一種制備單一多肽-Zn（Ⅱ）配合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種制備、分離、篩選單一多肽，并進(jìn)而定向合成一種多肽與微量元素鋅的配合物即單一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，包括溶解、乳化、交聯(lián)、活化、接入配基、螯合Zn2+制備金屬離子親和介質(zhì)等工序，既有理論上的科學(xué)意義，又有很高的實(shí)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白多肽的篩選與純化領(lǐng)域，具體是一種制備單一多肽_Zn( II )配合 物的方法。 -種制備單一多肽-Zn (II)配合物的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 多肽-鋅配合物是一種具有復(fù)合生物活性功能的新型有機(jī)金屬化合物，是多肽配 基與Zn 2+通過(guò)配合作用形成的配位化合物。構(gòu)成該配合物其中一種組分的鋅，作為多種酶 的活化劑和不可缺少的組分，是所有生物系統(tǒng)（包括細(xì)菌、植物、動(dòng)物和人類）必不可少的 微量元素，有"生命元素"之稱，它對(duì)所有細(xì)胞體系內(nèi)的基本細(xì)胞功能有著不可替代的作用 (從酸堿平衡到免疫功能）。機(jī)體缺鋅會(huì)導(dǎo)致多方面的負(fù)面影響，如基礎(chǔ)代謝下降、影響生 長(zhǎng)發(fā)育、蛋白質(zhì)利用率降低和食欲與消化功能低下等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上有17. 3%的人群正處 于缺鋅狀態(tài)。目前常使用氧化鋅、硫酸鋅或葡萄糖酸鋅等無(wú)機(jī)鋅作為人或動(dòng)物機(jī)體的補(bǔ)鋅 齊U。盡管金屬鹽是最常使用的，但它在體內(nèi)的生物利用率低，并可能產(chǎn)生副作用。近年來(lái)的 研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)機(jī)鋅相比，在體內(nèi)氨基酸、多肽類與鋅螯合形成有機(jī)鋅螯合物的生物學(xué)利用 率比無(wú)機(jī)鋅的高，只需攝入微量的有機(jī)鋅就可以達(dá)到良好的補(bǔ)鋅效果，并且可以避免無(wú)機(jī) 鋅在機(jī)體內(nèi)因吸收不良而導(dǎo)致鋅過(guò)量，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)人體和環(huán)境的危害。目前，關(guān)于人工方法 制備多肽并進(jìn)而合成多肽-鋅配合物的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，問(wèn)題是人工方法制備多肽 的成本較高，而且多肽的生物活性較低，甚至沒(méi)有生物活性。從天然產(chǎn)物中制取多肽源于天 然動(dòng)植物，而且活性較高，是多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)發(fā)展方向。
[0003] 在本申請(qǐng)者已獲得的授權(quán)專利（一種鋅-多肽配合物及其制備方法和應(yīng)用 ZL200810028217. 8)中闡述了蛋白酶解多肽與鋅配合形成多肽-鋅復(fù)雜混合物的生物功能 活性及其應(yīng)用，但如何獲得高純度的多肽-鋅配合物仍是尚未解決的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的在于提出一種制備、分離、篩選單一多肽，并進(jìn)而定向合成一種 多肽與微量元素鋅的配合物即單一多肽_Zn( II )配合物的方法，既有理論上的科學(xué)意義， 又有很高的實(shí)用價(jià)值。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明的方案如下：
[0005] 一種制備單一多肽_Zn( II )配合物的方法：
[0006] 首先將金屬鋅離子通過(guò)交聯(lián)和螯合作用固定在高分子載體上，制備出鋅離子親和 層析柱，并通過(guò)層析柱對(duì)水解蛋白多肽的親和作用篩選出鋅離子結(jié)合多肽，然后采用洗脫 劑將親和多肽洗脫下來(lái)，再定向合成單一多肽_Zn( II )配合物。
[0007] 優(yōu)選的，所述的高分子載體為葡聚糖G-25、殼聚糖或瓊脂糖。
[0008] 優(yōu)選的，制備鋅離子親和層析柱包括以下步驟：
[0009] 溶解：稱取高分子載體，加入到質(zhì)量百分比1%的乙酸溶液中，攪拌并微波處理， 直至全溶解，獲得質(zhì)量百分比1. 5 %的高分子溶液；
[0010] 乳化作用：在高分子溶液中加入乳化劑，恒溫水浴溫度50-55°C，以450rpm的速度 連續(xù)攪拌1. Oh ;
[0011] 交聯(lián)作用：取質(zhì)量百分比50%的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L的NaOH 溶液，繼續(xù)在50-55°C恒溫水浴中450rpm的速度攪拌交聯(lián)反應(yīng)2h，獲得高分子微粒；
[0012] 活化：稱取交聯(lián)后的高分子微粒，并與環(huán)氧氯丙烷（ECH)混合，再加入1. 2mol/L的 NaOH溶液，放入50°C、130rpm的恒溫水浴振蕩器中，活化反應(yīng)1. 5h，取出用真空抽濾泵抽 濾，用蒸餾水洗沖除去NaOH溶液；
[0013] 接入配基：稱取活化微粒，向其中加入亞氨基乙二酸（IDA)以及1. 2mol/L NaOH溶 液并放置于50°C、30rpm恒溫振蕩器中反應(yīng)4h，再將混合液進(jìn)行抽濾，用去離子水將微粒表 面的IDA清洗干凈，得到接入配基IDA的高分子微粒；
[0014] 螯合Zn2+制備鋅離子親和介質(zhì)：稱取連接了 IDA的微粒，向其中加入0. 25mol/L的 ZnS04溶液，在常溫下震蕩反應(yīng)3h，將混合液倒入布氏漏斗進(jìn)行抽濾，用去離子水洗滌微球 得到高分子鋅離子親和層析膠，將濾液收集并稀釋至50000倍，通過(guò)原子吸收分光光度法 測(cè)定濾液中的鋅離子含量，根據(jù)反應(yīng)前鋅離子濃度與濾液中鋅離子濃度之差計(jì)算出層析膠 螯合鋅離子的量。
[0015] 優(yōu)選的，所述乳化劑為甘油或石蠟。
[0016] 優(yōu)選的，篩選出鋅離子結(jié)合多肽，采用洗脫劑將親和多肽洗脫包括以下步驟：
[0017] 將制備的鋅離子親和介質(zhì)裝入層析柱中，再向其中注入質(zhì)量百分比20 %的羅非魚(yú) 水解蛋白多肽液使其經(jīng)過(guò)層析柱，采用〇. lmol/L EDTA溶液作為洗脫液，收集與鋅離子結(jié)合 的多肽組分。
[0018] 優(yōu)選的，定向合成單一多肽_Zn( II )配合物是指收集與鋅離子結(jié)合的多肽，合成 多肽-Zn( II )配合物。
[0019] 優(yōu)選的，多肽N與乙酸鋅的Zn質(zhì)量配比為4:1，pH為4. 5,反應(yīng)溫度為45°C，反應(yīng) 時(shí)間為40min，在此條件下，多肽與Zn2+發(fā)生配合作用生成多肽-鋅配合物。
[0020] 要制備出特定多肽-鋅配合物，首先必須制備出單一多肽配基，但如何獲取單一 蛋白多肽一直是國(guó)內(nèi)外一項(xiàng)極具難點(diǎn)的課題，需要建立特殊的技術(shù)方法才能實(shí)現(xiàn)單一多肽 的制備。本發(fā)明提供的制備單一多肽_Zn( II )配合物的方法具有如下有益效果：
[0021] (1)明確了鋅離子親和介質(zhì)制備的技術(shù)參數(shù)，建立了一種通過(guò)制備的鋅離子親和 介質(zhì)從魚(yú)蛋白水解產(chǎn)物的多肽混合物中篩選、分離出一種對(duì)鋅離子有較強(qiáng)親和力的多肽的 有效方法，并分析揭示了獲取單一多肽從N端至C端的氨基酸序列為（由12個(gè)氨基酸組 成）：Thr-Phe-Pr〇-Gly-Phe-Gln-Gly-P;r〇-Val-Gly-P;r〇-Arg(蘇氨酸-苯丙氨酸-腦氨 酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-纈氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨 酸）。
[0022] (2)采用該發(fā)明所提供的從水解魚(yú)蛋白混合物中獲取單一鋅離子親和多肽的方 法，制備出由12個(gè)氨基酸組成的單一多肽，并進(jìn)而合成了多肽-Zn( II )配合物。
[0023] (3)采用該法獲取了單一多肽-Zn( II )配合物，為進(jìn)一步探究其構(gòu)效關(guān)系及人工 設(shè)計(jì)合成該類配合物奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例制備工藝流程圖；
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例高分子微粒分離多肽圖譜；
[0026] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例高分子微粒固定化鋅離子層析分離多肽圖譜；
[0027] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例多肽及多肽-鋅配合物紅外光譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種定向制備多肽_Zn( II )配合物的方法，制 備工藝流程如圖1所示：
[0029] 1、高分子載體是指葡聚糖G-25、瓊脂糖、殼聚糖，首選葡聚糖G-25。
[0030] 2、溶解：稱取1. 5g高分子載體，加入到質(zhì)量百分比1%的乙酸溶液中，攪拌并微波 處理，直至全溶解，獲得質(zhì)量百分比1. 5%的高分子溶液。
[0031] 3、乳化作用：在高分子溶液中加入25mL甘油或石蠟作為乳化劑，恒溫水浴溫度 50-55°C，以450rpm的速度連續(xù)攪拌L Oh。
[0032] 4、交聯(lián)作用：取0. 5mL質(zhì)量百分比50%的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L 的NaOH溶液2mL，繼續(xù)在50-55°C恒溫水浴中450rpm的速度攪拌交聯(lián)反應(yīng)2h，獲得高分子 微粒。
[0033] 5、活化：稱取2g交聯(lián)后的高分子微粒，并與10mL環(huán)氧氯丙烷（ECH)混合，再加入 20mLl. 2mol/L的NaOH溶液，放入50°C 130rpm的恒溫水浴振蕩器中，活化反應(yīng)1. 5h，取出用 真空抽濾泵抽濾，用蒸餾水洗沖除去NaOH溶液。
[0034] 6、接入配基：稱取活化微粒2g，向其中加入1.8g的亞氨基乙二酸（IDA)以及 20mll.2mol/L NaOH溶液并放置于50°C 130rpm恒溫振蕩器中反應(yīng)4h。再將混合液倒入布 氏漏斗中進(jìn)行抽濾，用去離子水將微粒表面的IDA清洗干凈，得到接入配基IDA的高分子微 粒。
[0035] 7、螯合Zn2+制備鋅離子親和介質(zhì)：稱取l.Og連接了 IDA的微粒，向其中加入 25ml0. 25mol/L的ZnS04溶液，在常溫下震蕩反應(yīng)3h。將混合液倒入布氏漏斗進(jìn)行抽濾，用 去離子水洗滌微球得到高分子鋅離子親和層析膠。將濾液收集并稀釋至50000倍。通過(guò)原 子吸收分光光度法測(cè)定濾液中的鋅離子含量，根據(jù)反應(yīng)前鋅離子濃度與濾液中鋅離子濃度 之差計(jì)算出層析膠螯合鋅離子的量。
[0036] 8、多肽層析與洗脫：將制備的高分子鋅離子親和介質(zhì)裝入層析柱中，再向其中加 入2ml質(zhì)量百分比20 %的羅非魚(yú)水解蛋白多肽液使其經(jīng)過(guò)層析柱；采用0. lmol/L EDTA溶 液作為洗脫液，用紫外層析圖譜系統(tǒng)在波長(zhǎng)280nm下檢測(cè)多肽組分，收集與鋅離子結(jié)合的 多肽組分（洗脫的第二峰），冷凍濃縮干燥備用。檢測(cè)圖譜如圖2、圖3所示。
[0037] 9、多肽的純化及氨基酸序列分析：上述制備的冷凍干燥多肽再經(jīng)過(guò)反相高效液相 色譜純化及氨基酸序列分析，確定多肽的氨基酸組成是Arg、Gln、Gly 3、Phe2、Pro3、Thr、Val, 多膚從 N 端至 C 端的氛基酸序列為 Thr-Phe-Pr〇-Gly-Phe-Gln-Gly-Pr〇-Val_Gly-Pr〇-Ar g (蘇氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-纈氨 酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸）。
[0038] 10、配合作用：多肽N與乙酸鋅的Zn質(zhì)量配比為4:l，pH為4. 5,反應(yīng)溫度為45°C， 反應(yīng)時(shí)間為40min，在此條件下，多肽與Zn2+發(fā)生配合作用生成多肽-鋅配合物。
[0039] 11、如圖4所示，多肽及多肽-鋅配合物結(jié)構(gòu)分析：從紅外光譜圖可以看出，多肽 在3349CHT1處有一個(gè)寬吸收峰，這是由酰胺的N-H的伸縮振動(dòng)引起的，而在多肽-鋅配合物 的吸收帶中，這個(gè)譜峰移至較低波數(shù)3294CHT1處，紅移了 54. 50CHT1。多肽在2959CHT1處的 吸收峰，這是由_CH3基團(tuán)伸縮振動(dòng)引起的，在多肽-鋅配合物中轉(zhuǎn)變到2964CHT 1處，藍(lán)移 了 5. 30CHT1，強(qiáng)度也減弱了，并且多肽-鋅配合物在3077CHT1處出現(xiàn)了吸收峰，說(shuō)明Zn 2+與 多肽結(jié)合后，多肽的結(jié)構(gòu)構(gòu)型發(fā)生了改變。多肽在1650cm-1附近有伸縮振動(dòng)酰胺I帶的特 征譜峰，這是由酰胺的C = 0伸縮振動(dòng)引起的。多肽與Zn2+結(jié)合后，這個(gè)譜帶位置變換到 了 1655CHT1，藍(lán)移了 5. 30CHT1。多肽在1596CHT1處有一個(gè)吸收峰，可能是由C = N、C = C伸 縮振動(dòng)引起的，與Zn2+結(jié)合后這個(gè)峰消失了。多肽在在多肽吸收帶HOOcnT1處有附近有伸 縮振動(dòng)酰胺ΠΙ帶的特征譜峰，這是由酰胺的N-H彎曲振動(dòng)或C-N的伸縮振動(dòng)引起的，在多 肽-鋅配合物的吸收帶變換到1398CHT 1，紅移了 2. 27CHT1。接著觀察光譜的指紋區(qū)，多肽在 1113(^1和1048CHT 1處分別有一個(gè)特征峰，這是由C-0伸縮振動(dòng)引起的，但多肽-鋅配合物 的這兩個(gè)譜峰均消失了。在多肽吸收帶652CHT 1處有附近有一個(gè)寬吸收峰，這是由N-H面外 變形振動(dòng)引起的，多肽與鋅結(jié)合后這個(gè)譜帶位置變換到669CHT 1，藍(lán)移了 16.65CHT1。以上這 些結(jié)果表明Zn2+與多肽的配合位置可能在N-H的氮原子與C = 0或C-0的氧原子上。
[0040] 上面所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的構(gòu) 思和范圍進(jìn)行限定。在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)思的前提下，本領(lǐng)域普通人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù) 方案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入到本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)內(nèi)容， 已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書(shū)中。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備單一多肽-zn( II )配合物的方法，其特征在于： 首先將金屬鋅離子通過(guò)交聯(lián)和螯合作用固定在高分子載體上，制備出鋅離子親和層析 柱，并通過(guò)層析柱對(duì)水解蛋白多肽的親和作用篩選出鋅離子結(jié)合多肽，然后采用洗脫劑將 親和多肽洗脫下來(lái)，再定向合成單一多肽-Zn( II )配合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備單一多肽_Zn( II )配合物的方法，其特征在于：所述的高 分子載體為葡聚糖G-25、殼聚糖或瓊脂糖。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備單一多肽_Zn( II )配合物的方法，其特征在于制備鋅離子 親和層析柱包括以下步驟： 溶解：稱取高分子載體，加入到質(zhì)量百分比1 %的乙酸溶液中，攪拌并微波處理，直至 全溶解，獲得質(zhì)量百分比1. 5%的高分子溶液； 乳化作用：在高分子溶液中加入乳化劑，恒溫水浴溫度50-55°C，以450rpm的速度連續(xù) 攪拌1. Oh ; 交聯(lián)作用：取質(zhì)量百分比50%的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L的NaOH溶液， 繼續(xù)在50-55°C恒溫水浴中450rpm的速度攪拌交聯(lián)反應(yīng)2h，獲得高分子微粒； 活化：稱取交聯(lián)后的高分子微粒，并與環(huán)氧氯丙烷（ECH)混合，再加入1. 2mol/L的 NaOH溶液，放入50°C、130rpm的恒溫水浴振蕩器中，活化反應(yīng)1. 5h，取出用真空抽濾泵抽 濾，用蒸餾水洗沖除去NaOH溶液； 接入配基：稱取活化微粒，向其中加入亞氨基乙二酸（IDA)以及1. 2mol/L NaOH溶液并 放置于50°C、30rpm恒溫振蕩器中反應(yīng)4h，再將混合液進(jìn)行抽濾，用去離子水將微粒表面的 IDA清洗干凈，得到接入配基IDA的高分子微粒； 螯合Zn2+制備鋅離子親和介質(zhì)：稱取連接了 IDA的微粒，向其中加入0. 25mol/L的 ZnS04溶液，在常溫下震蕩反應(yīng)3h，將混合液倒入布氏漏斗進(jìn)行抽濾，用去離子水洗滌微球 得到高分子鋅離子親和層析膠，將濾液收集并稀釋至50000倍，通過(guò)原子吸收分光光度法 測(cè)定濾液中的鋅離子含量，根據(jù)反應(yīng)前鋅離子濃度與濾液中鋅離子濃度之差計(jì)算出層析膠 螯合鋅尚子的量。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備單一多肽-Zn( II )配合物的方法，其特征在于：所述乳化 劑為甘油或石錯(cuò)。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備單一多肽-Zn( II )配合物的方法，其特征在于篩選出鋅離 子結(jié)合多肽，采用洗脫劑將親和多肽洗脫包括以下步驟： 將制備的鋅離子親和介質(zhì)裝入層析柱中，再向其中注入質(zhì)量百分比20%的羅非魚(yú)水解 蛋白多肽液使其經(jīng)過(guò)層析柱，采用〇. lmol/LEDTA溶液作為洗脫液，收集與鋅離子結(jié)合的多 肽組分。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備單一多肽_Zn( II )配合物的方法，其特征在于： 定向合成單一多肽-Zn( II )配合物是指收集與鋅離子結(jié)合的多肽，合成多肽-Zn( II ) 配合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備單一多肽-Zn( II )配合物的方法，其特征在于： 多肽N與乙酸鋅的Zn質(zhì)量配比為4:1，pH為4. 5,反應(yīng)溫度為45°C，反應(yīng)時(shí)間為40min， 在此條件下，多肽與Zn2+發(fā)生配合作用生成多肽-鋅配合物。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK104109190SQ201410326200
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】曾慶祝, 許慶陵 申請(qǐng)人:廣州大學(xué)