一種長春堿的提取及純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長春堿的提取及純化方法，包括：將長春花進(jìn)行鹽津、冷凍干燥預(yù)處理；預(yù)處理的原料酸性提取，然后萃取加硫酸得硫酸長春堿粗品；將硫酸長春堿粗品堿化萃取、水洗、上硅膠柱分離、結(jié)晶，得長春堿純品。本發(fā)明步驟簡潔、耗用時(shí)間少，先對長春花進(jìn)行預(yù)處理再進(jìn)行提取，即可以除掉長春花部分溶于水的色素雜質(zhì)，又使長春花細(xì)胞壁破碎，更利于產(chǎn)品的溶出。通過對提取步驟和條件的選擇，提高了粗品的得率和含量，通過對各提取試劑、萃取試劑、洗脫試劑和結(jié)晶試劑的選擇，提高了長春堿的收率和純度，通過一次結(jié)晶即可得到長春堿純品，簡化了純化過程，更為快速的實(shí)現(xiàn)了長春堿的分離和純化，且最終得到的產(chǎn)品純度高，更為滿足臨床需求。
【專利說明】一種長春堿的提取及純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從長春花中提取并分離純化長春堿的方法，屬于藥物提取技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 長春花是夾竹桃科長春花屬一種重要的藥用植物，原產(chǎn)南亞、非洲東部及美洲熱 帶。長春花全草入藥可止痛、消炎、安眠、通便及利尿，全株具有毒性，誤食后會造成白血球 減少、血小板減少、肌肉無力、四肢麻痹等癥狀。長春花中含有幾十種吲哚類生物堿，長春堿 是其中的一種，具有抗癌的作用，為臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，具有很高的藥用價(jià)值， 國內(nèi)外對其提取分離的研究由來已久。但是由于長春花中含有幾十種生物堿，長春堿含量 很低，僅為萬分之幾，提取并初步成鹽后的硫酸長春堿粗品含量僅60%左右，無法滿足使用 要求，需要對其進(jìn)一步純化。
[0003] 目前報(bào)道的長春堿的提取方法有溶劑提取法、超臨界萃取法、超聲波提取法等，分 離方法有TLC法、柱色譜法、高效逆流色譜法等。這些方法各有自己的優(yōu)勢和缺點(diǎn)，如果能 對這些方法進(jìn)行改進(jìn)和結(jié)合，提高長春堿的提取率和純度，將會更有利于其工業(yè)化應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種長春堿的提取及純化方法，該方法對長春堿的提取和分離純化 方法都進(jìn)行了改進(jìn)，所得長春堿提取率高、純度高。
[0005] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 一種長春堿的提取及純化方法，包括以下步驟： (1)取長春花，用15-25wt%的氯化鈉水溶液超聲浸泡15min，然后取出直接放入流速為 5-8m/s的-20°C的冷空氣中冷凍干燥20min，冷凍干燥后將長春花粉碎。
[0006] (2)將步驟（1)的長春花加入30體積％乙醇中，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH為1.5,回流提 取，過濾取濾液，將濾液用氫氧化鈉調(diào)整pH為8-9,然后以噴霧的形式從萃取罐頂部噴入， 同時(shí)將萃取劑以噴霧的形式從萃取罐的底部噴入，噴入完畢萃取收集有機(jī)相；所述萃取劑 為體積比為10:1-2. 5的三氯乙烯和己烷的混合物； (3) 有機(jī)相減壓除去溶劑，固體用乙醇完全溶解，加濃度5wt%的硫酸的乙醇溶液調(diào)節(jié) pH為3. 8,離心、干燥得硫酸長春堿粗品； (4) 將硫酸長春堿粗品用水溶解，加飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH為8-9,加入二氯甲烷 萃取，二氯甲烷有機(jī)相用水洗滌直至洗滌后的水相透明無色，收集水洗后的有機(jī)相，減壓蒸 餾除去二氯甲烷，所得剩余物上硅膠柱，用體積比為90 :10?98 :2的二氯甲烷與甲醇氨 飽和溶液的混合物作為流動相進(jìn)行洗脫，收集無色流份，將流份減壓蒸餾至干，所得固體加 入體積比為9 :0.3-0.8 :1-3的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常溫超聲5min，然后 在-HTC低溫靜置24h，所得晶體在-KTC低溫抽濾，-KTC凍干，得長春堿純品。
[0007] 上述步驟（1)中，長春花與氯化鈉水溶液的質(zhì)量比為I:9-10。
[0008] 上述步驟（I)中，氯化鈉溶液的濃度優(yōu)選為20wt%。
[0009] 上述步驟（2)中，長春花與30體積％乙醇的質(zhì)量比為1:4-6,回流提取的時(shí)間為 2_3h。
[0010] 上述步驟（2)中，濾液與萃取劑的體積比為3. 5:1?6:1，優(yōu)選4. 7:1。
[0011] 上述步驟（2)中，濾液噴入萃取罐的速度為188-240ml/s，濾液和萃取劑同一時(shí)間 噴完。
[0012] 上述步驟（2)中，三氯乙烯和己烷的體積比優(yōu)選為10:1. 75。
[0013] 上述步驟（3)中，固體與乙醇的質(zhì)量比優(yōu)選為1:0. 8。
[0014] 上述步驟（4)中，對二氯甲烷有機(jī)相進(jìn)行水洗時(shí)，水洗用水與二氯甲烷有機(jī)相的質(zhì) 量比為1:1-2。
[0015] 上述步驟（4)中，所述甲醇氨飽和溶液是向甲醇中通入氨氣直至有氨氣溢出所形 成的氨氣飽和的甲醇溶液。
[0016] 上述步驟（4)中，硅膠的目數(shù)為200-300目，剩余物與硅膠的質(zhì)量比為1:10-20,優(yōu) 選1:15,洗脫溫度為16-25°c，流動相流速為3-5ml/min。
[0017] 上述步驟（4)中，流份減壓蒸餾所得的固體質(zhì)量與甲醇、石油醚、乙酸乙酯總體積 的比值為Ig:3. 5_8ml，優(yōu)選Ig:5ml。
[0018] 上述步驟（4)中，二氯甲烷與甲醇氨飽和溶液的體積比優(yōu)選為97 :3。
[0019] 上述步驟（4)中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為9:0. 5:1. 7。
[0020] 本發(fā)明以長春花為起始原料，先通過提取并初步成鹽后得到硫酸長春堿粗品，再 通過純化得到純度高的長春堿產(chǎn)品。本發(fā)明方法中，在起始階段，先通過鹽浸-冷凍干燥對 長春花進(jìn)行預(yù)處理，不僅可以除掉長春花部分溶于水的色素雜質(zhì)，而且可以使長春花細(xì)胞 壁破碎，更利于下步產(chǎn)品的溶出。然后在酸性條件下乙醇提取、堿性條件下萃取，萃取劑和 乙醇提取液以噴霧的形式接觸，大大提高了萃取效率，并且通過對萃取劑的調(diào)配，提高了 長春堿的含量及得率。采用本發(fā)明提取方法所得粗品中長春堿的含量可達(dá)80%以上。所得 粗品采用堿化萃取、水洗+硅膠柱分離+結(jié)晶的方式進(jìn)行純化。堿化萃取水洗后，可以除掉 粗品中水溶性的多糖及色素等組分，更有利于產(chǎn)品下步的純化。柱分離階段采用二氯甲烷 與甲醇氨飽和溶液的混合物作為流動相，流動性的選擇使分離效果更明顯，有效成分得到 很好的純化，收率也得到提高。最后將產(chǎn)品放入甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中進(jìn)行結(jié) 晶，結(jié)晶前先進(jìn)行超聲處理，以使晶粒形貌更為均勻，一次結(jié)晶后所得長春堿產(chǎn)品純度和收 率均較高，無需多次重復(fù)結(jié)晶，大大減少了產(chǎn)品的損失。
[0021] 本發(fā)明步驟簡潔、耗用時(shí)間少，先對長春花進(jìn)行預(yù)處理再進(jìn)行提取，不僅可以除掉 長春花部分溶于水的色素雜質(zhì)，而且可以使長春花細(xì)胞壁破碎，更利于下步產(chǎn)品的溶出。通 過對提取步驟和條件的選擇，提高了硫酸長春堿粗品的得率和含量，通過對各提取試劑、萃 取試劑、洗脫試劑和結(jié)晶試劑的選擇，提高了長春堿的收率和純度，通過一次結(jié)晶即可得到 長春堿純品，簡化了純化過程，更為快速的實(shí)現(xiàn)了長春堿的分離和純化，且最終得到的產(chǎn)品 純度高，更為滿足臨床需求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為所得產(chǎn)品的高效液相色譜圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明提取所得長春堿的核磁譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該明白的是，下述說明僅是 為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0025] 本發(fā)明中，長春堿的含量測定方法為：高效液相色譜法，高效液相色譜的條件如 下： 色譜柱：PhenomenexPRODIGY0DS3-C18 柱（250.OmmX4. 6mm, 5μm); 流動相：體積比68:6. 4:25. 6的磷酸緩沖鹽一甲醇一乙腈為流動相；磷酸緩沖鹽配制 方法是：取6. 8g磷酸二氫鉀與IOml的三乙胺，混合后加水補(bǔ)至1000ml，然后用磷酸調(diào)至 ρΗ4· 2,制得。
[0026]柱溫：30°C; 波長：262nm; 流速：1. 5ml/min〇
[0027] 下述實(shí)施例中，得率的計(jì)算方法為：得率=所得硫酸長春堿粗品或長春堿純品的 質(zhì)量/長春花的總質(zhì)量。
[0028] 下述實(shí)施例中，乙醇的濃度均為體積濃度，其他試劑的濃度均為質(zhì)量濃度。
[0029] 實(shí)施例1 以長春花(鮮）為原料，按照下述方法提取分離硫酸長春堿： 1、提取硫酸長春喊粗品： (1)取IOOkg長春花，加入900kg20%的氯化鈉水溶液中，超聲浸泡15min，然后將長春 花取出直接放入流速為6m/s的-20°C的冷空氣中冷凍干燥20min，冷凍干燥后將長春花粉 碎。
[0030] (2)將步驟（1)處理后的長春花加入500kg30%的乙醇中，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH為1.5， 回流提取2h，過濾取濾液，濾液用氫氧化鈉調(diào)整pH為8-9,調(diào)整好pH后，將濾液加高壓，以 噴霧的形式從萃取罐頂部噴入，速度為200ml/s，同時(shí)將萃取劑也加高壓，以噴霧的形式從 萃取罐的底部噴入，濾液與萃取劑的體積比為4. 7 :1,濾液和萃取劑同時(shí)噴入萃取罐，同時(shí) 噴完，噴入完畢萃取收集有機(jī)相；所述萃取劑為體積比為10:1. 75的三氯乙烯和己烷的混 合物。
[0031] (3)將有機(jī)相減壓蒸饋，所得剩余物約200g，將剩余物加入乙醇200ml溶解，然后 加入濃度為5%的硫酸的乙醇溶液調(diào)節(jié)pH為3. 8,有漿狀物沉淀出現(xiàn)，離心、干燥得硫酸長春 堿粗品11. 2g，經(jīng)計(jì)算，硫酸長春堿的得率為0. 112%。，經(jīng)HPLC檢測，粗品中硫酸長春堿含量 為 84. 3%。
[0032] 2、分離純化硫酸長春堿： 將上述11. 2g硫酸長春堿粗品用50ml水溶解，加入飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH為8-9， 加入150ml二氯甲烷萃取，得有機(jī)相，所得有機(jī)相加入IOOml高純水洗漆，直至洗滌后的 水相透明無色，取水洗后的有機(jī)相，將其減壓蒸餾除去溶劑，所得產(chǎn)物l〇g，將該產(chǎn)物上 200-300目的硅膠柱，產(chǎn)物與硅膠的質(zhì)量比為1:15,用體積比為97:3的二氯甲烷與甲醇氨 飽和溶液（甲醇氨飽和溶液是向甲醇中通入氨氣直至有氨氣溢出所形成的氨氣飽和的甲醇 溶液)的混合溶劑作為流動相進(jìn)行洗脫，洗脫溫度為18-20°C，流動相流速為3-5ml/min。收 集無色流份，減壓蒸餾得7.Sg固體。將所得固體加入39ml體積比為9 :0. 5 :1. 7的甲醇、石 油醚和乙酸乙酯的混合液中，常溫超聲5min，然后在-KTC下低溫靜置24h后，在-KTC下低 溫抽濾，-KTC凍干得長春堿6. 3g。
[0033] 圖1為所得產(chǎn)品的高效液相色譜圖，其圖譜分析結(jié)果如下表，從表中可以看出，本 發(fā)明所得長春堿純品中，長春堿純度為99. 8%。

【權(quán)利要求】
1. 一種長春堿的提取及純化方法，其特征是包括以下步驟： (1) 取長春花，用15-25wt%的氯化鈉水溶液超聲浸泡15min，然后取出直接放入流速為 5-8m/s的-20°C的冷空氣中冷凍干燥20min，冷凍干燥后將長春花粉碎； (2) 將步驟（1)的長春花加入30體積％乙醇中，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH為1. 5,回流提取，過 濾取濾液，將濾液用氫氧化鈉調(diào)整pH為8-9,然后以噴霧的形式從萃取罐頂部噴入，同時(shí)將 萃取劑以噴霧的形式從萃取罐的底部噴入，噴入完畢萃取收集有機(jī)相；所述萃取劑為體積 比為10:1-2. 5的三氯乙烯和己烷的混合物； (3) 有機(jī)相減壓除去溶劑，固體用乙醇完全溶解，加濃度5wt%的硫酸的乙醇溶液調(diào)節(jié) pH為3. 8,離心、干燥得硫酸長春堿粗品； (4) 將硫酸長春堿粗品用水溶解，加飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH為8-9,加入二氯甲烷 萃取，二氯甲烷有機(jī)相用水洗滌直至洗滌后的水相透明無色，收集水洗后的有機(jī)相，減壓蒸 餾除去二氯甲烷，所得剩余物上硅膠柱，用體積比為90 :10?98 :2的二氯甲烷與甲醇氨 飽和溶液的混合物作為流動相進(jìn)行洗脫，收集無色流份，將流份減壓蒸餾至干，所得固體加 入體積比為9 :0.3-0.8 :1-3的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常溫超聲5min，然后 在-l〇°C低溫靜置24h，所得晶體在-10°C低溫抽濾，-10°C凍干，得長春堿純品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（1)中，長春花與氯化鈉水 溶液的質(zhì)量比為1 :9_10。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（2)中，長春花與30體積％ 乙醇的質(zhì)量比為1:4-6,回流提取的時(shí)間為2-3h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（2)中，濾液與萃取劑的體 積比為3. 5:1?6:1，優(yōu)選4. 7:1 ;濾液噴入萃取罐的速度為188-240ml/s，濾液和萃取劑同 一時(shí)間噴完。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（4)中，流份減壓蒸餾所得 的固體質(zhì)量與甲醇、石油醚、乙酸乙酯總體積的比值為lg :3. 5-8ml，優(yōu)選lg :5ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（4)中，硅膠的目數(shù)為 200-300目，剩余物與硅膠的質(zhì)量比為1:10-20,優(yōu)選1:15,洗脫溫度為16-25°C，流動相流 速為 3_5ml/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（4)中，對二氯甲烷有機(jī)相 進(jìn)行水洗時(shí)，水洗用水與二氯甲烷有機(jī)相的質(zhì)量比為1:1-2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的提取及純化方法，其特征是：步驟（1)中，氯化鈉 溶液的濃度為20wt%;步驟（2)中，三氯乙烯和己烷的體積比為10:1.75 ;步驟（3)中，固體 與乙醇的質(zhì)量比為1:0. 8 ;步驟（4)中，二氯甲烷與甲醇氨飽和溶液的體積比為97 :3 ;步驟 (4)中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的體積比為9:0. 5:1. 7。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的提取及純化方法，其特征是：所述甲醇氨飽和溶 液是向甲醇中通入氨氣直至有氨氣溢出所形成的氨氣飽和的甲醇溶液。
【文檔編號】C07D519/04GK104262362SQ201410439509
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】王洪磊, 張永明, 孫中亮 申請人:海南希源化工科技有限公司