合成胸腺法新的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領域，具體涉及合成胸腺法新的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有方法分離純化困難、總收率低、生產(chǎn)成本高。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案是提供一種合成胸腺法新的方法，包括以下步驟：a、合成在側(cè)鏈上有保護基的多肽片段1和多肽片段2；b、將多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶聯(lián)，然后脫除N端保護基，得到多肽樹脂Ⅰ；c、根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個偶聯(lián)第11個至第1個氨基酸，然后脫除N端保護基，再乙?；?，得到胸腺法新樹脂；d、胸腺法新樹脂酸解脫除C端樹脂和所有保護基得到胸腺法新粗品，純化后，獲得胸腺法新。本發(fā)明所述方法能夠大幅度提高產(chǎn)品收率，縮短合成周期。
【專利說明】合成胸腺法新的方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領域，具體涉及合成胸腺法新的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胸腺法新是一種免疫調(diào)節(jié)因子，由28個氨基酸組成，它可以特異性地誘導T細胞 Lytl+、2+、3+表面標志的產(chǎn)生，促使T細胞及自然殺傷細胞（NK)的分化與成熟，促使致 敏的T細胞在各種抗原或有絲分裂原激活后產(chǎn)生各種淋巴因子，如白介素2 (IL2)、a干擾 素（IFNci)、γ干擾素（IFNY)等淋巴因子，促使對IL2高親和力受體的表達增加，增強 Th細胞的功能，同時它還通過對T4細胞的激活作用來增強異體和自體的人類混合的淋巴 細胞反應。胸腺法新可能影響NK前體細胞的募集，這前體細胞暴露于干擾素后變得更有 細胞毒性，使機體能有效的發(fā)揮免疫防護功能。該品具有促進T細胞分化、成熟，提高NK細 胞活性，促進T細胞分泌各類淋巴因子，提高IL 一 2受體對IL 一 2的親合力等作用。早期 臨床應用主要集中于抗腫瘤、免疫功能低下方面，近年來藥效學研究結(jié)果同時表明，本品更 具有保護肝臟、特異性地抑制受HBV感染的Η印G2-Nu2細胞的生長和抑制土撥鼠 WHV病毒 復制的作用。在用于治療慢性肝炎的多中心試驗結(jié)果表明單獨使用該品的療效與干擾素相 同，但副反應比干擾素少得多。在臨床上，已成功地應用于治療乙、丙型肝炎及其它免疫缺 陷的疾病。
[0003] 藥代動力學研究文獻顯示，本品健康人單次皮下注射胸腺法新1. 6mg，血藥峰濃度 約為37. 51ng/ml，達峰時間約為1. 67小時，AUC0-15約為152. 15ng/ml *h，半衰期約為1. 65 小時。一組有關(guān)Τα 1藥代動力學方面的由日達仙、Timosina和Τα 1三種樣品作對照的實 驗中顯示，Τ α 1釋放快速（Tmax為l_2h)，代謝緩慢（16_18h)，盡管80%由泌尿系統(tǒng)排出體 夕卜，但Cmax為30_80ug/L，仍比正常Τ α 1血濃度〇. 5?0. 75ug/L高出幾十倍。
[0004] 當前胸腺法新的制備方法主要為固相合成法，但由于胸腺法新分子結(jié)構(gòu)中有大量 的β折疊結(jié)構(gòu)，形成困難序列，如逐個氨基酸從C端到N端進行接肽，從第28氨基酸偶聯(lián) 至第21氨基酸時，肽樹脂體積就發(fā)生20%以上的收縮，同時繼續(xù)接到第11氨基酸時才恢復 正常，這種收縮嚴重降低了后續(xù)氨基酸的偶聯(lián)收率，增加了分離純化的難度，同時嚴重降低 了產(chǎn)品的收率，從已報道的制備方法可知，對于98% HPLC純度的胸腺法新，當前的制備總 收率一般都在20 %左右。
[0005] 胸腺法新的氨基酸順序如下所示：
[0006] Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val 5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu 10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys 14 -Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys 19-Lys20-Glu21-Val22-Val 23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu 27-Asn28-0H


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有方法分離純化困難、總收率低、生產(chǎn)成本高。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案是提供一種合成胸腺法新的方法，使得本發(fā)明所 述方法在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，降低合成方法的復雜程度和提高產(chǎn)品的總收率。
[0009] 上述合成胸腺法新的方法，包括以下步驟：
[0010] a、合成在側(cè)鏈上有保護基的多肽片段1 :
[0011] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-〇H ;
[0012] 合成在側(cè)鏈上有保護基的多肽片段2 :
[0013] NH2_Val_Val_Glu (OtBu) _Glu (OtBu) _Ala_Glu (OtBu) _Asp ( a -OtBu)_ 氣基樹脂；
[0014] b、將多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶聯(lián)，然后脫除多肽片段的N端Fmoc 保護基，得到多肽樹脂I :
[0015] NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇tB u)-氨基樹脂；
[0016] c、根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個偶聯(lián)第11個至 第1個氨基酸，然后脫除N端保護基，再進行乙?；磻?，得到胸腺法新樹脂 ：
[0017] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu (OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基樹脂；
[0018] d、胸腺法新樹脂酸解脫除C端樹脂和所有保護基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗 品純化后，獲得胸腺法新。
[0019] 在本發(fā)明所述方法中，首先按照胸腺法新肽序列分成3個部分，即分成2個片段的 合成以及其他氨基酸的逐個偶聯(lián)，以胸腺法新主鏈N端到C端的氨基酸順序編號，如下式所 示：
[0020] Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val 5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu 10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys 14 -Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys 19-Lys20-Glu21-Val22-Val 23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu 27-Asn28-0H
[0021] 多肽片段1的氨基酸序列即為上式中編號12-21的多肽序列：
[0022] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-〇H。
[0023] 多肽片段2的氨基酸序列即為上式中編號22-28的多肽序列：
[0024] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基樹脂。
[0025] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟a所述合成多肽片段1具體為：在偶聯(lián)試劑存在下， 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu) -0H)與 載體樹脂偶聯(lián)，再脫Fmoc保護基得到H-Glu (OtBu)-載體樹脂，然后采用活化試劑和縮合試 齊?，根據(jù)胸腺法新氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基 以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Boc保護基的賴氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè) 鏈偶聯(lián)有Boc保護基的賴氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián) 有tBu保護基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Boc 保護基的賴氨酸（Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的亮氨酸（Fmoc-Leu-〇H)、 N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的天門冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu)-0H)、 N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Boc保護基的賴氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶 聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇冬氨酸（Fmoc-Thr (tBu) -OH)、N端偶聯(lián)有 Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的蘇氨酸（Fmoc-Thr (tBu) -OH)進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián) 后裂解液裂解，脫除載體樹脂得到多肽片段1 :
[0026] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH。
[0027] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟a所述合成多肽片段2具體為：在偶聯(lián)試劑存在 下，將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的天門冬氨酸（Fmoc-Asp(a-tBu)-OH)與脫保護后的氨基 樹脂偶聯(lián)，脫Fmoc保護基得到H-Asp ( a -tBu)-氨基樹脂，然后采用活化試劑和縮合試 齊?，根據(jù)胸腺法新氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保 護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的谷氨酸（Fm 〇c-Glu(0tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護 基的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的谷氨 酸（Fmoc-Glu (OtBu)-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的谷氨酸 (Fmoc-Glu (OtBu) -〇H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的纟顏氨酸（Fmoc-Val-〇H)、N端偶聯(lián)有Fmoc 保護基的纈氨酸（Fmoc-Val-OH)進行延伸偶聯(lián)，脫除N段帶有的Fmoc保護基得到多肽片段 2 ：
[0028] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基樹脂。
[0029] 作為優(yōu)選方案，步驟c具體為：
[0030] 采用活化試劑和縮合試劑，根據(jù)胸腺法新氨基酸序列，按照從C端到N端的順序先 將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的異亮氨酸（Fmoc-Ile-OH)的C端與多肽樹脂I的N端偶聯(lián)后 脫Fmoc保護基得到H-Ile-多肽樹脂I，然后依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈 偶聯(lián)有tBu保護基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián) 有tBu保護基的絲氨酸（Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu 保護基的絲氨酸（Fmoc-Ser (tBu) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基 的蘇氨酸（Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的天 冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的繳氨酸（Fmoc-Val-〇H)、N端偶聯(lián) 有Fmoc保護基的丙氨酸（Fmoc-Aal-〇H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護基的丙氨酸（Fmoc-Aal-〇H)、 N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有OtBu保護基的天冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N 端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護基的絲氨酸（Fmoc-Ser (tBu)-0H)進行延伸 偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除N端帶有的Fmoc保護基，進行乙?；磻蟮玫叫叵俜ㄐ聵渲?br> [0031] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu (OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基樹脂。
[0032] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，第一個保護氨基酸與載體樹脂偶聯(lián)所形成 的多肽樹脂取代值為〇. 3?1. 2mmol/g多肽樹脂；優(yōu)選的取代值為0. 6?1. 0mm〇l/g多肽 樹脂。
[0033] 上述方法步驟a的合成多肽片段2中，第一個保護氨基酸與氨基樹脂偶聯(lián)所形成 的多肽樹脂取代值為〇. 2?0. 8mmol/g多肽樹脂；優(yōu)選的取代值為0. 4?0. 6mmol/g多肽 樹脂。
[0034] 本發(fā)明所述延伸偶聯(lián)是指在第一個氨基酸與氨基載體偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照各 自序列的順序逐個和前一個偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應（主鏈氨基和羧基的縮合反應）進 行偶聯(lián)。本發(fā)明偶聯(lián)時，每個保護氨基酸或多肽片段用量優(yōu)選為多肽樹脂摩爾數(shù)的1?6 倍；更優(yōu)選為2. 5?3. 5倍。所述偶聯(lián)的反應時間為60?300分鐘；優(yōu)選為100?140分 鐘。
[0035] 在延伸偶聯(lián)中，由于每個氨基酸的N端都有保護基，因此需要用去N端保護基試劑 先脫除N端保護基再偶聯(lián)。本發(fā)明用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺）混合溶液作為 去N端保護基試劑脫除N端保護基；所述混合溶液中含哌啶為10?30% (V)，其余為DMF。 所述去N端保護基試劑的用量為每克多肽樹脂5?15mL，優(yōu)選的為每克多肽樹脂8?12mL。 去N端保護基的時間為10?60分鐘，優(yōu)選的為15?25分鐘。
[0036] 需要說明的是，本發(fā)明所述多肽樹脂指任意個數(shù)保護氨基酸按照胸腺法新氨基酸 順序和氨基載體相連接形成的多肽樹脂，這其中也包括多肽樹脂I、胸腺法新樹脂。
[0037] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，所述的載體樹脂為Trityl-Cl (三苯甲基 氯）類樹脂。優(yōu)選的，所述Trityl-Cl類樹脂為Trityl-Cl樹脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲 基三苯甲基氯）樹脂、4-Methoxytrityl-Cl (4-甲氧基三苯甲基氯）樹脂或2-C1 Trity-Cl (2-氯三苯甲基氯）樹脂中的任意一種。
[0038] 進一步優(yōu)選的，當載體樹脂為Trityl-Cl類樹脂時，保護氨基酸與載體樹脂的偶 聯(lián)方法為：保護氨基酸的羧基與樹脂中的C1代烷基在堿的作用下發(fā)生酯化反應而接入保 護氨基酸。
[0039] 上述方法步驟a的合成多肽片段2中，所述的氨基樹脂選自Rink Amide AM樹脂、 Rink Amide樹脂和Rink MBHA樹脂中的任意一種，優(yōu)選為Rink Amide MBHA樹脂。
[0040] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，所述裂解液為體積百分比25%的三氟乙醇 的二氯甲烷溶液。
[0041] 作為優(yōu)選的方案，所述縮合試劑為N，N-二異丙基碳二亞胺（Die)、N，N-二環(huán)己基 碳二亞胺（DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有機堿（PyBOP/有機堿）、 2_ (7-氮雜-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有機堿（HATU/有機 堿）、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽/有機堿（HBTU/有機堿）或0-苯并三 氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/有機堿（TBTU/有機堿）中的任意一種。所述縮 合試劑的摩爾用量為多肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1?6倍；優(yōu)選為2. 5?3. 5倍。
[0042] 上述縮合試劑中所述的有機堿為Ν，Ν-二異丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺（TEA)或 N-甲基嗎啡啉（NMM)中的任意一種；優(yōu)選為DIPEA。
[0043] 需要說明的是，所述PyBOP/有機堿、HATU/有機堿、HBTU/有機堿、TBTU/有機堿， 在本發(fā)明中屬于四種雙體系的縮合試劑，即PyBOP、HATU、HBTU在使用時需要分別和有機堿 組合在一起成為一種縮合試劑使用。其中所述有機堿和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩爾比 為1. 3?3. 0:1 ;更優(yōu)選為1. 3?1. 5:1。
[0044] 作為優(yōu)選的方案，所述活化試劑為1-羥基苯并三唑（HOBt)或N-羥基-7-氮雜苯 并三氮唑（HOAt)。所述活化試劑的用量為多肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1. 2?6倍；優(yōu)選為 2. 5 ?3. 5 倍。
[0045] 作為優(yōu)選的方案，所述的偶聯(lián)試劑為N，N-二異丙基乙胺（DIPEA)、N，N-二異丙基 碳二亞胺/4-二甲氨基吡啶（DIC/DMAP)兩種之一。
[0046] 在本發(fā)明合成過程中，優(yōu)選采用DMF溶劑來溶解。
[0047] 除上述列舉的合成方法，本發(fā)明也可以采用液相合成法按照本發(fā)明片段合成策略 進行合成。
[0048] 作為優(yōu)選方案，步驟d所述的酸解，是采用由體積百分比為80?95%的TFA、體積 百分比為1?10%的EDT、余量為水組成的混合酸解液進行酸解。優(yōu)選地，用由體積百分比 為90%的TFA、體積百分比為5%的EDT、余量為水組成的混合酸解液進行酸解。所述混合 酸解液用量為每克胸腺法新樹脂需要4?15mL ;優(yōu)選為9?llmL。所述酸解的時間為室溫 條件下1?6小時；優(yōu)選為室溫條件下3?4小時。
[0049] 作為優(yōu)選的方案，步驟d所述的純化具體為：
[0050] 胸腺法新粗品，加水攪拌，用氨水調(diào)pH7. 0至完全溶解，溶液用0. 45 μ m微孔濾膜 過濾，純化備用；
[0051] 采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為10 μ m的反相C18,流動相系統(tǒng) 為0. 1% TFA/水溶液-0. 1% TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用 梯度系統(tǒng)洗脫，循環(huán)進樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰蒸 去乙腈后，得胸腺法新純化中間體濃縮液；
[0052] 取胸腺法新純化中間體濃縮液，用0. 45 μ m濾膜濾過備用；
[0053] 采用高效液相色譜法進行換鹽,流動相系統(tǒng)為1 %醋酸/水溶液-乙腈，純化用色 譜填料為10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min,采用梯度洗脫，循環(huán)上 樣方法，上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并 用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到胸腺法新醋酸水溶液，冷凍干燥， 得胸腺法新純品。
[0054] 由本發(fā)明提供的方法合成的胸腺法新，經(jīng)HPLC檢測純度為99%以上，總收率為 30%以上，而且本發(fā)明所述方法中2個片段可以同時進行合成，與現(xiàn)有逐個合成氨基酸的 技術(shù)方案相比，縮短了合成周期，提高總收率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 圖 1 Rink Amide AM 樹脂的結(jié)構(gòu)。
[0056] 圖2 Rink Amide樹脂的結(jié)構(gòu)。
[0057] 圖3 Rink MBHA樹脂的結(jié)構(gòu)。

【具體實施方式】
[0058] 合成胸腺法新的方法，包括以下步驟：
[0059] a、在偶聯(lián)試劑存在下，將Fmoc-Glu (OtBu) -0H與載體樹脂偶聯(lián)，再脫Fmoc保護基 得到H-Glu (OtBu)-載體樹脂，然后采用活化試劑和縮合試劑，根據(jù)胸腺法新氨基酸序列， 按照從 C 端到 N端依次逐個將 Fmoc-Lys (Boc) -〇H、Fmoc_Lys (Boc) -〇H、Fmoc_Glu (OtBu) -0H、 Fmoc-Lys(Boc)-〇H> Fmoc-Leu-〇H> Fmoc-Asp(OtBu)-〇H> Fmoc-Lys(Boc)-〇H> Fmoc-Thr (tBu) -0H、Fm〇c-Thr (tBu) -OH進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后裂解液裂解，脫除載體樹脂得 到多肽片段1 :
[0060] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH ;
[0061] 在偶聯(lián)試劑存在下，將Fmoc-Asp ( a -tBu) -OH與脫保護后的氨基樹脂偶聯(lián)，脫 Fmoc保護基得到H-Asp ( a -tBu)-氨基樹脂，然后采用活化試劑和縮合試劑，根據(jù)按照胸 腺法新氨基酸序列，按照從C端到N端依次逐個將Fmoc-Glu(0tBu)_0H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Val-〇H 進行延伸偶聯(lián)，脫除 N端帶有的Fmoc保護基得到多肽片段2 :
[0062] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基樹脂；
[0063] b、將多肽片段1的C端和多肽片段2的N端連接，然后脫除N端Fmoc保護基，得 到多肽樹脂I:
[0064] NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -〇tB u)-氨基樹脂；
[0065] c、根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個連接第11 個至第1個氨基酸，先將Fmoc-Ile-OH的C端與多肽樹脂I的N端偶聯(lián)后脫Fmoc保護 基得到 H-I le-多肽樹脂 I，然后依次逐個將 Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ser (tBu) -0H、 Fmoc-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Aal-OH、 Fmoc-Aal-〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc_Ser (tBu) -〇H 進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除 N 端帶有 的Fmoc保護基，進行乙?；磻蟮玫叫叵俜ㄐ聵渲?br> [0066] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys (Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基樹脂；
[0067] d、胸腺法新樹脂酸解脫除C端樹脂和所有保護基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗 品純化后，獲得胸腺法新。
[0068] 胸腺法新結(jié)構(gòu)有28個氨基酸殘基，要獲得總收率明顯的提高，必須克服在合成過 程中肽樹脂的收縮問題。為此， 申請人:根據(jù)長期的試驗研究，提出了本發(fā)明所述方法來制備 胸腺法新，在提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時，提高制備總收率。
[0069] 本發(fā)明在步驟a中合成的多肽片段1所示氨基酸序列，在其N端、Thr側(cè)鏈上、Lys 側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上以及Glu側(cè)鏈上分別偶聯(lián)保護基；合成的多肽片段2所示氨基酸序列， 在其N端、Asp側(cè)鏈上以及、Glu側(cè)鏈上分別偶聯(lián)保護基；而剩余的其他氨基酸，則是在多肽 片段1與多肽片段2偶聯(lián)形成多肽樹脂I后，按照胸腺法新1?11多肽序列所示氨基酸序 列C端到N端的順序，先將N端偶聯(lián)有保護基的亮氨酸的C段與多肽樹脂I的N端偶聯(lián)，然 后依次逐個將其他對應的保護氨基酸進行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)后脫除N端保護基，經(jīng)乙?；?應后得到整個胸腺法新樹脂。
[0070] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，第一個保護氨基酸與載體樹脂偶聯(lián)所形成 的多肽樹脂取代值優(yōu)選為〇. 3?1. 2mmol/g多肽樹脂；更優(yōu)選的取代值為0. 6?1. Ommol/ g多肽樹脂。
[0071] 上述方法步驟a的合成多肽片段2中，第一個保護氨基酸與氨基樹脂偶聯(lián)所形成 的多肽樹脂取代值優(yōu)選為0. 2?0. 8mmol/g多肽樹脂；更優(yōu)選的取代值為0. 4?0. 6mmol/ g多肽樹脂。
[0072] 本發(fā)明所述延伸偶聯(lián)是指在第一個氨基酸與氨基載體偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照各 自序列的順序逐個和前一個偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應（主鏈氨基和羧基的縮合反應）進 行偶聯(lián)。本發(fā)明偶聯(lián)時，每個保護氨基酸或多肽片段用量優(yōu)選為多肽樹脂摩爾數(shù)的1?6 倍；更優(yōu)選為2. 5?3. 5倍。所述偶聯(lián)的反應時間優(yōu)選為60?300分鐘；更優(yōu)選為100? 140分鐘。
[0073] 在延伸偶聯(lián)中，由于每個氨基酸N端都有保護基，因此需要用去N端保護基試劑 先脫除N端保護基再偶聯(lián)。本發(fā)明優(yōu)選用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺）混合溶液 作為去N端保護基試劑脫除N端保護基；所述混合溶液中含哌啶為10?30% (V)，其余為 DMF。所述去N端保護基試劑的用量為每克多肽樹脂5?15mL，優(yōu)選的為每克多肽樹脂8? 12mL。去N端保護基的時間為10?60分鐘，優(yōu)選的為15?25分鐘。
[0074] 需要說明的是，本發(fā)明所述多肽樹脂指任意個數(shù)保護氨基酸按照胸腺法新氨基酸 順序和氨基載體相連接形成的多肽樹脂，這其中也包括多肽樹脂I、胸腺法新樹脂。
[0075] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，所述的載體樹脂為Trityl-Cl (三苯甲基 氯）類樹脂。優(yōu)選地，所述Trityl-Cl類樹脂為Trityl-Cl樹脂、4-Methyltrityl-Cl (4-甲 基三苯甲基氯）樹脂、4-Methoxytrityl-Cl (4-甲氧基三苯甲基氯）樹脂或2-C1 Trity-Cl (2-氯三苯甲基氯）樹脂中的任意一種。
[0076] 其中，進一步優(yōu)選地，當載體樹脂為Trityl-Cl類樹脂時，保護氨基酸與載體樹脂 的偶聯(lián)方法為：保護氨基酸的羧基與樹脂中的C1代烷基在堿的作用下發(fā)生酯化反應而接 入保護氨基酸。
[0077] 上述方法步驟a的合成多肽片段2中，所述的氨基樹脂選自Rink Amide AM樹脂、 Rink Amide樹脂和Rink MBHA樹脂中的任意一種，優(yōu)選為Rink Amide MBHA樹脂。
[0078] 上述方法步驟a的合成多肽片段1中，所述裂解液為體積百分比25%的三氟乙醇 的二氯甲烷溶液。
[0079] 作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，所述縮合試劑為N，N-二異丙基碳二亞胺（DIC)、N，N-二 環(huán)己基碳二亞胺（DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有機堿（PyBOP/ 有機堿）、2-(7_氮雜-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有機堿 (HATU/有機堿）、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽/有機堿（HBTU/有機堿） 或0-苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/有機堿（TBTU/有機堿）中的任意一 種。所述縮合試劑的摩爾用量為多肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1?6倍；優(yōu)選為2. 5?3. 5 倍。
[0080] 上述縮合試劑中所述的有機堿為Ν，Ν-二異丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺（TEA)或 N-甲基嗎啡啉（NMM)中的任意一種；優(yōu)選為DIPEA。
[0081] 需要說明的是，所述PyBOP/有機堿、HATU/有機堿、HBTU/有機堿、TBTU/有機堿， 在本發(fā)明中屬于四種雙體系的縮合試劑，即PyBOP、HATU、HBTU在使用時需要分別和有機堿 組合在一起成為一種縮合試劑使用。其中所述有機堿和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩爾比 為1. 3?3. 0:1 ;更優(yōu)選為1. 3?1. 5:1。
[0082] 作為優(yōu)選，所述活化試劑為1-羥基苯并三唑（HOBt)或N-羥基-7-氮雜苯并三氮 唑（HOAt)。所述活化試劑的用量為多肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1. 2?6倍；優(yōu)選為2. 5? 3. 5 倍。
[0083] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述偶聯(lián)試劑為N，N-二異丙基乙胺（DIPEA)、N，N-二異丙基碳 二亞胺/4-二甲氨基吡啶（DIC/DMAP)兩種之一。
[0084] 在本發(fā)明合成過程中，優(yōu)選采用DMF溶劑來溶解。
[0085] 除上述列舉的合成方法，本發(fā)明也可以采用液相合成法按照本發(fā)明片段合成策略 進行合成。
[0086] 作為優(yōu)選方案，步驟d所述的酸解，是采用由體積百分比為80?95%的TFA、體積 百分比為1?10%的EDT、余量為水組成的混合酸解液進行酸解。優(yōu)選地，用由體積百分比 為90%的TFA、體積百分比為5%的EDT、余量為水組成的混合酸解液進行酸解。所述混合 酸解液用量為每克胸腺法新樹脂需要4?15mL ;優(yōu)選為9?llmL。所述酸解的時間為室溫 條件下1?6小時；優(yōu)選為室溫條件下3?4小時。
[0087] 作為優(yōu)選，步驟d所述純化具體為：
[0088] 胸腺法新粗品，加水攪拌，用氨水調(diào)pH7. 0至完全溶解，溶液用0. 45 μ m微孔濾膜 過濾，純化備用；
[0089] 采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為10 μ m的反相C18,流動相系統(tǒng) 為0. 1% TFA/水溶液-0. 1% TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用 梯度系統(tǒng)洗脫，循環(huán)進樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰蒸 去乙腈后，得胸腺法新純化中間體濃縮液；
[0090] 取胸腺法新純化中間體濃縮液，用0. 45 μ m濾膜濾過備用；
[0091] 采用高效液相色譜法進行換鹽,流動相系統(tǒng)為1 %醋酸/水溶液-乙腈，純化用色 譜填料為10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min,采用梯度洗脫，循環(huán)上 樣方法，上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并 用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到胸腺法新醋酸水溶液，冷凍干燥， 得胸腺法新純品。
[0092] 本發(fā)明所述保護基是在氨基酸合成領域常用的保護氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、 羧基等干擾合成的基團的保護基團，防止氨基、羧基等在制備目標產(chǎn)物過程中發(fā)生反應，生 成雜質(zhì)，對于本發(fā)明中需要保護側(cè)鏈的氨基酸來說，本領域技術(shù)人員公知其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及 知曉采用常用保護基來保護氨基酸側(cè)鏈上的氨基、羧基等基團，作為優(yōu)選，本發(fā)明通過OtBu 保護基保護谷氨酸、天冬氨酸的側(cè)鏈；通過tBu保護基保護蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸的側(cè)鏈； 通過Boc保護基保護賴氨酸的側(cè)鏈。此外，在本發(fā)明所述方法涉及的氨基酸中，氨基酸N端 均優(yōu)選通過Fmoc保護基進行保護。而被保護基保護的氨基酸稱為保護氨基酸。
[0093] 本發(fā)明公開了一種合成胸腺法新的方法，本領域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適 當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術(shù)人員來說 是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描 述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的的化合物和制備方 法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0094] 在本發(fā)明【具體實施方式】中，所有偶聯(lián)由保護基的氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā) 明中的保護氨基酸購自于成都暉蓉生物科技有限公司，所用樹脂購自于上虞普爾樹脂有限 公司，其中本發(fā)明所述多肽片段1也可以通過市售獲得，申請文件中所用英文縮寫對應的 中文含義見表1。
[0095] 表1英文縮寫釋義
[0096]

【權(quán)利要求】
1. 合成胸腺法新的方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 合成在側(cè)鏈上有保護基的多肽片段1 : Fmoc-Thr(tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc) -Lys (Boc)-Glu(OtBu)-OH ； 合成在側(cè)鏈上有保護基的多肽片段2 : NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基樹脂； b、 將多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶聯(lián)，然后脫除多肽片段的N端Fmoc保護 基，得到多肽樹脂I : NH2-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys (Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -OtBu)-氨 基樹脂； c、 根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列，按照從C端到N端的順序依次逐個偶聯(lián)第11個至第1 個氨基酸，然后脫除N端保護基，再進行乙酰化反應，得到胸腺法新樹脂： Ac-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-G lu(OtBu)-Ile-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys ( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -OtBu )_氨基樹脂； d、 胸腺法新樹脂酸解脫除C端樹脂和所有保護基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗品純 化后，獲得胸腺法新。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a所述合成多肽片段1的步驟為： 在偶聯(lián)試劑存在下，將Fmoc-Glu(0tBu)_0H與載體樹脂偶聯(lián)，再脫Fmoc保護基得到 H-Glu (OtBu)-載體樹脂，然后采用活化試劑和縮合試劑，按照從C端到N端的順序依次逐 個偶聯(lián) Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc_Asp(OtBu)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Thr(tBu)-〇H、 Fmoc-Thr (tBu)-0H，偶聯(lián)后用裂解液裂解，脫除載體樹脂得到多肽片段1 : Fmoc-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc) -Lys (Boc)-Glu(OtBu)-OH。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a所述合成多肽片段2的步驟為： 在偶聯(lián)試劑存在下，將Fmoc-Asp ( a -tBu) -0H與脫保護后的氨基樹脂偶聯(lián)，脫Fmoc 保護基得到H-Asp(cx-tBu)-氨基樹脂，然后采用活化試劑和縮合試劑，按照從C端 到 N 端的順序依次逐個偶聯(lián) Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H、 Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Val-〇H，脫除 N 端的 Fmoc 保護基得到多膚片段 2 : NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基樹脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟c的步驟為： 采用活化試劑和縮合試劑，先將Fmoc-11 e-OH的C端與多肽樹脂I的N端偶聯(lián) 后，脫Fmoc保護基得到H-Ile-多肽樹脂I，然后按照從C端到N端的順序依次逐個偶 聯(lián) Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-0H、 Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、 Fmoc-Ser (tBu)-OH，偶聯(lián)后脫除N端的Fmoc保護基，進行乙酰化反應后得到胸腺法新樹 脂： Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-G lu (OtBu)-Ile-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -OtBu )_氨基樹脂。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或4任意一項所述的方法，其特征在于：所述的氨基樹脂選自 Rink MBHA樹脂、Rink Amide AM樹脂和Rink Amide樹脂中的任意一種；優(yōu)選為Rink Amide MBHA樹脂。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述的載體樹脂選自Trityl-Cl類樹脂； 優(yōu)選為2-C1 Trity-Cl樹脂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述裂解液為體積百分比25%的三氟乙 醇的二氯甲烷溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項所述的方法，其特征在于：所述的縮合試劑為N，N-二 異丙基碳二亞胺、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺，六氟憐酸苯并二唑-1-基-氧基二批咯燒基憐/ N，N-二異丙基乙胺、2- (7-氮雜-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/ N，N-二異丙基乙胺、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽/N，N-二異丙基乙胺或 〇-苯并三氮唑-Ν, Ν, Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/Ν, Ν-二異丙基乙胺中的任意一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項所述的方法，其特征在于：所述活化試劑為1-羥基苯 并三唑或Ν-羥基-7-氮雜苯并三氮唑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟d所述的酸解，是采用由體積百分 比為80?95%的TFA、體積百分比為1-10%的EDT、余量為水組成的混合酸解液進行酸解。
【文檔編號】C07K14/575GK104098688SQ201410333844
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】文永均, 郭德文, 董華建, 曾德志 申請人:成都圣諾生物科技股份有限公司