金花茶皂苷a標準品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明以金花茶葉、枝、花為原料，乙醇-水為浸提劑，通過超聲波浸提、大孔吸附樹脂柱吸附、柱層析分離、液相色譜分離等步驟制成金花茶皂苷A標準品。本發(fā)明制得的標準品性能穩(wěn)定，檢測精度高，可作為化學(xué)對照品，用于金花茶系列產(chǎn)品品質(zhì)鑒別指標性成分，為質(zhì)量監(jiān)督、產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別提供技術(shù)支撐。
【專利說明】金花茶皂苷A標準品及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種從金花茶葉中提取金花茶皂苷 A標準品及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)是山茶科，山茶屬，金花茶組，金花茶系 植物。為常綠灌木或小喬木。主產(chǎn)于中國廣西防城港市境內(nèi)，金花茶是防城港市特色資源 之一，素有"茶皇后"、"植物界大熊貓"的美譽，2009年防城港市防城區(qū)被命名為"中國金 花茶之鄉(xiāng)"，2010年被國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局授權(quán)為國家地理標志保護產(chǎn)品，防城港市立 足本地金花茶資源優(yōu)勢，扎實推進金花茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，促進農(nóng)民增收。近年來金花茶產(chǎn)業(yè) 發(fā)展取得了明顯成效，人工種植金花茶面積達到3萬畝，育苗300萬株，有十幾家企業(yè)利用 金花茶花和葉研制有金花茶袋包茶、飲料、口服液等近30多個系列產(chǎn)品，產(chǎn)值達6個多億。
[0003] 在金花茶皂苷【技術(shù)領(lǐng)域】， 申請人:檢索到如下兩篇相關(guān)的技術(shù)文獻：
[0004] 文獻1 :題名：《金花茶葉皂苷類成分研究》，作者：蘇琳，莫建光，韋英亮等；刊物： 《中草藥》，2012, 43 (5)，877-879。
[0005] 該文獻研究了金花茶Camellia&nbsp ;euphlebia葉阜苷類成分。方法利用超聲提 取、大孔樹脂富集以及制備色譜對金花茶葉水溶性部分進行分離純化，運用NMR、MS、IR等 光譜手段進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果分離得到3個單體化合物，分別為人參皂苷Rgl(I)、人參皂 苷Fl (2)和人參皂苷F5 (3)。結(jié)論化合物1?3均為首次從該植物中分離得到的人參皂苷， 其中人參皂苷Rgl、F5為首次從山茶屬中分離得到。金花茶為國家一級保護的珍稀藥用植 物，這些成分的分離鑒定對其進一步的活性研究、開發(fā)利用和推廣種植具有重要意義。但 該文獻分離得到的人參皂苷Rgl(I)、人參皂苷Fl (2)和人參皂苷F5 (3)三種化合物均是前 人研究已經(jīng)定性的化合物，其藥理活性和用途已有很多報道。
[0006] 文獻2 :題名：《金花茶皂甙的分離純化及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究》；作者：曾秋文；刊物：廣 東海洋大學(xué)碩士論文，2010年。
[0007] 該文獻研究以金花茶葉為實驗材料提取其中的皂甙成分，然后篩選分離純化樹 月旨，對皂甙進行分離純化。通過抗氧化指標比較皂甙組分的抗氧化活性，并對抗氧化活性 最高的皂甙組分進行進一步的分離純化，分析其理化性質(zhì)，為金花茶皂甙的構(gòu)效關(guān)系研究 提供理論依據(jù)。
[0008] 研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
[0009] 1、以新鮮金花茶葉為原料，經(jīng)過微波滅酶后進行組織破碎，采用超聲波浸提及納 米超濾等方法進行提取和濃縮，得到金花茶濃縮液。金花茶濃縮液經(jīng)過乙醇沉淀去雜、乙 醚脫色得到粗皂甙提取液。試驗結(jié)果顯示金花茶粗皂甙提取液中主要含有皂甙并含有少量 的茶多酚，皂甙含量約為茶多酚的10倍。
[0010] 2、通過靜態(tài)吸附率和解吸率等指標比較了聚酰胺樹脂、XAD16、DM130和XAD1600 等4種樹脂對金花茶粗皂甙分離的效果，并選擇XAD16作為分離樹脂對金花茶粗皂甙進 行分離純化。分離純化結(jié)果：在水以及和30%異丙醇洗脫液處分別得到了 WS、 151、 IS2、IS3等4個皂甙組分。各皂甙組分的得率分別為34. 8%、9. 1%、20. 3%、31.8%， 皂甙總得率達96.0%。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，相對于粗皂甙，各皂甙組分的吸收峰 數(shù)量明顯減少，表明XAD16大孔吸附樹脂層析柱可以有效將金花茶粗皂甙分離出極性不同 的皂甙組分。
[0011] 3、以維生素 C為參照物，通過羥基自由基清除試驗、超氧陰離子清除試驗、 DPPH ?自由基清除試驗、磷鑰絡(luò)合物法等4種不同的抗氧化試驗，比較了粗皂甙、WS、IS1、 152、 IS3等皂甙組分的抗氧化活性。結(jié)果顯示，各皂甙組分均有明顯的抗氧化活性，在 清除羥基自由基實驗中，ISl的清除率為66. 5 %，比維生素 C及其他三個皂甙組分高；在 DPPH ?自由基清除試驗中，ISl的清除率為96. 3%，接近同濃度維生素 C的清除率100% ; 在清除超氧陰離子的實驗中，ISl的清除率達到64. 7%，比皂甙組分IS2、IS3高；在磷鑰 絡(luò)合物法實驗中，ISl的抗氧化活性比皂甙組分IS2、IS3高37. 1%、39. 8%，可以看出ISl 的抗氧化活性較為顯著。
[0012] 4、通過XAD1600柱層析和聚酰胺柱層析對抗氧化活性最高的皂甙組分ISl進行 進一步的分離純化，得到ISlA皂甙組分。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，ISlA出現(xiàn)唯一一 個尖銳的峰，表明ISlA為單一化合物?？寡趸钚苑治鼋Y(jié)果顯示，ISlA的抗氧化活性較 ISl高出10%左右，表明ISlA是主要的功效因子。顏色反應(yīng)及構(gòu)成糖薄層層析分析結(jié)果 顯示，ISlA是含有葡萄糖和半乳糖的三萜類皂甙。對于具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)有待進一步分析。
[0013] 但是該文獻的研究因其工藝比較粗糙，雖然得到了 WS、ISl、IS2、IS3等4個皂甙 組分，但因其組分比較復(fù)雜，純度不夠，無法確定其組分的具體成分和結(jié)構(gòu)。
[0014] 但金花茶系列產(chǎn)品的質(zhì)量標準仍然參照茶葉的技術(shù)參數(shù)來監(jiān)控，沒有建立起特征 的指標性成分來鑒別金花茶產(chǎn)品的技術(shù)標準。針對目前沒有金花茶產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)標準缺指 標性成分的現(xiàn)狀，我們對金花茶的化學(xué)成分進行了深入研究，首次從金花茶葉分離出了 30 多個化學(xué)成分，從中篩選出一個具有生物活性的新化合物-金花茶皂苷A，該新化合物可作 為化學(xué)對照品，用于金花茶系列產(chǎn)品品質(zhì)鑒別指標性成分，為質(zhì)量監(jiān)督、產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別提 供技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 申請人:同日申請的另一個發(fā)明專利《金花茶皂苷A及其制備方法和抗腫瘤用途》 公開了從金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)中分離出的新的金花茶阜苷A化合物 及其制備方法，但該方法獲得的金花茶皂苷A純度不夠高，無法將其用作標準品來鑒別金 花茶系列產(chǎn)品的品質(zhì)和進行質(zhì)量監(jiān)控，本發(fā)明的目的是針對前述問題，提供了一種金花茶 皂苷A標準品及其制備方法。
[0016] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0017] 金花茶皂苷A標準品，其化學(xué)名稱為：（3 P，6 a，12 P )-3, 6, 12-三羥基 達瑪烷-24-烯-20-甲基-2H -D-吡喃葡萄糖-(2 - DH -D-吡喃葡萄 糖-(2 - I) -0- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種金花茶皂苷A標準品，其特征在于：所述的金花茶皂苷A化學(xué)名稱為： (3 3,6a，123) -3, 6，12-二輕基達瑪燒-24-稀-20 -甲基K- P 批喃甸萄 糖-(2 - 1) -0- P -D-吡喃葡萄糖-(2 - 1) -0- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
該金花茶皂苷A標準品為白色針狀晶體；其純度彡98. 5%;溶解性：溶于甲醇、乙醇， 微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；灰分：彡〇. 1% ;重金屬（以pb計）：彡5. 0 mg/Kg ;水分： 彡0. 4% ;熔點范圍：192. 3°C?195. 6°C ;有關(guān)物質(zhì)：彡2. 0% ;其分子式為：C48H82018 ;分子量 為：946。
2. -種如權(quán)利要求1所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：將新鮮金 花茶原料預(yù)處理后，按照金花茶原料：純凈水：復(fù)合果漿酶物料比為1:4?6 :0. 0005進行 超聲波提取得到金花茶超聲波提取液；然后將金花茶超聲波提取液濃縮得到金花茶浸膏， 濕法上擔(dān)體進行層析柱分離，收集130?150流分自然揮去溶劑，結(jié)晶后得到金花茶皂苷A 粗品；最后將金花茶皂苷A粗品用液相色譜進行程序分離純化得到富含金花茶皂苷A組分 純化液，濃縮、靜止結(jié)晶、冷凍干燥處理后，即可得到純度> 98. 5%的白色針狀的金花茶皂 苷A晶體，即金花茶皂苷A標準品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的層析 柱分離選用的層析柱為14 cm X 100 cm，擔(dān)體為200目?300目，用體積比為15?25:2? 4氯仿-甲醇洗脫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的液 相色譜進行程序分離純化為將金花茶皂苷A粗品溶解于有機溶劑中制備得到金花茶皂苷A 供試液，然后將供試液用液相色譜進行程序分離純化，所述的程序分離純化條件為：紫外吸 收波長203nm ;流動相：A為乙腈，B為水；梯度洗脫條件：0?5 min，A:B體積比為25:75 ; 5 ?28 min，A:B 體積比為 40:60 ;28 ?37 min，A:B 體積比為 40:60 ;37 ?42 min，A:B 體 積比為50:50 ;42?60 min，A:B體積比為50:50 ;60?65 min，A:B體積比為25:75 ;65? 70 min，A:B體積比為25:75 ;金花茶皂苷A色譜峰的保留時間為23分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述柱層析 分離所用的擔(dān)體為硅膠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的濃縮 為真空濃縮，其條件為：真空度為620?660mmHg，蒸汽壓為0. 05?0. IMpa。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的 超聲波提取條件為：溫度為65°C?75°C，頻率為20KHZ?30KHZ，時間50分鐘?70分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的金花 茶浸膏為固形物含量濃度35 %?45 %的金花茶浸膏。
9. 根據(jù)權(quán)利要4所述的金花茶皂苷A標準品的制備方法，其特征在于：所述的有機溶 劑為甲醇、乙醇、甲醇-水或乙醇-水；所述的金花茶原料預(yù)處理為將采采摘的新鮮金花茶 的花、枝、葉原料去雜物，用自來水沖洗干凈，浙干水分，切為〇. 5cm?3cm長。
10. 金花茶皂苷A標準品在鑒別金花茶產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于：所述的金花茶皂苷 A標準品作為化學(xué)對照品，用于鑒別金花茶系列產(chǎn)品金花茶花茶、葉茶、袋泡茶、金花茶口服 液、金花茶膠囊、花茶濃縮飲液品質(zhì)。
【文檔編號】C07J9/00GK104277090SQ201410439637
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】黃艷, 莫建光, 楊克迪, 陳秋虹, 張思敏, 林國友, 徐慧, 覃祖前 申請人:廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心