們的重視，必將成為天然生物防腐劑的開發(fā)熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株具有廣譜抑菌效果的產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌。
[0006] 本發(fā)明所提供的雙歧桿菌，是動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animals)BB04,已 于2013年06月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC， 地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏登記號(hào)為： CGMCC N〇 . 7790 〇
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種雙歧桿菌細(xì)菌素及其生產(chǎn)方法。
[0008] 本發(fā)明所提供的生產(chǎn)雙歧桿菌細(xì)菌素的方法，是發(fā)酵動(dòng)物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790 得到的細(xì)菌素。
[0009] 所述方法中，用于培養(yǎng)動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns . 7790的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為40. 4h，培養(yǎng)基起始pH值優(yōu)選為6. 94,培養(yǎng)溫度優(yōu)選為34. 5°C。 [0010] 所述方法中，得到的細(xì)菌素可按照以下步驟進(jìn)行提取純化：采用pH吸附解吸法從 發(fā)酵液中提取細(xì)菌素，吸附pH值為2. 0-3. 0,解吸pH值為5. 0-7. 0,得到細(xì)菌素粗品；進(jìn)一 步通過陽(yáng)離子交換樹脂層析及凝膠過濾層析純化，并經(jīng)冷凍干燥得到細(xì)菌素純品。
[0011] 其中，上述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值為3. 0,最佳解吸pH值為6. 0。
[0012] 上述陽(yáng)離子交換樹脂層析以SP Sepharose Fast Flow為填料，用ρΗ5· 5,含0-1M NaCl的0. 02Μ醋酸緩沖液在130min內(nèi)進(jìn)行線性梯度洗脫，流速1. OmL/min，收集保留時(shí)間 為40-48min的蛋白峰為細(xì)菌素活性峰。
[0013] 上述凝膠過濾層析以Sephadex G-10為填料，用ρΗ6· 0,0· 02mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行 洗脫，流速0. 5mL/min，收集保留時(shí)間為34-48min的蛋白峰為細(xì)菌素活性峰。
[0014] 上述提取純化所得細(xì)菌素分子量為1198. 6832Da。
[0015] 上述方法得到的雙歧桿菌細(xì)菌素也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明的動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790 是一種產(chǎn) 細(xì)菌素的動(dòng)物雙歧桿菌，該細(xì)菌素是一種新型雙歧桿菌細(xì)菌素，其具有非常良好的食品加 工特性，抑菌譜廣，安全性高，可用于天然食品生物防腐劑或微生態(tài)制劑的開發(fā)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為不同pH值條件下細(xì)菌素對(duì)產(chǎn)生菌細(xì)胞的吸附率圖。
[0018] 圖2為細(xì)菌素的陽(yáng)離子交換樹脂層析洗脫曲線圖。
[0019] 圖3為細(xì)菌素的凝膠過濾層析洗脫曲線圖。
[0020] 圖4為細(xì)菌素的MALDI-TOF MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。應(yīng)理解，這些實(shí)施僅 用于說明本發(fā)明而不僅限于本發(fā)明。
[0022] 實(shí)施例 1、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns . 7790 的分離 和鑒定
[0023] 1、菌株的篩選
[0024] 無菌稱取母乳嬰兒糞便25g，迅速放入225mL生理鹽水中，再將其10倍梯度稀釋 至活菌數(shù)K^-K^cfu/mL，然后吸取0. 2mL進(jìn)行亨蓋特厭氧滾管，放于37°C恒溫箱培養(yǎng) 48-72h，然后挑選菌落特征為光滑、凸圓、邊緣整齊、乳白色或微帶黃色、質(zhì)地柔軟的中小菌 落接種于改良MRS液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24-48h，進(jìn)行革蘭氏染色。挑選革蘭氏染色觀察有 雙歧桿菌形態(tài)特征的、周圍有透明圈、邊緣光滑整齊、白色或微黃色的菌落接種于改良MRS 培養(yǎng)基，分別在有氧和厭氧環(huán)境下于37°C培養(yǎng)24h，同時(shí)進(jìn)行Κ0Η、過氧化氫酶、吲哚、代謝 葡萄糖等試驗(yàn)。選取厭氧條件生長(zhǎng)、有氧條件不生長(zhǎng)、Κ0Η試驗(yàn)陰性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性、 吲哚試驗(yàn)陰性、能代謝葡萄糖但不產(chǎn)氣的菌初步確定為篩選出的雙歧桿菌。采用牛津杯瓊 脂平板擴(kuò)散法，以腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis) 13076和單核細(xì)胞增生李斯特 菌（Listeria monocytogenes) 54002 (l/2a)為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選得到具有較強(qiáng)抑 菌活性的菌株為產(chǎn)細(xì)菌素的可疑菌株5株。
[0025] 由于雙歧桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、H202等多種具有抑菌活性的物 質(zhì)，某些雙歧桿菌菌體細(xì)胞對(duì)其他細(xì)菌也可能有拮抗作用，因此需要排除這些干擾后對(duì)產(chǎn) 細(xì)菌素的可疑菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。主要包括：（1)排除有機(jī)酸的干擾：在可疑菌株發(fā)酵上 清液中加入Imol/LNaOH，調(diào)其pH值為6. 5?7左右，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，比較排酸前后的抑菌圈 直徑。（2)排除H202的干擾：用過氧化氫酶于37°C處理發(fā)酵液2h，以未處理發(fā)酵液作對(duì)照 進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，比較抑菌圈直徑差異。（3)排除菌體細(xì)胞的干擾：將發(fā)酵液于4°C，8000rpm 離心10min，取上清液過微孔濾膜（尺寸Φ 25,孔徑0.22 μ m)的細(xì)菌過濾器過濾除去菌體 細(xì)胞對(duì)抑菌實(shí)驗(yàn)的影響。（4)用硫酸銨沉淀法粗提細(xì)菌素后透析除鹽，加入蛋白酶K反應(yīng)， 以確定細(xì)菌素為蛋白類物質(zhì)。將5株可疑菌株的發(fā)酵液排除有機(jī)酸、H202及菌體細(xì)胞干擾 因素影響并經(jīng)硫酸銨沉淀、透析處理后檢測(cè)抑菌活性，發(fā)現(xiàn)僅有菌株BB04仍具有較高抑菌 活性。向透析液中加入蛋白酶K(20U/mL)，37°C作用lh后發(fā)現(xiàn)抑菌活性消失，具體結(jié)果見表 1。綜合以上，選擇菌株BB04作為目標(biāo)菌株。
[0026] 表1不同處理對(duì)菌株BB04發(fā)酵液抑菌活性的影響

【權(quán)利要求】
1. 動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animals) BB04 CGMCC Mj · 7790。
2. -種生產(chǎn)雙歧桿菌細(xì)菌素的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述的動(dòng)物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790,得到的細(xì)菌素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于：所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為40. 4h，培養(yǎng)基起始pH 值優(yōu)選為6. 94,培養(yǎng)溫度優(yōu)選為34. 5 °C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于：所述方法得到的細(xì)菌素按照以下步驟進(jìn) 行純化：采用pH吸附解吸法從發(fā)酵液中提取細(xì)菌素，吸附pH值為2. 0-3. 0,解吸pH值為 5. 0-7. 0,得到細(xì)菌素粗品；進(jìn)一步通過陽(yáng)離子交換樹脂層析及凝膠過濾層析純化，并經(jīng)冷 凍干燥得到細(xì)菌素純品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于：所述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值為3.0， 最佳解吸pH值為6.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于：所述陽(yáng)離子交換樹脂層析以SP S印harose Fast Flow為填料，用pH5. 5,含0-1M NaCl的0. 02M醋酸緩沖液在130min內(nèi)進(jìn)行線性梯度 洗脫，流速1. OmL/min，收集保留時(shí)間為40-48min的蛋白峰為細(xì)菌素活性峰。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于：所述凝膠過濾層析以Sephadex G-10為填 料，用pH6. 0,0. 02mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速0. 5mL/min，收集保留時(shí)間為34-48min 的蛋白峰為細(xì)菌素活性峰。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于：提取純化得到的細(xì)菌素分子量為 1198.6832Da〇
9. 由權(quán)利要求2或3或4中所述方法得到的雙歧桿菌細(xì)菌素。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK104046585SQ201410276113
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】劉國(guó)榮, 任麗, 王成濤, 宋振芹, 蘇航 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)