T淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鵝CD3ε鏈胞外區(qū)單克隆抗體及其在檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。以鵝胸腺cDNA為模板擴(kuò)增得到鵝CD3ε基因，根據(jù)GoCD3ε胞外區(qū)基因特點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增得到鵝CD3ε胞外區(qū)基因(CD3εex)，采用大腸桿菌表達(dá)鵝CD3εex。以含有CD3εex的重組質(zhì)粒為免疫原，免疫BALB/c小鼠，重組蛋白rGoCD3ε加強(qiáng)免疫，獲得1株穩(wěn)定分泌鵝CD3ε鏈胞外區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3C11)。該單克隆抗體能與純化的重組蛋白rGoCD3反應(yīng)，同時(shí)能夠與分離的鵝外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。因此，本發(fā)明的提出為檢測(cè)鵝中CD3+T淋巴細(xì)胞提供了一種新的、有效的技術(shù)手段。
CGMCC NO. 9228
2014.05.20
【專利說明】鵝CD3 ε鏈胞外區(qū)單克隆抗體及其在檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì) 胞中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其應(yīng)用，特別涉及一種鵝CD3 ε鏈胞外區(qū)單克隆抗 體及其在檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] Τ淋巴細(xì)胞（簡(jiǎn)稱Τ細(xì)胞）是重要的免疫活性細(xì)胞，具有直接介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和 對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答起調(diào)節(jié)性的關(guān)鍵作用。在Τ細(xì)胞的不同發(fā)育階段，細(xì)胞表面表達(dá)不同種類 的受體和表面抗原。Τ細(xì)胞表面抗原生物學(xué)特性的研究是了解Τ細(xì)胞發(fā)育和功能以及鑒定 Τ細(xì)胞亞群的基礎(chǔ)。制備相應(yīng)Τ細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立不同亞群Τ 細(xì)胞的檢測(cè)方法，是研究Τ細(xì)胞表面抗原生物學(xué)特性，及揭示機(jī)體免疫狀態(tài)、機(jī)體針對(duì)不同 抗原免疫應(yīng)答機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。在禽類當(dāng)中，雞Τ淋巴細(xì)胞表面分化抗原的研究近年來進(jìn) 展很快，其中以CD3、CD4和CD8更為突出，它們?cè)讦臣?xì)胞特異性識(shí)別和激活中發(fā)揮著不同的 生物學(xué)作用。
[0003] CD3分子表達(dá)于所有成熟的T細(xì)胞表面，可與T細(xì)胞表面受體（TCR)形成一個(gè)緊 密的、非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合體TCR/CD3，TCR主要起識(shí)別異種抗原和自身抗原的作用，TCR與抗 原-MHC結(jié)合后開始產(chǎn)生活化的信號(hào)，再由CD3分子傳遞到T細(xì)胞內(nèi)，在此過程中，CD3分子 主要起穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)和激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)的作用。早在20世紀(jì)70?80年代， 有很多學(xué)者應(yīng)用多克隆抗體和單克隆抗體在人和動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞的表面對(duì)CD3分子進(jìn)行 了鑒定，在人和鼠為代表的哺乳動(dòng)物研究中，基本可以明確CD3分子的結(jié)構(gòu)和功能。CD3由 五種跨膜蛋白（Y、δ、ε、ζ、η)組成了一個(gè)復(fù)合蛋白，其中γ、δ和ε三條鏈均有一個(gè) 免疫球蛋白的功能區(qū)，有學(xué)者分析它們可能起源于同一基因。1991年，Bernot等克隆得到 雞的第一個(gè)CD3基因，它與哺乳動(dòng)物的CD3分子的γ和δ有很高的同源性，所以將這個(gè)雞 的⑶3基因命名為⑶3γ δ。雞的⑶3γ δ以及ε鏈缺少啟動(dòng)子TATA或者CCAAT，有2kb 的空間內(nèi)含有潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，可在調(diào)節(jié)T細(xì)胞特異性基因的表達(dá)的過程中起重 要作用。Chan等克隆得到日本比目魚⑶3 ε基因，該基因全長(zhǎng)為1006bp，共編碼164個(gè)氨基 酸，分析表明它和已知物種的CD3e鏈相比，最保守的是胞質(zhì)區(qū)而最不保守的是胞外區(qū)。 由于ε鏈在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物間有較高的同源性，所以在非哺乳動(dòng)物CD3的相關(guān)序列 信息能夠利用之前，就有學(xué)者利用抗人CD3 ε抗血清來鑒定不同的哺乳動(dòng)物、禽類和魚類 的⑶3 ε。近幾年，Chan等又克隆得到北京鴨⑶3 ε基因，其全長(zhǎng)為897bp，完整的開放閱 讀框?yàn)?48bp，與雞、人的同源性分別為93%和89%。隨后便開始有許多學(xué)者對(duì)鴨CD3分子 進(jìn)行研究。Kothlow S等對(duì)北京鴨⑶3 ε、⑶4和⑶8 α分子進(jìn)行克隆表達(dá)，這是首次對(duì)鴨 ⑶3 ε、⑶4和⑶8 α進(jìn)行克隆表達(dá)。2009年，李衛(wèi)等克隆得到櫻桃谷鴨的⑶3 ε 0RF基因， 全長(zhǎng)為549bp，編碼183氨基酸，通過ClustalX軟件分析包括北京鴨在內(nèi)的三種鴨的⑶3 ε 氨基酸序列差異，最保守的部位是胞質(zhì)區(qū)，而最不保守的是胞外區(qū)。分析表明CD3e有較低 的遺傳變異性，所以抗CD3 ε抗體可以在不同物種間通用。
[0004] ⑶3分子由五種不同的跨膜蛋白組成，其中γ、δ和ε鏈胞質(zhì)區(qū)有48-81個(gè)的氨 基酸殘基可將抗原識(shí)別信號(hào)傳遞到Τ細(xì)胞內(nèi)；跨膜區(qū)氨基酸一般是帶有負(fù)電荷的谷氨酸或 天冬氨酸殘基，這既有利于Τ細(xì)胞表面受體的α、 〇鏈跨膜區(qū)中帶有正電荷的賴氨酸與精 氨酸之間的相互作用，也利于β和Υ鏈跨膜區(qū)的賴氨酸的相互作用。Υ、δ和ε三條肽 鏈的胞外區(qū)都有一個(gè)含50個(gè)氨基酸殘基的類似免疫球蛋白的功能區(qū)。至今人們對(duì)哺乳動(dòng) 物的CD3蛋白研究較多，尤其是對(duì)多種脊椎動(dòng)物的TCR鏈功能特性的報(bào)道。但對(duì)非哺乳動(dòng) 物的研究較少，目前對(duì)雞⑶3分子的研究只有γ δ、ε和ζ鏈。Υ δ和ζ鏈為糖蛋白，分 子量分別約為19KD和20KD，ε鏈為非糖基化蛋白，分子量約為17KD。雞⑶3γ SmRNA編 碼約為175個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，胞外區(qū)約為81個(gè)氨基酸，親水性跨膜區(qū)約為26個(gè)氨基酸、 胞質(zhì)區(qū)約為44個(gè)氨基酸，據(jù)推測(cè)前24個(gè)氨基酸是雞CD3Y δ分子的信號(hào)肽，并且在胞外區(qū) 有1個(gè)潛在的Ν-糖基化位點(diǎn)。其中CD3 ε或γ鏈基因缺陷可致Τ細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)缺陷。
[0005] ⑶3分子與Τ細(xì)胞表面的抗原受體（T cell rec印tor，TCR)以非共價(jià)鍵相連接，共 同組合成為TCR/CD3復(fù)合物。在抗原的識(shí)別階段，CD3分子具有信號(hào)傳導(dǎo)的作用，其中起著 信號(hào)傳導(dǎo)作用的結(jié)構(gòu)是其各多肽鏈胞質(zhì)區(qū)內(nèi)的免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。此結(jié)構(gòu)可結(jié)合具有兩個(gè)串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的酪 氨酸激酶蛋白，從而引發(fā)Syk家族的酪氨酸激酶蛋白（ζ-associated protein，ZAP_70)的 激活，CD3分子可將此抗原信號(hào)傳到T細(xì)胞的內(nèi)部。CD3蛋白復(fù)合物中ε、γ和δ鏈的胞 質(zhì)區(qū)含有一個(gè)ΙΤΑΜ，ζ亞基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)ΙΤΑΜ，所以⑶3蛋白復(fù)合物共有10個(gè) ΙΤΑΜ，使得CD3復(fù)合物對(duì)抗原及其敏感。TCR/CD3與抗原-MHC復(fù)合物結(jié)合后，產(chǎn)生的胞內(nèi)信 號(hào)可瞬時(shí)提高未受抗原刺激的Τ細(xì)胞中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而引起Τ細(xì)胞的增殖以及 功能性蛋白的暫時(shí)性表達(dá)。另外，該復(fù)合體還參與抗原刺激的信號(hào)傳導(dǎo)，是動(dòng)物體內(nèi)輔助性 Τ 細(xì)胞（helper T cell,Th)和細(xì)胞毒性 Τ 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL)增殖活化 的主要途徑。其中Y和S鏈可能影響復(fù)合物的裝配與表達(dá)，ε和ζ鏈可能介導(dǎo)抗原的 活化信號(hào)，ξ鏈還可介導(dǎo)Τ細(xì)胞表面分子及致有絲分裂原產(chǎn)生的信號(hào)。
[0006] Chen等利用雞CD3分子的單克隆抗體，采用間接免疫熒光技術(shù)分析了雞CD3分子 的發(fā)育與分布，發(fā)現(xiàn)其主要分布在于胸腺細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞和脾細(xì)胞，在法氏囊和骨髓 細(xì)胞表達(dá)的比例很小。Bernot A等利用RNA雜交方法，在10日齡雞胚中檢測(cè)到⑶3陽性 胸腺細(xì)胞，而此時(shí)能被⑶3抗體識(shí)別的抗原只存在于胞質(zhì)內(nèi)，到第12天才在細(xì)胞表面表達(dá)， 因而推測(cè)需要完整的一套TCR/⑶3鏈，⑶3抗原才能夠在細(xì)胞表面表達(dá)。Kushima K等研 究了 6周齡雞外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比例，其中⑶3+T淋巴細(xì)胞比值為76%。外周血中 CD3+T淋巴細(xì)胞在產(chǎn)蛋期或應(yīng)用雌激素后上升，而隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸下降。這些結(jié)果表 明⑶3+T淋巴細(xì)胞受內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。Bertram等利用兔抗人⑶3 ε鏈（氨基酸 156?168)多克隆抗體鑒定了 Τ淋巴細(xì)胞在組織中的分布。Wilkinson等應(yīng)用抗人⑶3單 克隆抗體進(jìn)行了鴨T淋巴細(xì)胞的鑒定。Kothlow S等對(duì)北京鴨⑶3 ε、⑶4和⑶8 α進(jìn)行真 核表達(dá)，制備單克隆抗體，并對(duì)鴨的脾臟、胸腺、法氏囊及外周血液中淋巴細(xì)胞類型進(jìn)行鑒 定。李洪濤等已成年鴨胸腺細(xì)胞為免疫原，獲得了 5株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞， 示蹤單克隆抗體陽性細(xì)胞在鴨免疫器官不同發(fā)育時(shí)期的發(fā)生和分布。
[0007] 但目前鵝CD3 ε鏈基因克隆、表達(dá)及相應(yīng)多克隆、單克隆抗體制備的研究尚屬空 白，這嚴(yán)重制約了水禽基礎(chǔ)免疫理論的發(fā)展，導(dǎo)致無法了解鵝Τ淋巴細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育的規(guī) 律、在機(jī)體免疫防御中的作用，針對(duì)一些給養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的疫病，如何評(píng)價(jià)病原 是否激活T淋巴細(xì)胞、怎樣激活T淋巴細(xì)胞、激活后的T淋巴細(xì)胞發(fā)揮怎樣的作用，并如何 運(yùn)用病原與T淋巴細(xì)胞的免疫功能的關(guān)系指導(dǎo)疾病的診斷、疫苗的研制等工作，從而為科 學(xué)預(yù)防疫病提供理論依據(jù)及物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0008] 本項(xiàng)發(fā)明首次克隆得到鵝⑶3 ε鏈基因，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鵝⑶3 ε鏈胞 外區(qū)基因片段，同時(shí)構(gòu)建鵝CD3 ε鏈胞外區(qū)基因片段的真核表達(dá)載體，以此為免疫原制備 鵝CD3 ε鏈胞外區(qū)的單克隆抗體，初步建立了可檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)和激 光共聚焦方法，為揭示鵝Τ淋巴細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育的規(guī)律、Τ細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Τ細(xì)胞亞群的分 類、Τ細(xì)胞的組織分布、動(dòng)態(tài)變化等研究及其在機(jī)體免疫防御中的作用，提供了理論依據(jù)及 物質(zhì)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種能夠穩(wěn)定分泌抗鵝CD3 ε鏈胞外區(qū) 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及由該雜交瘤細(xì)胞株分泌所產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)鵝外周血中 ⑶3+Τ淋巴細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 本發(fā)明以鵝胸腺cDNA為模板，參照GenBank上發(fā)表的綠頭鴨⑶3 ε基因序列 (登錄號(hào)：AF378704)，利用Primer premier5. 0分子生物學(xué)軟件輔助設(shè)計(jì)了 1對(duì)特異性引 物（⑶3-S和⑶3-A)擴(kuò)增得到鵝⑶3 ε 0RF基因（該基因簡(jiǎn)稱⑶3 ε，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0. 2所示，其所編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO. 1所示），然后根據(jù)Go⑶3 ε胞外區(qū) 基因特點(diǎn)，利用Primer premier5. 0分子生物學(xué)軟件輔助設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（CD3-S-1 和⑶3-A-1)擴(kuò)增得到鵝⑶3 ε胞外區(qū)基因（該基因簡(jiǎn)稱⑶3 ε ex)。然后分別構(gòu)建含有 CD3 ε ex基因的重組真核表達(dá)載體pCDND3. 1-CD3 ε ex和原核表達(dá)載體pET-28a_CD3 ε ex。 采用大腸桿菌R〇settaTM(DE3)pLysS表達(dá)鵝CD3e胞外區(qū)基因得到重組蛋白 rGoCD3。以重 組質(zhì)粒pcDNA3. 1-⑶3 ε ex為免疫原，免疫三次BALB/c小鼠，然后用重組蛋白rGo⑶3 ε進(jìn) 行加強(qiáng)免疫，取BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選獲得1株穩(wěn)定分 泌抗鵝CD3e鏈胞外區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C11，分類命名為抗鵝CD3e胞 外區(qū)單克隆抗體鼠雜交瘤細(xì)胞，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)是：CGMCC N0. 9228,保藏時(shí)間是：2014年5月20日。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明還提出了由保藏號(hào)為CGMCC N0. 9228的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的 鵝CD3e鏈胞外區(qū)單克隆抗體。經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定，雜交瘤細(xì)胞株3C11所產(chǎn)生為單克 隆抗體IgM型。間接ELISA結(jié)果顯示，所述單克隆抗體能與純化的重組鵝⑶3 ε胞外區(qū)蛋 白rG〇CD3反應(yīng)，同時(shí)也能夠與分離的鵝外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。
[0014] 因此，更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗鵝CD3 ε鏈胞外區(qū)單克隆抗體在制 備檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為鵝⑶3 ε基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0016] 圖2為重組質(zhì)粒pEASY-Blunt_CD3 ε的酶切及PCR鑒定；
[0017] A:M.Trans2K Plus II DNA Marker ;1·重組質(zhì)粒 pEASY-Blunt-CD3 ε ;2.BamH I 單切；3. BamH I、Xho I 雙切；B Trans2K DNA Marker ;L PCR 鑒定；2.陰性對(duì)照；
[0018] 圖3為鵝⑶3 ε與其他物種⑶3 ε氨基酸的比對(duì)結(jié)果；
[0019] 圖4為不同禽類和哺乳動(dòng)物CD3 ε氨基酸序列相似性分析結(jié)果；
[0020] 圖5為各物種⑶3 ε的進(jìn)化樹分析；
[0021] 圖6為鵝⑶3 ε的信號(hào)肽預(yù)測(cè)；
[0022] 圖7為鵝⑶3 ε的跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)；
[0023] 圖8為鵝⑶3 ε序列Ν-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析；
[0024] 圖9為鵝⑶3 ε胞外區(qū)基因 PCR產(chǎn)物；
[0025] 1:陰性對(duì)照；2:鵝⑶3 ε胞外區(qū)基因 PCR產(chǎn)物；
[0026] 圖 10 為重組質(zhì)粒 pEASY-Blunt-Simple_CD3 ε ex 的酶切鑒定；
[0027] 1. BamHI 單切；2. Xhol 單切；3. BamHI、XhoI 雙切；Μ· Trans2K Plus II DNA Marker ;
[0028] 圖11為重組質(zhì)粒pET-28a_CD3 ε ex的酶切及PCR鑒定；
[0029] 1. BamH I 單切；2. BamH I、Xho I 雙切；3. PCR 鑒定；
[0030] M. Trans2KPlus II DNAMarker ；
[0031] 圖12為重組⑶3 ε胞外區(qū)蛋白的SDS-PAGE分析；
[0032] Μ·蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)后的pET_28a(+) ;2·誘導(dǎo)前的pET-28a_CD3 ε ex ; 3.誘導(dǎo)后的pET-28a_⑶3 ε ex ;4.菌體超聲上清；5.菌體超聲沉底；6.純化后蛋白；
[0033] 圖13為兔抗鵝⑶3 ε胞外區(qū)多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定；
[0034] 圖14為兔抗鵝⑶3 ε胞外區(qū)多克隆抗體的純化；
[0035] Μ.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前兔抗鵝⑶3胞外區(qū)多抗；2?6 :純化后兔抗鵝 CD3胞外區(qū)多抗；
[0036] 圖15為兔抗鵝⑶3 ε胞外區(qū)多克隆抗體的Western blot鑒定；
[0037] 1.誘導(dǎo)表達(dá)后的pET_28a(+)的空載體對(duì)照；2.純化后的⑶3 ε胞外區(qū)蛋白；
[0038] 圖16為連入真核表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PCR電泳圖；
[0039] 1 :連入真核表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M:Trans2K DNA Marker ;
[0040] 圖17為重組質(zhì)粒pcDND3. 1-CD3 ε ex的酶切鑒定；
[0041] 1. BamHI 單切；2. BamHI、Xhol 雙切；Μ· Trans2K Plus DNAMarker ;
[0042] 圖18為兔抗鵝⑶3 ε胞外區(qū)多克隆抗體的間接免疫熒光鑒定（200X)結(jié)果；
[0043] A. pcDNA3. 1-⑶3 ε ex轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞與純化的兔抗鵝⑶3 ε胞外區(qū)多抗 的間接免疫熒光析；Β.空載體pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒對(duì)照；
[0044] 圖19為雜交瘤細(xì)胞的染色體鑒定；
[0045] Α?Η分別為雜交瘤細(xì)胞株1G1、2C1、3C5、3C11、5Α3、5G2、9F9及S/P20骨髓瘤細(xì)胞 的染色體鑒定；
[0046] 圖20為雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性分析；
[0047] 圖21為抗體亞類ELISA板鑒定結(jié)果；
[0048] 圖22為單抗反應(yīng)性的ELISA鑒定；
[0049] 圖23為鵝⑶3 ε胞外區(qū)單克隆抗體對(duì)鵝⑶ε胞外區(qū)蛋白的Western blot鑒定
[0050] Μ.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)表達(dá)后的pET_28a(+)的空載體對(duì)照；2.純化后的 CD3 ε胞外區(qū)蛋白；A?G分別為雜交瘤細(xì)胞株1G1、2C1、3C5、3C11、5A3、5G2及9F9與鵝 ⑶ε胞外區(qū)蛋白Western blot鑒定
[0051] 圖24為單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定（200 X)
[0052] A-G. pcDNA3. 1-CD3 ε ex 轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞與單抗 1G1、2C1、3C5、3C11、5A3、 5G2和9F9的細(xì)胞上清的間接免疫熒光析；Η.鼠陽性血清對(duì)照；I.鼠陰性血清對(duì)照；J.空 載體pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒對(duì)照
[0053] 圖25為鵝外周血淋巴細(xì)胞⑶3分子的亞細(xì)胞定位（400X);
[0054] A.對(duì)照組PBL DAPI染色；B.對(duì)照組PBL FITC染色；C. A和B合并圖像；D. 3C11 單抗為一抗作用后PBL的DAPI染色；E. 3C11單抗為一抗作用后PBL的FITC染色；F. D和E 合并圖像；
[0055] 圖26為為鵝外周血淋巴細(xì)胞⑶3、⑶4和⑶8分子的亞細(xì)胞定位（400X)
[0056] A.對(duì)照組PBL DAPI染色；B.對(duì)照組PBL TRITC染色；C.對(duì)照組PBL FITC染色 D. A、B和C合并圖像；E. 3C11單抗與⑶4多抗同為一抗作用后PBL的DAPI染色；F. 3C11單 抗與⑶4多抗同為一抗作用后PBL的TRITC染色；G. 3C11單抗與⑶4多抗同為一抗作用后 PBL的FITC染色；Η. E、F和G合并圖像；I. 3C11單抗與⑶8 α多抗同為一抗作用后PBL的 DAPI染色；J. 3C11單抗與⑶8 α多抗同為一抗作用后PBL的TRITC染色；K. 3C11單抗與 ⑶8 α多抗同為一抗作用后PBL的FITC染色；L. I、J和Κ合并圖像；
[0057] 圖27為3C11單克隆抗體FACS分析。
[0058] A. SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的FACS分析；B. 3C11單克隆抗體的FACS分析。

【具體實(shí)施方式】
[0059] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0060] 本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的材料與試劑：
[0061] 1、細(xì)胞及菌株：SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存；克隆載體pEASY-Blunt Cloning Kit及pEASY-Blunt simple Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表 達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)和pET-28a(+)本實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞TG1和Rosetta(DE3)pLysS 均由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。
[0062] 2、試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c小鼠，4-6周齡，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究 所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新西蘭大白兔購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市某養(yǎng)殖場(chǎng)，成年東北白鵝購(gòu)自黑龍 江省哈爾濱市平山某養(yǎng)鵝場(chǎng)。
[0063] 3、試劑
[0064] 3. 1工具酶等：Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Takara寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、 dNTP、DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker、蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker購(gòu)自TaKaRa公司；小量膠回收試劑盒購(gòu)于北京百 泰克生物工程有限公司。
[0065] 3. 2抗體制劑：辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記羊抗鼠 IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗 體、異硫氰熒光素（FITC)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG及羊抗兔IgG抗體、四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠單抗Ig類/ 亞類鑒定試劑盒（C060102)(包括捕獲抗體、抗IgM、IgGl、IgG2b、IgG2a、IgG3、IgA酶標(biāo)二 抗）由洛陽但奧通實(shí)驗(yàn)材料中心研制。
[0066] 3. 3細(xì)胞類試劑：人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；HAT選擇性 培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG和DAPI購(gòu)自SIGMA公司。 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBC0公司；秋水仙素購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；雙抗（青霉 素、鏈霉素）購(gòu)自哈爾濱制藥六廠。
[0067] 實(shí)施例1鵝⑶3 ε胞外區(qū)基因的克隆
[0068] 方法：
[0069] 1、鵝CD3e基因的克隆
[0070] 1. 1引物設(shè)計(jì)
[0071] 參照GenBank上發(fā)表的綠頭鴨CD3 ε基因序列（登錄號(hào)：AF378704)，利用Primer premier5. 0分子生物學(xué)軟件輔助設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（⑶3-S和⑶3-A，表1所示）擴(kuò)增鵝 ⑶3 ε基因，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0072] 表1擴(kuò)增鵝⑶3 ε基因的引物
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 鵝T細(xì)胞表面抗原⑶3 ε鏈，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的鵝T細(xì)胞表面抗原CD3 ε鏈的核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
4. 一種分泌鵝CD3e鏈胞外區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的雜交瘤 細(xì)胞株命名為3C11，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)是： CGMCC No.9228。
5. 由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的鵝CD3e鏈胞外區(qū)單克隆抗體。
6. 權(quán)利要求2所述的鵝CD3e鏈胞外區(qū)單克隆抗體在制備檢測(cè)鵝CD3+T淋巴細(xì)胞試劑 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK104231071SQ201410317401
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】馬波, 張雪蓮, 李洪濤, 高明春, 張文龍, 魏雙施, 王君偉 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)