一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)peg修飾的方法及所得peg修飾的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法及所得PEG修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法包括：獲得蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)的C末端融合分選酶識(shí)別的分選基序，得重組蛋白質(zhì)；取PEG修飾劑、該重組蛋白質(zhì)，與分選酶混合，經(jīng)肽鍵的切割、連接反應(yīng)，獲得PEG修飾的蛋白質(zhì)，其中的PEG修飾劑具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。本發(fā)明利用分選酶，實(shí)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的C末端定點(diǎn)修飾PEG，整個(gè)操作簡單，成本低，避免了蛋白質(zhì)PEG修飾時(shí)容易產(chǎn)生多位點(diǎn)修飾的發(fā)生，更有利于PEG修飾在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用；其中，m為聚合度，1≤m≤5；n為聚合度；110≤n≤1100。
【專利說明】一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法及所得PEG修飾的蛋白質(zhì)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法及所得PEG修飾的蛋白質(zhì)。

【背景技術(shù)】
[0002]聚乙二醇(PEG)是環(huán)氧乙烷水解產(chǎn)物的聚合物，為一種親水、不帶電荷的線性大分子。共價(jià)連接親水性聚合物聚乙二醇是一種增加生物活性分子(包括蛋白、肽、尤其是疏水性生物分子)的水溶性、提高其生物利用度、延長血清半衰期、調(diào)節(jié)免疫原性、提高生物活性常用的方法。其中，利用PEG修飾蛋白質(zhì)來延長其半衰期、減少免疫原性、增加穩(wěn)定性，是一項(xiàng)已成功應(yīng)用的技術(shù)。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類藥品的修飾，例如，已經(jīng)上市的包括PEG-門冬酰胺酶，PEG-ADA (腺苷脫氨酶)，PEG-干擾素和PEG-GCSF (粒細(xì)胞集落刺激因子)等。其中PEG-干擾素由原來的每兩天或每天注射一次降低到每周一次，而且療效顯著改善。PEG-GCSF也由每天注射一次改善為每個(gè)化療療程注射一次。
[0003]目前，對蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG修飾的方法主要為化學(xué)修飾法，主要步驟包括:取活化的PEG，在偶聯(lián)劑的作用下，PEG末端的羥基與蛋白質(zhì)分子上的氨基、羧基或巰基等基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，即得。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子上多個(gè)基團(tuán)可以與聚乙二醇發(fā)生反應(yīng)，所以導(dǎo)致了在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化學(xué)修飾過程中會(huì)有一些副反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)生多個(gè)PEG修飾的蛋白質(zhì)復(fù)雜混合物，并且有可能破壞所修飾蛋白的生物活性，最終導(dǎo)致所得的修飾產(chǎn)物不均一、副產(chǎn)物多、療效不穩(wěn)定，進(jìn)而限制了 PEG在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用。所以，急需提供一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法，以獲得產(chǎn)物單一、質(zhì)量穩(wěn)定的PEG修飾的蛋白質(zhì)，推廣PEG修飾在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法及所得PEG修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的方法采用分選酶進(jìn)行蛋白質(zhì)PEG修飾，可以實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)的C末端定點(diǎn)修飾上PEG，避免了蛋白質(zhì)PEG修飾中副反應(yīng)的發(fā)生，更有利于PEG修飾在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1:獲得蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)的C末端融合分選酶識(shí)別的分選基序，得重組蛋白質(zhì)；
[0008]步驟2:取PEG修飾劑、步驟I制得的重組蛋白質(zhì)，與分選酶混合，經(jīng)肽鍵的切割、連接反應(yīng)，獲得PEG修飾的蛋白質(zhì)；
[0009]步驟2中的PEG修飾劑具有式(I)所示結(jié)構(gòu):
[0010]

【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:獲得蛋白質(zhì)，在所述蛋白質(zhì)的C末端融合分選酶識(shí)別的分選基序，得重組蛋白質(zhì)； 步驟2:取PEG修飾劑、所述重組蛋白質(zhì)，與所述分選酶混合，經(jīng)肽鍵的切割、連接反應(yīng)，獲得PEG修飾的蛋白質(zhì)； 所述PEG修飾劑具有式(I)所示結(jié)構(gòu):
其中，所述m為聚合度，I≤m≤5 ;n為聚合度；110≤η≤1100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述分選酶為分選酶SrtA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述蛋白質(zhì)為生長激素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述分選基序具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟I中所述分選基序?yàn)橄率霭被嵝蛄兄械娜我庖粋€(gè): (I)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列； (II)具有SEQID NO:3所示的氨基酸序列； (III)具有SEQID N0:4所示的氨基酸序列； (IV)具有SEQID NO:5所示的氨基酸序列； (V)具有SEQID NO:6所示的氨基酸序列； (VI)具有SEQID NO:7所示的氨基酸序列； (VII)具有SEQID NO:8所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法制備獲得的PEG修飾的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PEG修飾的蛋白質(zhì)，其特征在于，其為PEG修飾的生長激素。
8.—種PEG修飾的生長激素，其特征在于，其具有如式(II)或式(III)所示的結(jié)構(gòu)中的任意一個(gè):
其中，所述hGH代表人生長激素；所述LPXT代表分選基序殘基對應(yīng)的氨基酸序列；所述LPXA代表分選基序殘基對應(yīng)的氨基酸序列；所述X為任意氨基酸；所述m為聚合度，I^ m ^ 5 ；n 為聚合度；110 ^ n ^ 1100。
9.如權(quán)利要求7或8所述的PEG修飾的生長激素在制備促進(jìn)生長的藥物、防治侏儒癥、Turner綜合征、慢性腎功能不全引起的衰竭或艾滋病引起的衰竭的藥物中的應(yīng)用。
10.一種藥物 ，其特征在于，其包括如權(quán)利要求7或8所述的PEG修飾的生長激素。
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK104130308SQ201410367156
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】王大成, 焦虎平, 李文亮, 李云輝, 楊秀云, 鄧旭明, 房恒通, 李占軍, 呂巖, 張英 申請人:吉林大學(xué)