一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的myl1基因及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL1基因，其包括兩種cDNA可變剪接體MYL1a和MYL1b，其中MYL1a的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MYL1b的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；該基因具有調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的功能，應(yīng)用該基因可以通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL1基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼 肌生長(zhǎng)的MYLl基因及其在綿羊育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩，脂肪和膽固醇含量低，逐漸受到人們的青睞。近年來(lái)，隨著羊肉價(jià) 格的不斷攀升，提高羊只生長(zhǎng)速度、改善羊肉品質(zhì)對(duì)增加動(dòng)物生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)收益、滿足廣大 消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)羊肉的需求具有重大意義。
[0003] 肌球蛋白輕鏈?zhǔn)枪趋兰±w維中的一類(lèi)重要蛋白質(zhì)，這類(lèi)蛋白質(zhì)主要與肌球蛋白重 鏈結(jié)合而對(duì)其構(gòu)型和活性起調(diào)控作用。不同類(lèi)型的肌球蛋白輕鏈及構(gòu)成比例與不同類(lèi)型的 肌纖維密切相關(guān)，從而導(dǎo)致肌肉的生長(zhǎng)速度和肌肉品質(zhì)顯著不同。
[0004] 到目前為止，哺乳動(dòng)物中肌球蛋白輕鏈家族已發(fā)現(xiàn)有四種不同的類(lèi)型，其中肌球 蛋白輕鏈I(MYLl)在斑馬魚(yú)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為快肌纖維的早期階段表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn) 在增殖速度較慢的成肌細(xì)胞中高表達(dá)，因而認(rèn)為該基因可能具有抑制成肌細(xì)胞增殖而促進(jìn) 肌細(xì)胞的分化的功能。目前，綿羊基因組中公布了 MYLl基因的預(yù)測(cè)序列，還未見(jiàn)到該基因 確切序列的報(bào)道，并且關(guān)于該基因?qū)∪馍L(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控還不清楚。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于上述的原因，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYLl基因， 其包括兩種cDNA可變剪接體MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所 示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其 編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；該基因具有調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的功能，應(yīng)用該基因可 以通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，具有 重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0006] 本發(fā)明所提供的調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYLl基因，根據(jù)現(xiàn)有條件，在骨骼肌 中獲得了 V端有所不同的兩種cDNA可變剪接體MYLla和MYLlb，未見(jiàn)其他序列。其中 MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0007] 其中MYLla的cDNA序列除poly⑷外長(zhǎng)849bp，該序列中的開(kāi)放讀碼框編碼150 個(gè)氨基酸；MYLlb的cDNA序列除poly (A)外長(zhǎng)1046bp，該序列中的開(kāi)放讀碼框編碼192個(gè) 氨基酸。
[0008] 上述的MYLl基因是通過(guò)如下方法獲得的：
[0009] (1)小尾寒羊肌肉總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：
[0010] 采用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉組織總RNA，提取的RNA以Agilent 2IOOBioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)，要求總RNA含量在10 μ g以上且RIN (RNA完整性指標(biāo)）彡7. 5， 并根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0011] ⑵MYLl基因 cDNA序列保守區(qū)的擴(kuò)增：
[0012] 比對(duì)已有物種MYLl基因的cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，以步驟⑴中 的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序得到保守區(qū)序列；
[0013] (3)應(yīng)用3'降落巢式PCR法對(duì)MYLl基因 CDNA序列的3'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0014] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)MYLl基因的3'特異內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物；
[0015] 以3'特異外側(cè)引物和3'通用外側(cè)引物采用退火溫度逐漸降落法對(duì)上述cDNA第 一鏈進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0016] 然后以3'特異內(nèi)側(cè)引物和3'通用內(nèi)側(cè)引物采用同樣的退火溫度逐漸降落法對(duì) 第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
[0017] 對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序得到MYLl基因 cDNA序列的：V端序列；
[0018] (4)應(yīng)用Y RACE法對(duì)MYLl基因 cDNA序列的5'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0019] 對(duì)小尾寒羊肌肉組織經(jīng)TRIzoI法所提總RNA依次進(jìn)行常規(guī)的去磷酸化處理、"去 帽子"反應(yīng)、與接頭序列連接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP試劑盒反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈；
[0020] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)MYLl基因的5'特異外側(cè)和特異內(nèi)側(cè)引物；
[0021] 以5'特異外側(cè)和5'通用外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0022] 以Y特異內(nèi)側(cè)和Y通用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
[0023] 內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序得到MYLl基因 cDNA序列的Y端序列；
[0024] (5)全長(zhǎng)序列拼接及克隆測(cè)序驗(yàn)證：
[0025] 根據(jù)重疊區(qū)域?qū)ι鲜霾襟E獲得的cDNA的保守區(qū)、5'和3'所得序列進(jìn)行拼接，獲 得MYLl基因的全長(zhǎng)cDNA序列；設(shè)計(jì)兩端序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增并克隆測(cè)序得到MYLl 基因的全長(zhǎng)cDNA序列，由于5'端序列的差異，最終獲得了可變剪接體MYLla和MYLlb，其 中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0026] 之后發(fā)明人利用qRT-PCR法測(cè)定MYLl基因在小尾寒羊的心、肝、肌肉等組織間 的表達(dá)量，并最終發(fā)現(xiàn)MYLla和MYLlb在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織 (p〈0. 05)，表明該基因具有調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的功能。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYLl基因，其包括 兩種cDNA可變剪接體。應(yīng)用該基因可以通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生 長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為本發(fā)明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA保守區(qū)擴(kuò)增圖，
[0029] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYLl基因 cDNA的保守區(qū)序列；
[0030] 圖2為本發(fā)明中小尾寒羊MYLl基因3'端擴(kuò)增圖，
[0031] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYLl基因 cDNA的3'端序列；
[0032] 圖3為本發(fā)明中小尾寒羊MYLl基因 Y RACE擴(kuò)增圖，
[0033] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一個(gè)電泳道中上面的一條為MYLlb的5'端序列， 下面的一條為MYLla的Y端序列；
[0034] 圖4為本發(fā)明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增圖，
[0035] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另兩條分別為MYLla和MYLlb的全長(zhǎng)cDNA序列；
[0036] 圖5為本發(fā)明中MYLla在小尾寒羊不同組織間的表達(dá)水平柱狀圖，
[0037] 圖中a、b表示小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0.05) ;MYLla主要在背最長(zhǎng)肌 中表達(dá)；
[0038] 圖6為本發(fā)明中MYLlb在小尾寒羊不同組織間的表達(dá)水平柱狀圖，
[0039] 圖中a、b和c表不小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0. 05) ;MYLlb在背最長(zhǎng)肌 中的表達(dá)量顯著高于其他組織。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，這些實(shí)施 例僅為了說(shuō)明本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0041] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條 件或常規(guī)方法，如Sambrook等編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0042] 實(shí)施例I :背最長(zhǎng)肌組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0043] 取小尾寒羊背最長(zhǎng)肌約20g，使用康為世紀(jì)公司的總RNA提取試劑盒（No. CW0580)提取肌肉組織的總RNA ;將提取的RNA采用Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (No. 05081955001)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044] 實(shí)施例2 :cDNA保守區(qū)序列的克隆與測(cè)序
[0045] (1)引物的設(shè)計(jì)：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種MYLl基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0軟件進(jìn)行比對(duì)獲得保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)該基因 cDNA的保守區(qū)引物為：Fl : TGAATTCAAGGAGGCATTTCTCC，如 SEQ ID NO. 5 所示，和 F2 :AAGGATGTTCTTTGACCC，如 SEQ ID NO. 6所示；
[0046] (2) PCR擴(kuò)增：以實(shí)施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix試劑盒（KT201)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；50μ 1擴(kuò)增體系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一鏈 2μ 1。擴(kuò)增條件為：94°C，5min ;(94°C 30s， 52°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)附圖 I ;
[0047] (3)擴(kuò)增條帶的回收：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖的TAE凝膠進(jìn)行電泳凝，切取相 應(yīng)條帶；采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒（#0691)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；
[0048] (4)回收產(chǎn)物與載體連接：載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8 ;根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物回 收后凝膠電泳情況將回收產(chǎn)物稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度，依PMD18-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)（No. 6011) 進(jìn)行連接反應(yīng)。
[0049] (5)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：取適量連接產(chǎn)物，依TIANGEN公司的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a (CB101)使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化及細(xì)菌的培養(yǎng)操作；
[0050] (6)菌液PCR鑒定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依據(jù)（2)中PCR擴(kuò)增體系和條件 進(jìn)行擴(kuò)增，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶；
[0051] (7)克隆產(chǎn)物的測(cè)序分析：如果凝膠檢測(cè)含有目的條帶且較純，則吸取Iml菌液測(cè) 序分析，得到長(zhǎng)為719bp的一條保守區(qū)目標(biāo)序列。
[0052] 實(shí)施例3 :cDNA 3'端序列的克隆與測(cè)序
[0053] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具體步驟如下：
[0054] (1)引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)實(shí)施例2所得MYLl基因 cDNA保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果， 設(shè)計(jì)兩條上游嵌套式引物,3 ' GSP :TGATGGCAGGTCAGGAAGAC，如SEQ ID NO. 7所示，和 3' NGSP:GAACACCCATGACTAACTGTCC，如 SEQ IDN0. 8 所示；并合成兩條下游：V 通用引物， 3，-UP:GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID N0.9K*jP01igodT-AP:GACTCGAGTCGATCGA(T)18， 如 SEQ ID NO. 10 所示。
[0055] (2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：取IOOpg?1μ g實(shí)施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0056] (3)夕卜側(cè)PCR擴(kuò)增：以3 ' GSP和OligodT-AP為上下游引物，依實(shí)施例2中PCR 反應(yīng)試劑盒體系進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, IOs ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, IOs ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, IOs ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0057] (4)內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增：以:V NGSP和:V -UP為上下游引物，步驟⑶的擴(kuò)增產(chǎn)物稀 釋30倍為模板，依上述步驟（3)中反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序進(jìn)行目的條帶的擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn) 附圖2;
[0058] (5)PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序：擴(kuò)增條帶的回收、與載體連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及測(cè)序 同實(shí)施例2,得到長(zhǎng)為274bp的一條序列。
[0059] 實(shí)施例4 :cDNA 5'端序列的克隆與測(cè)序 [0060] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步驟如下：
[0061] (1)引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)實(shí)施例3所得MYLl基因 cDNA保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果， 設(shè)計(jì)兩條下游嵌套式引物,5 ^ GSP :CACGCAGACCCTCAACAAAG，如SEQ ID NO. 11所示，和 5/NGSP:GCCATCACCTGTTCTGTCATAC，如SEQIDN0·12所示 ；并合成兩條上游5/通用引 *，5,-0uterPrimer :CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.13K*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 14 所示。
[0062] (2)mRNA的去磷酸化處理
[0063] ①配制去磷酸反應(yīng)液：
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL1基因，其特征在于：包括兩種cDNA可變剪接 體MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MYL1基因，其特征在于：其來(lái)源于小尾寒羊的肌球蛋白輕鏈 1〇
3. 權(quán)利要求1所述的調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的MYL1基因，在綿羊育種中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：通過(guò)對(duì)MYL1基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速 度快的綿羊育種。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104263733SQ201410473379
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】王建民, 張春蘭, 王桂芝, 紀(jì)志賓, 候磊, 秦孜娟 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)