胰島素二聚體晶體的合成和保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了胰島素二聚體晶體的合成和保存方法，它涉及一種胰島素合成和保存方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有胰島素二聚體的制取方法復(fù)雜、產(chǎn)率低、產(chǎn)物不穩(wěn)定，保存時間短的技術(shù)問題。本發(fā)明合成以胰島素六聚體為原料，與二肽在催化劑的作用下反應(yīng)，再在由精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、2-N-嗎啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液配置的結(jié)晶液中進(jìn)行結(jié)晶。保存方法：將胰島素二聚體晶體放在pH為6～6.8的結(jié)晶液中，在3～10℃下密閉的避光玻璃容器中保存。本發(fā)明制備的胰島素二聚體為自然結(jié)構(gòu)，無基因工程成分，副作用小，適用于對胰島素類似物過敏者，保存時間可達(dá)一年以上。
【專利說明】胰島素二聚體晶體的合成和保存方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種胰島素合成和保存方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素作為一種重要的蛋白質(zhì)，對其研究至今已有近一百年的歷史。胰島素本質(zhì) 為一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，通常以較為穩(wěn)定的六聚體形式存在，被廣泛用于糖尿病的 治療。
[0003] 目前的胰島素制劑按作用時間可分為五大類，其中起效最為迅速的一類胰島素屬 門冬胰島素和賴脯胰島素，起效時間15分鐘左右。缺點(diǎn)是此類胰島素藥物均為胰島素類似 物，其結(jié)構(gòu)與天然胰島素存在差別，是用相應(yīng)氨基酸取代原有氨基酸來達(dá)到快速起效的目 的，不適用于對對應(yīng)氨基酸或胰島素類似物過敏的糖尿病患者，且人工合成的胰島素類似 物存在潛在副作用。
[0004] 具有自然結(jié)構(gòu)的胰島素作用時間（最快）也不低于半小時，相對起效速度較慢，影 響糖尿病重患的最佳搶救時間。因在實際治療過程中，胰島素以六聚體形式保存在溶液中， 以注射方式進(jìn)入人體，但胰島素六聚體在人體中首先被分解成二聚或三聚體，最后分解至 單體才能發(fā)揮治療作用。若病人血糖已處于危險水平而對上述胰島素類似物過敏，則傳統(tǒng) 胰島素起效慢易造成生命危險。
[0005] 可迅速起效的胰島素二聚體發(fā)現(xiàn)已久，因結(jié)構(gòu)具有高度不穩(wěn)定性使其制取和保存 都相對困難，至今未有成熟藥品見于市場。
[0006] 目前，胰島素二聚體主要處于研究階段，而且現(xiàn)有實驗室制取方法過于復(fù)雜，產(chǎn)率 較低（現(xiàn)有的產(chǎn)率一般是20?30% )，產(chǎn)物因極度不穩(wěn)定而無法保存較長時間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決現(xiàn)有胰島素二聚體存在制取方法復(fù)雜、產(chǎn)率低、產(chǎn)物不穩(wěn)定，且保存 時間短的技術(shù)問題；而提供了胰島素二聚體晶體的合成和保存方法。
[0008] 本發(fā)明中胰島素二聚體晶體的合成方法是按下述步驟進(jìn)行的：
[0009] 步驟一、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸 鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris)、硫酸鈉、2-N-嗎啉乙磺酸（MES)、苯酚丙酮溶液加入去離子 水中配置反應(yīng)液，調(diào)節(jié)pH值5. 2?7.3 ;
[0010] 步驟二、將所配置反應(yīng)液在12?15°C下攪拌1. 5?2h，加胰島素六聚體水溶液， 充分混勻后加入二肽水溶液，繼續(xù)攪拌2h，再加入催化劑，再在12?15°C條件下繼續(xù)攪拌 反應(yīng)8?12小時，反應(yīng)過程中攪拌速度始終保持在400?600r/min，獲得胰島素二聚體溶 液；
[0011] 步驟三、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸 鈉三羥甲基氨基甲烷（Tris)、氯化鈉、2-N-嗎啉乙磺酸（MES)、苯酚丙醇溶液加入去離子水 中配置結(jié)晶液，調(diào)節(jié)pH值5. 2?7. 3,然后攪拌30min，按1:1體積比加入胰島素二聚體溶 液后室溫下進(jìn)行結(jié)晶，或者采用懸滴法結(jié)晶，獲得胰島素二聚體晶體。
[0012] 步驟一所述的反應(yīng)液中精氨酸的濃度為0. 1?0. 2mol/L，谷氨酸的濃度為 0· 05mol/L，L-谷氨酰胺的濃度為0· 05?0· 08mol/L，甲硫氨酸的濃度為0· 04mol/L，L-谷 胱甘肽的濃度為0. 03mol/L，醋酸鋅的濃度為8mmol/L，檸檬酸鈉的濃度為0. 035mol/L，三 羥甲基氨基甲烷（Tris)的濃度為0· 63?1. 10mol/L，硫酸鈉的濃度為0· 6mol/L，2-N-嗎 啉乙磺酸（MES)的濃度為0. 1?0. 28mol/L，苯酚丙酮溶液苯酚丙酮溶液占反應(yīng)液體積的 7. 3?7. 5%，苯酚丙酮溶液的質(zhì)量百分濃度為0. 06%。
[0013] pH值小于5. 2時酸性過強(qiáng)，與人體pH偏差過大，且產(chǎn)率低，無實用價值；在pH值 在6. 2?6. 5處產(chǎn)率達(dá)到峰值，隨pH繼續(xù)增大（大于6. 5后）產(chǎn)率會降低，pH值大于7. 3 產(chǎn)率低，pH過高時Zn離子會繼續(xù)與胰島素配合，使溶液中胰島素構(gòu)型發(fā)生變化更傾向于六 聚。pH的調(diào)節(jié)可用MES及Tris的生物緩沖液調(diào)節(jié)，當(dāng)pH值偏差過大時可用NaOH或者HC1 溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0014] 步驟二中所述的胰島素六聚體為r6態(tài)的胰島素六聚體和/或t3r 3態(tài)的胰島素六 聚體，構(gòu)型穩(wěn)定，適合作原料；當(dāng)胰島素六聚體為組合物時，按任意比組合。
[0015] 步驟二中胰島素六聚體水溶液的濃度為32g/L，反應(yīng)液與胰島素六聚體水溶液的 體積比為2. 5:1。
[0016] 所述二肽水溶液濃度為0. lmol/L，反應(yīng)液與二肽的體積比為10 :1。二肽可由苯丙 氨酸與甘氨酸縮合反應(yīng)制成的（按現(xiàn)有方法制備即可）。
[0017] 步驟二中催化劑催化劑由精氨酸、脯氨酸和水組成，催化劑中精氨酸的濃度為 5mol/L，脯氨酸的濃度為5mol/L，催化劑與二肽溶液體積比為1:2,加入催化劑目的是穩(wěn)定 并防止蛋白質(zhì)凝結(jié)。
[0018] 步驟三所述的結(jié)晶液中精氨酸的濃度為0. 27?0. 45mo 1/L、谷氨酸的濃度為 0· 4mol/L，L-谷氨酰胺的濃度為0· 5mol/L，甲硫氨酸的濃度為0· 4?0· 53mol/L，L-谷胱甘 肽的濃度為〇. 37?0. 45mol/L，醋酸鋅的濃度為lmol/L，檸檬酸鈉的濃度為lmol/L，三羥甲 基氨基甲烷（Tris)的濃度為0· 63?1. 10m〇l/L，氯化鈉的濃度為5mol/L，2-N-嗎啉乙磺 酸（MES的濃度為）0. 1?0. 28mol/L，苯酚丙醇溶液的質(zhì)量百分比濃度為5%，苯酚丙酮溶 液占結(jié)晶液體積的7. 3?7. 5%，苯酚丙酮溶液的質(zhì)量百分濃度為0. 06%。
[0019] 本發(fā)明胰島素二聚體晶體的保存方法：將胰島素二聚體晶體放在pH為6?6. 8上 述的結(jié)晶液中，在3?10°C下密閉的避光玻璃容器中保存。
[0020] 本專利發(fā)明了以六聚體胰島素及相應(yīng)氨基酸溶液為原料制取并保存穩(wěn)定二聚體 胰島素結(jié)晶的技術(shù)，為其應(yīng)用于快速胰島素市場邁出了重要一步，并填補(bǔ)了具有天然結(jié)構(gòu) 的胰島素見效慢這一空白。此方法為工業(yè)制取二聚胰島素奠定了基礎(chǔ)。本專利涉及的二聚 體胰島素制備及保存技術(shù)未來可作為一種新型快速類天然胰島素藥物應(yīng)用于市場，且產(chǎn)物 胰島素二聚體為自然結(jié)構(gòu)（參見圖1)，無基因工程成分，副作用小，適用于對胰島素類似物 過敏者。本發(fā)明方法制備的胰島素二聚體是無色顆粒狀晶體，顆粒極細(xì)小，顯微鏡下側(cè)呈立 方晶體。
[0021] 胰島素二聚體制劑給藥方式是注射。
[0022] 本發(fā)明方法獲得的胰島素二聚體純度較高，且保存方法穩(wěn)定易行，貨架期長，在一 年以上，有利于藥品的存放及使用。本發(fā)明方法制備條件穩(wěn)定，工藝簡單，能制備出穩(wěn)定的 二聚體胰島素，產(chǎn)率較高，所用各類藥品環(huán)保、無對人體有害物質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是二聚體胰島素分子模型。

【具體實施方式】

【具體實施方式】 [0024] 一：本實施方式中胰島素二聚體晶體的合成方法是按下述步驟進(jìn)行 的：
[0025] 步驟一、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸 鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris)、硫酸鈉、2-N-嗎啉乙磺酸（MES)、苯酚丙酮溶液加入去離子 水中配置反應(yīng)液，調(diào)節(jié)pH值；
[0026] 步驟二、將200ml所配置反應(yīng)液在12°C下攪拌2h，加80mL濃度為32g/L的R6態(tài) 的胰島素六聚體水溶液（用去離子水配制），充分混勻后加入20ml濃度為0. lmol/L二肽， 繼續(xù)攪拌2h，再加入10ml催化劑，再在12°C條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12小時，反應(yīng)過程中攪拌 速度始終保持在300r/min (采用磁力攪拌器攪拌），獲得胰島素二聚體溶液；
[0027] 所述催化劑由催化劑催化劑由精氨酸、脯氨酸和水組成，催化劑中精氨酸的濃度 為5mol/L，脯氨酸的濃度為5mol/L，催化劑與二肽溶液體積比為1:2。
[0028] 步驟三、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸 鈉三羥甲基氨基甲烷（Tris)、氯化鈉、2-N-嗎啉乙磺酸（MES)、苯酚丙醇溶液加入去離子水 中配置結(jié)晶液，調(diào)節(jié)pH值，然后用600r/min轉(zhuǎn)速磁力攪拌器攪拌30min，按1:1體積比加入 胰島素二聚體溶液后20°C下結(jié)晶，結(jié)晶過程需要10?14天，獲得胰島素二聚體晶體。
[0029] 步驟一所述的反應(yīng)液中精氨酸的濃度為0. lmol/L，谷氨酸的濃度為0.05mol/ L，L-谷氨酰胺的濃度為0. 05mol/L，甲硫氨酸的濃度為0. 04mol/L，L-谷胱甘肽的濃度 為0· 03mol/L，醋酸鋅的濃度為8mmol/L，檸檬酸鈉的濃度為0· 035mol/L，三羥甲基氨基甲 烷（Tris)的濃度為0· 63mol/L，硫酸鈉的濃度為0· 6mol/L，2-N-嗎啉乙磺酸（MES)的濃 度為0. lmol/L，苯酚丙酮溶液質(zhì)量百分濃度0.06%，苯酚丙酮溶液與反應(yīng)液的體積比為 1:1. 35。
[0030] 二肽合成方法為：苯丙氨酸與甘氨酸縮合反應(yīng)制成的二肽；雙線合成，其一為苯 丙氨酸（Phe)，其二為甘氨酸（Gly)。左線為Phe在堿性條件下加入Boc保護(hù)，Gly酸性條 件下加入甲醇保護(hù)，二者保護(hù)后在DCC存在下混合反應(yīng)形成肽鍵（DCC為有機(jī)氧化劑）。
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于胰島素二聚體晶體的合成方法是按下述 步驟進(jìn)行的： 步驟一、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸鈉、三 羥甲基氨基甲烷、硫酸鈉、2-N-嗎啉乙磺酸、苯酚丙酮溶液加入去離子水中配置反應(yīng)液，調(diào) 節(jié)pH值5. 2?7.3 ; 步驟二、將步驟一的反應(yīng)液在12?15°C下攪拌1. 5?2h，加胰島素六聚體水溶液，充 分混勻后加入二肽水溶液，繼續(xù)攪拌2h，再加入催化劑，再在12?15°C條件下繼續(xù)攪拌反 應(yīng)8?12小時，反應(yīng)過程中攪拌速度始終保持在400?600r/min，獲得胰島素二聚體溶液； 步驟三、將精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸鋅、檸檬酸鈉三 羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、2-N-嗎啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液加入去離子水中配置結(jié)晶液，調(diào) 節(jié)pH值5. 2?7. 3,然后以600?750r/min轉(zhuǎn)速攪拌30nin，按1:1體積比加入胰島素二 聚體溶液后室溫下進(jìn)行結(jié)晶，獲得胰島素二聚體晶體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟一所述的反應(yīng) 液中精氨酸的濃度為〇. 1?〇. 2mol/L，谷氨酸的濃度為0. 05mol/L，L-谷氨酰胺的濃度為 0· 05?0· 08mol/L，甲硫氨酸的濃度為0· 04mol/L，L-谷胱甘肽的濃度為0· 03mol/L，醋酸 鋅的濃度為8mmol/L，檸檬酸鈉的濃度為0. 035mol/L，三羥甲基氨基甲烷的濃度為0. 63? 1. 10mol/L，硫酸鈉的濃度為0· 6mol/L，2-N-嗎啉乙磺酸的濃度為0· 1?0· 28mol/L，苯酚丙 酮溶液占反應(yīng)液體積的7. 3?7. 5%，苯酚丙酮溶液的質(zhì)量百分濃度為0. 06%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟一調(diào)節(jié)pH值為 6. 2 ?6. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟二中所述的胰 島素六聚體為r6態(tài)的胰島素六聚體和/或T 3R3態(tài)的胰島素六聚體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟二中胰島素六 聚體水溶液的濃度為32g/L，反應(yīng)液與胰島素六聚體水溶液的體積比為2. 5:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于二肽水溶液的濃度 為0. lmol/L，反應(yīng)液與二肽水溶液的體積比為10 :1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟二中催化劑由 精氨酸、脯氨酸和水組成，催化劑中精氨酸的濃度為5mol/L，脯氨酸的濃度為5mol/L，催化 劑與二肽溶液體積比為1:2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟三所述的結(jié)晶 液中精氨酸的濃度為〇. 27?0. 45mol/L，谷氨酸的濃度為0. 4mol/L，L-谷氨酰胺的濃度為 0. 5mol/L，甲硫氨酸的濃度為0. 4?0. 53mol/L，L-谷胱甘肽的濃度為0. 37?0. 45mol/L， 醋酸鋅的濃度為lmol/L，檸檬酸鈉的濃度為lmol/L，三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.63? 1. 10mol/L，氯化鈉的濃度為5mol/L，2-N-嗎啉乙磺酸的濃度為0· 1?0· 28mol/L，苯酚丙醇 溶液的質(zhì)量百分比濃度為5%，苯酚丙酮溶液占結(jié)晶液體積的7. 3?7. 5%，苯酚丙酮溶液 的質(zhì)量百分濃度為0.06%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述胰島素二聚體晶體的合成方法，其特征在于步驟三采用懸滴法 結(jié)晶。
10. 胰島素二聚體晶體的保存方法，其特征在于將胰島素二聚體晶體放在pH為6? 6. 8的權(quán)利要求1或8所述的結(jié)晶液中，在3?10°C下密閉的避光玻璃容器中保存。
【文檔編號】C07K1/30GK104193819SQ201410443759
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】張京宏, 韓飛 申請人:韓飛, 張京宏