一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法，通過直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌體作為酶源，將其與作為轉化反應底物的脫氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合進行轉化反應合成2′-脫氧腺苷，具有工藝簡單、轉化率高、生產成本低、反應條件溫和的優(yōu)點，且副產物少，綠色無污染，產物易分離純化。本發(fā)明中腺嘌呤轉化率達到72.5％以上。另外，通過采用結晶及重結晶的方法分離純化2′-脫氧腺苷，使2′-脫氧腺苷的純度達到99％以上。
【專利說明】一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，尤其涉及一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2’ -脫氧腺苷的方法。

【背景技術】
[0002]2'-脫氧腺苷(2-deoxyadenosine)是天然的脫氧核苷,是脫氧核糖核酸(DNA)的有機組成部分，也是基因藥物和基因工程研究的重要原材料，具有很好的生理活性。2'-脫氧腺苷本身有一定藥用價值，可抑制由糖誘導的胰島素釋放，并且能夠降低特異性磷酸二脂酶抑制劑或腺苷環(huán)化酶激活劑促進胰島素分泌的作用。雖未有報道其可直接用于抗病毒，但是可作為一種重要的原料，經過化學結構改造得到的2'-脫氧腺苷類似物是很多抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病核苷類藥物的良好中間體。
[0003]由于對核苷類物質的需求量也日益增加，從技術上分析，全世界的需求量在十幾噸左右。目前，多數(shù)2'-脫氧腺苷產品來自于DNA降解，但是這種傳統(tǒng)生產脫氧核苷類物質的方法會越來越局限于有限的天然資源，并且分離提取純品困難?；瘜W合成法合成2'-脫氧腺苷又存在多種問題，采用核糖或者脫氧核糖為原料則成本太高，步驟大都復雜，轉化率低，有的會產生2'-脫氧腺苷的α、β_異構體，不好分離，收率低，且需要對特定基團進行保護和去保護，不需要保護的就必須要有催化劑，而催化劑往往具有一定的毒性且價格昂貴，如汞鹽，另外，化學合成產生的一些副產物不易分解，嚴重污染環(huán)境，難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，通過直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌體作為酶源，將其與作為轉化反應底物的脫氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合進行轉化反應合成2'-脫氧腺苷。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是，通過一定的結晶與重結晶的方法對2'-脫氧腺苷進行純化，使轉化所得到的2，-脫氧腺苷的純度得到大幅度提高。
[0006]本發(fā)明的技術方案為:
[0007]—種利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法，其中，
[0008]將具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌接種產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)得到的大腸埃希氏菌菌體作為催化反應的酶源與脫氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及緩沖液按照一定的比例混合組成反應混合物，并于溫度50-55°C下進行轉化反應l_2h，得到含有所述2'-脫氧腺苷的生物轉化液；
[0009]此外，還包括以下步驟:
[0010] 步驟一、堿基去除，將所得生物轉化液離心，得到去除大腸埃希氏菌菌體的上清液，調節(jié)所得上清液的PH值為6.5-7.0后冷卻靜置15-18h，去除所析出固體物質得到去除堿基的生物轉化液；
[0011]步驟二、結晶，調節(jié)所述去除堿基的生物轉化液的pH值至10-11后冷卻靜置6-8h，分離所析出的固體物質得2'-脫氧腺苷粗品；
[0012]步驟三、重結晶，將所得2'-脫氧腺苷粗品在55_60°C下溶于一定量的20-30%乙醇溶液中制備為2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，將所制的2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液于3-4°C靜置6-8h，再次分離所析出的固體物質既得純化后的所述2'-脫氧腺苷。
[0013]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法中，所述反應混合物中的緩沖液為濃度為45-50mmol/L，pH值為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0014]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，構成所述反應混合物的各組分的配比為:脫氧胸腺喃唳核苷3-5mmol,腺嘌呤3_5mmol,大腸埃希氏菌菌體4-10g及磷酸鹽緩沖液100mL。
[0015]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述大腸埃希氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法為:
[0016]步驟一、種子培養(yǎng)，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，于35-37°C搖床上培養(yǎng)24-48h，得到種子培養(yǎng)液；
[0017]步驟二、發(fā)酵培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)液按照產酶培養(yǎng)基體積的5-8%的接種量接種于所述產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35-37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間8-10h，得到含有大腸埃希氏菌菌體的發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0018]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述產酶培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:所述產酶培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaC15-10及蒸餾水900-1000 ;所述產酶培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。
[0019]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述種子培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaC15-10及蒸餾水900-1000 ；所述種子培養(yǎng)基的PH值為7.0-7.5。
[0020]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述大腸埃希氏菌菌體的制備方法為:將所述發(fā)酵培養(yǎng)液在3-4°C條件下5000-10000rpm離心5-10min，收集沉淀得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得大腸埃希氏菌濕菌體用pH值
6.5-7.0，濃度為18-20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2_3次后，再次離心既得所述大腸埃希氏菌菌體。
[0021]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，步驟一中所述去除所析出的固體物質及步驟二和步驟三中所述分離所析出的固體物質的方法均采用抽濾的方法，所述冷卻靜置的溫度均為3-4°C。
[0022]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法中，離心所得大腸埃希氏菌菌體于_20°C左右冷凍保存?zhèn)溆?br> [0023]優(yōu)選的是，所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法中，所述大腸埃希氏菌為保藏編號是CGMCC N0.8089的大腸埃希氏菌TH-1。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果:通過直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌體作為酶源，將其與作為轉化反應底物的脫氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合進行轉化反應合成2'-脫氧腺苷，具有工藝簡單、轉化率高、生產成本低、反應條件溫和的優(yōu)點，且副產物少，一方面綠色無污染，另一方面使產物易分離純化。本發(fā)明中腺嘌呤轉化率達到72.5%以上，比化學合成法的轉化率提高20%以上。
[0025]另外，通過采用結晶及重結晶的方法分離純化2'-脫氧腺苷的生物轉化液，能夠快速有效地去除產物中的副產物，使2'-脫氧腺苷的純度達到99%以上，2'-脫氧腺苷的總收率達65.5%以上，比一般化學合成法的2'-脫氧腺苷純度及收率提高10%以上，適合2'-脫氧腺苷的大規(guī)模工業(yè)化生產。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖對本發(fā)明做詳細說明，以令本領域普通技術人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實施。
[0028]如圖1所示，一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法，其中，
[0029]將具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌接種產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)得到的大腸埃希氏菌菌體作為催化反應的酶源與脫氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及緩沖液按照一定的比例混合組成反應混合物，并于溫度50-55°C下進行轉化反應l_2h，得到含有所述2'-脫氧腺苷的生物轉化液；
[0030]此外，還包括以下步驟:
[0031] 步驟一、堿基去除，所得含有所述2'-脫氧腺苷的生物轉化液主要成分包括核糖基供體2'-脫氧胸苷、堿基供體腺嘌呤、副產物胸腺嘧啶和主產物2'-脫氧腺苷，需要通過堿基去除、結晶和重結晶的方法對所述2'-脫氧腺苷進行純化。
[0032]通過將所得生物轉化液離心，生物轉化液中的菌體得到沉淀，取上清液既得到去除大腸埃希氏菌菌體的上清液，通過滴加適量鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節(jié)所得上清液的PH值為6.5-7.0后冷卻至3-41:并靜置15-1811，雜質堿基以固體形式從所得上清液中析出，通過抽濾去除所析出固體物質得到去除堿基的生物轉化液；
[0033]步驟二、結晶，所述生物轉化液一般為中性，滴加適量氫氧化鈉溶液，在堿性范圍內調節(jié)所述去除堿基的生物轉化液的PH值至10-11后冷卻至3-4°C并靜置6-8h，2'-脫氧腺苷從所述去除堿基的生物轉化液中結晶并析出，通過抽濾分離所析出的固體物質得2，-脫氧腺苷粗品；
[0034]步驟三、重結晶，將所得2'-脫氧腺苷粗品在55_60°C下溶于一定量的20-30%乙醇溶液中，溶解過程中不斷攪拌，直至2'-脫氧腺苷粗品不再溶解為止既制備為2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，將所制的2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液于3-4°C靜置6-8h，通過抽濾再次分離所析出的固體物質既得純化后的所述2'-脫氧腺苷。
[0035]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產I' -脫氧腺苷的方法中，所述反應混合物中的緩沖液為濃度為45-50mmol/L，pH值為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0036]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，構成所述反應混合物的各組分的配比為:脫氧胸腺喃唳核苷3-5mmol,腺嘌呤3_5mmol,大腸埃希氏菌菌體
4-10g，磷酸鹽緩沖液100mL。
[0037]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述大腸埃希氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法為:
[0038]步驟一、種子培養(yǎng)，挑取一環(huán)經活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于35-37°C搖床上培養(yǎng)24_48h，得到種子培養(yǎng)液；
[0039]步驟二、發(fā)酵培養(yǎng)，使用20L自動發(fā)酵罐裝12L產酶培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)液按照產酶培養(yǎng)基體積的5-8%的接種量接種于所述產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35-37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間8-10h，得到含有大腸埃希氏菌菌體的發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0040]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述產酶培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaC15_10及蒸餾水900-1000 ;所述產酶培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5，121°C滅菌20min。
[0041]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述種子培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaC15-10及蒸餾水900-1000 ;121°C滅菌20min，所述種子培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。
[0042]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所述大腸埃希氏菌菌體的制備方法為:將所述發(fā)酵培養(yǎng)液在3-4°C條件下5000-10000rpm離心5_10min，收集沉淀得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得大腸埃希氏菌濕菌體用PH值6.5-7.0,濃度為18-20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2_3次后，再次離心既得所述大腸埃希氏菌菌體，所述大腸埃希氏菌菌體可于_20°C左右冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0043]所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法中，所采用大腸埃希氏菌為保藏編號是CGMCC N0.8089的大腸埃希氏菌TH-1 JiTSSEscherichia coli，該菌株具有高核苷磷酸化酶活性，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2013年8月30日。
[0044]實施例1
[0045]I)種子培養(yǎng)
[0046]取一環(huán)經活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種，接種于500ml三角瓶中，于37°C下?lián)u床上培養(yǎng)28h，種子培養(yǎng)基組成為:酵母膏5.2g，蛋白胨11.5g，NaC15.5g 及蒸餾水 100mL, 121°C滅菌 20min, pH 值 7.0。
[0047]2)發(fā)酵培養(yǎng)及菌體制備
[0048]使用20L自動發(fā)酵罐裝12L產酶培養(yǎng)基，按照產酶培養(yǎng)基體積的6%的接種量接種大腸埃希氏菌種子培養(yǎng)液，在37°C下培養(yǎng)8h,然后在4°C條件下6000rpm離心8min,得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得濕菌體用PH值7.0，濃度為20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心得到所需的大腸埃希氏菌菌體，于-20°C冷凍保存?zhèn)溆?。產酶培養(yǎng)基組成為:牛肉膏 12g，酵母膏 Hg，蛋白胨 6.8g，NaC17.3g 及蒸餾水 100mL, 121。。滅菌 20min，pH 值 7.5。
[0049]3)轉化
[0050]將0.35mmol脫氧胸腺嘧啶核苷，0.35mmol腺嘌呤，大腸埃希氏菌菌體5g，1mL濃度為50mmol/L，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液混合作為反應混合物，在55°C的恒溫水浴槽中反應，反應時間為lh，得到生物轉化液。
[0051]4)堿基去除
[0052]將所得生物轉化液室溫下4000離心10min，除去生物轉化液中菌體，得到上清液，調節(jié)所得上清液PH值為7.0，冷卻至4°C并靜置15h，雜質堿基以固體形式析出，抽濾分離析出的雜質堿基，得到去除堿基的生物轉化液。
[0053]5)結晶
[0054]在堿性范圍內調節(jié)去除堿基的生物轉化液的pH值至10.5，冷卻至4°C并靜置6h，所述2'-脫氧腺苷結晶并析出，抽濾分離析出的固體物質既得2'-脫氧腺苷粗品。
[0055]6)重結晶
[0056]以20%乙醇溶液為溶劑，在60°C溫度下將所得2'-脫氧腺苷粗品進行溶解，溶解過程中不斷攪拌，直至2'-脫氧腺苷粗品不再溶解既制成2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，冷卻至4°C靜置8h，2'-脫氧腺苷重結晶，得到純度為99.23%的2'-脫氧腺苷純品。
[0057]實施例2
[0058]I)種子培養(yǎng)
[0059]取一環(huán)經活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種，接種于500ml三角瓶中，于37°C下?lián)u床上培養(yǎng)36h，種子培養(yǎng)基組成為:酵母膏6g，蛋白胨12.5g，NaC17.5g及蒸餾水 100mL, 121°C滅菌 20min, pH 值 7.2。
[0060]2)發(fā)酵培養(yǎng)及菌體制備
[0061] 使用20L自動發(fā)酵罐裝12L產酶培養(yǎng)基，按照產酶培養(yǎng)基體積的6%的接種量接種大腸埃希氏菌種子培養(yǎng)液，在37°C下培養(yǎng)9h,然后在4°C條件下5000rpm離心1min,得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得濕菌體用PH值7.0，濃度為20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌3次，離心得到所需的大腸埃希氏菌菌體，于-20°C冷凍保存?zhèn)溆?。產酶培養(yǎng)基組成為:牛肉膏 10g，酵母膏 12g，蛋白胨 8g，NaC16.8g 及蒸餾水 100mL, 121。。滅菌 20min，pH 值 7.5。
[0062]3)轉化
[0063]將0.3mmol脫氧胸腺嘧唳核苷,0.4mmol腺嘌呤,大腸埃希氏菌菌體6g, 1mL濃度為50mmol/L，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液混合作為反應混合物，在55°C的恒溫水浴槽中反應，反應時間為1.5h，得到生物轉化液。
[0064]4)堿基去除
[0065]將所得生物轉化液室溫下5000離心7min，除去生物轉化液中菌體，得到上清液，調節(jié)所得上清液PH值為7.0，冷卻至4°C并靜置18h，雜質堿基以固體形式析出，抽濾分離析出的雜質堿基，得到去除堿基的生物轉化液。
[0066]5)結晶
[0067]在堿性范圍內調節(jié)去除堿基的生物轉化液的pH值至10.5，冷卻至4°C并靜置8h，所述2'-脫氧腺苷結晶并析出，抽濾分離析出的固體物質既得2'-脫氧腺苷粗品。
[0068]6)重結晶
[0069]以25%乙醇溶液為溶劑，在60°C溫度下將所得2'-脫氧腺苷粗品進行溶解，溶解過程中不斷攪拌，直至2'-脫氧腺苷粗品不再溶解既制成2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，冷卻至4°C靜置，2'-脫氧腺苷重結晶，得到純度為99.18%的2'-脫氧腺苷純品。
[0070]實施例3
[0071]I)種子培養(yǎng)
[0072]取一環(huán)經活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種，接種于500ml三角瓶中，于37°C下?lián)u床上培養(yǎng)40h，種子培養(yǎng)基組成為:酵母膏8.2g，蛋白胨14.1g,NaC17.3g 及蒸餾水 100mL, 121°C滅菌 20min, pH 值 7.3。
[0073]2)發(fā)酵培養(yǎng)及菌體制備
[0074]使用20L自動發(fā)酵罐裝12L產酶培養(yǎng)基，按照產酶培養(yǎng)基體積的7%的接種量接種大腸埃希氏菌種子培養(yǎng)液，在37°C下培養(yǎng)1h,然后在4°C條件下8000rpm離心7min,得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得濕菌體用PH值7.0，濃度為20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心得到所需的大腸埃希氏菌菌體，于-20°C冷凍保存?zhèn)溆?。產酶培養(yǎng)基組成為:牛肉膏 12.6g，酵母膏 13.Sg，蛋白胨 7.5g，NaC18.5g 及蒸餾水 lOOOmL，121。。滅菌 20min, pH 值
7.5。
[0075]3)轉化
[0076]將0.4mmol脫氧胸腺嘧唳核苷,0.4mmol腺嘌呤,大腸埃希氏菌菌體7g, 1mL濃度為50mmol/L，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液混合作為反應混合物，在55°C的恒溫水浴槽中反應，反應時間為1.5h，得到生物轉化液。
[0077]4)堿基去除
[0078]將所得生物轉化液室溫下6000離心8min，除去生物轉化液中菌體，得到上清液，調節(jié)所得上清液PH值為7.0，冷卻至4°C并靜置16h，雜質堿基以固體形式析出，抽濾分離析出的雜質堿基，得到去除堿基的生物轉化液。
[0079]5)結晶
[0080]在堿性范圍內調節(jié)去除堿基的生物轉化液的pH值至10.5，冷卻至4°C并靜置8h，所述2'-脫氧腺苷結晶并析出，抽濾分離析出的固體物質既得2'-脫氧腺苷粗品。
[0081]6)重結晶
[0082]以30%乙醇溶液為溶劑，在60°C溫度下將所得2'-脫氧腺苷粗品進行溶解，溶解過程中不斷攪拌，直至2'-脫氧腺苷粗品不再溶解既制成2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，冷卻至4°C靜置，2'-脫氧腺苷重結晶，得到純度為99.52%的2'-脫氧腺苷純品。
[0083]實施例4
[0084]1)種子培養(yǎng)
[0085]取一環(huán)經活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種，接種于500ml三角瓶中，于37°C下?lián)u床上培養(yǎng)48h，種子培養(yǎng)基組成為:酵母膏7.9g，蛋白胨12.5g，NaC18.3g 及蒸餾水 100mL, 121°C滅菌 20min, pH 值 7.5。
[0086]2)發(fā)酵培養(yǎng)及菌體制備
[0087]使用20 L自動發(fā)酵罐裝12L產酶培養(yǎng)基，按照產酶培養(yǎng)基體積的8%的接種量接種大腸埃希氏菌種子培養(yǎng)液，在37°C下培養(yǎng)1h,然后在4°C條件下1000rpm離心5min,得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得濕菌體用PH值7.0，濃度為20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌3次，離心得到所需的大腸埃希氏菌菌體，于-20°C冷凍保存?zhèn)溆?。產酶培養(yǎng)基組成為:牛肉膏 15g，酵母膏 13g，蛋白胨 10g，NaCllOg 及蒸餾水 100mL, 121。。滅菌 20min，pH 值 7.5。
[0088]3)轉化
[0089]將0.5mmol脫氧胸腺嘧啶核苷，0.5mmol腺嘌呤，大腸埃希氏菌菌體6g，1mL濃度為50mmol/L，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液混合作為反應混合物，在55°C的恒溫水浴槽中反應，反應時間為2h，得到生物轉化液。
[0090]4)喊基去除
[0091]將所得生物轉化液室溫下6000離心8min，除去生物轉化液中菌體，得到上清液，調節(jié)所得上清液PH值為7.0，冷卻至4°C并靜置17h，雜質堿基以固體形式析出，抽濾分離析出的雜質堿基，得到去除堿基的生物轉化液。
[0092]5)結晶
[0093]在堿性范圍內調節(jié)去除堿基的生物轉化液的pH值至10.5，冷卻至4°C并靜置6h，所述2'-脫氧腺苷結晶并析出，抽濾分離析出的固體物質既得2'-脫氧腺苷粗品。
[0094]6)重結晶
[0095]以30%乙醇溶液為溶劑，在60°C溫度下將所得2'-脫氧腺苷粗品進行溶解，溶解過程中不斷攪拌，直至2'-脫氧腺苷粗品不再溶解既制成2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，冷卻至4°C靜置，2'-脫氧腺苷重結晶，得到純度為99.36%的2'-脫氧腺苷純品。
[0096]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于， 將具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌接種產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)得到的大腸埃希氏菌菌體作為催化反應的酶源與脫氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及緩沖液按照一定的比例混合組成反應混合物，并于溫度50-55°C下進行轉化反應l_2h，得到含有所述2'-脫氧腺苷的生物轉化液； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、堿基去除，將所得生物轉化液離心，得到去除大腸埃希氏菌菌體的上清液，調節(jié)所得上清液的PH值為6.5-7.0后冷卻靜置15-18h，去除所析出固體物質得到去除堿基的生物轉化液； 步驟二、結晶，調節(jié)所述去除堿基的生物轉化液的pH值至10-11后冷卻靜置6-8h，分離所析出的固體物質得2，-脫氧腺苷粗品； 步驟三、重結晶，將所得2'-脫氧腺苷粗品在55-60°C下溶于一定量的20-30%乙醇溶液中制備為2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，將所制的2'-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液于3-4°C靜置6-8h，再次分離所析出的固體物質既得純化后的所述2'-脫氧腺苷。
2.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述反應混合物中的緩沖液為濃度為45-50mmol/L，pH值為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液。
3.如權利要求2所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，構成所述反應混 合物的各組分的配比為:脫氧胸腺喃唳核苷3-5mmol,腺嘌呤3_5mmol,大腸埃希氏菌菌體4-10g及磷酸鹽緩沖液100mL。
4.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法為: 步驟一、種子培養(yǎng)，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，于35-37°C搖床上培養(yǎng)24-48h，得到種子培養(yǎng)液； 步驟二、發(fā)酵培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)液按照產酶培養(yǎng)基體積的5-8%的接種量接種于所述產酶培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35-37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間8-10h，得到含有大腸埃希氏菌菌體的發(fā)酵培養(yǎng)液。
5.如權利要求4所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述產酶培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaC15-10及蒸餾水900-1000 ;所述產酶培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。
6.如權利要求4所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基包含以下重量份的組分:酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaC15-10及蒸餾水900-1000 ;所述種子培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。
7.如權利要求4所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌菌體的制備方法為:將所述發(fā)酵培養(yǎng)液在3-4 °C條件下5000-10000rpm離心5_10min,收集沉淀得到大腸埃希氏菌濕菌體,將所得大腸埃希氏菌濕菌體用PH值6.5-7.0，濃度為18-20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2_3次后，再次離心既得所述大腸埃希氏菌菌體。
8.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2，-脫氧腺苷的方法，其特征在于，步驟一中所述去除所析出的固體物質及步驟二和步驟三中所述分離所析出的固體物質的方法均采用抽濾的方法；所述冷卻靜置的溫度均為3-4°C。
9.如權利要求7所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，離心所得大腸埃希氏菌菌體于-20°C左右冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 10.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2'-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌 為保藏編號是CGMCC N0.8089的大腸埃希氏菌TH-1。
【文檔編號】C07H1/06GK104178541SQ201410387566
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2013年11月6日
【發(fā)明者】張春穎, 楊旭錦 申請人:西藏天虹科技股份有限責任公司