一種甲氧芐啶半抗原t2制備完全抗原的方法及應用的制作方法
【專利摘要】一種甲氧芐啶半抗原T2制備完全抗原的方法及應用，屬于生物化工【技術領域】。本發(fā)明的甲氧芐啶半抗原T2是利用嘧啶核一端的氨基衍生出活性羧基，經(jīng)過純化得到單一特異性結構的甲氧芐啶羧基衍生物（TMP-HS），該衍生物為甲氧芐啶半抗原T2，將半抗原T2與載體蛋白偶聯(lián)后形成甲氧芐啶完全抗原。本發(fā)明的抗原或抗體可用于建立酶聯(lián)免疫吸附分析方法及膠體金試紙快速檢測法，從而用于快速檢測食品中的甲氧芐啶殘留。
【專利說明】-種甲氧節(jié)惦半抗原T2制備完全抗原的方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甲氧予巧半抗原T2制備完全抗原的方法及應用，屬于生物化工

【技術領域】。

【背景技術】
[0002] S甲氧予胺嚼巧（Trimethoprim，TMP )，又名甲氧予巧，和二甲氧予胺嚼巧 (Diaveridine，DVD)都是一種二氨基嚼巧類的二氨葉酸還原酶抑制劑，白色結晶型粉末，不 溶于水，微溶于氯仿、己醇、丙麗，但易溶于冰己酸等有機酸。本身抗菌能力較弱，因此常不 單獨使用，但與賴胺類、巧喃類、唾諾麗類等抗生素聯(lián)合使用，可大幅度增強抗生素的應用 效果，可治療雞白癡、禽霍亂、細菌性感染等畜禽疾病。但抗生素和協(xié)同增效劑的過度使用 和不合理用藥，使藥物過量殘留于動物性食物中，從而對人體健康造成危害。我國農業(yè)部 和歐盟、日本等都對TMP在動物組織中的最大殘留限量值(MRL)做出了規(guī)定，其中我國規(guī) 定TMP的標志性殘留物是其本身，其在畜禽肌肉、肝腎、脂肪W(wǎng)及魚肉、皮等組織中的MRL 值為50yg/kg，歐盟明確規(guī)定其不能用于蛋類，日本規(guī)定其在魚類、雞組織中的MRL值為 50 y g/kg。
[0003] TMP和DVD的結構式如下：

【權利要求】
1. 一種甲氧芐啶半抗原T2的制備方法，其特征在于： 甲氧芐啶半抗原T2結構簡式為：
步驟為：100mL三頸瓶中依次加入IOmL吡啶、3.2 g對氨基苯甲酸、5mg 4-二甲氨基 吡啶，60°C水浴加熱磁力攪拌至溶液澄清；另以IOmL吡啶溶解2.9 g甲氧芐啶并滴加到所 述三頸瓶中，繼續(xù)攪拌反應3天；采用薄層色譜法，以甲醇：四氫呋喃：三氯甲烷體積比為 I : 1 : 5作為展開劑監(jiān)控反應進程；減壓0.092 MPa、60°C蒸餾IOmin將溶劑全部蒸走，得 到黃色油狀物；繼續(xù)滴加質量體積比為10%的NaHCO3水溶液至不再產生渾濁，過濾并調節(jié) 上清液在pH5. 0酸性條件下重結晶析出白色固體，7500 r/min離心8min，濾餅60°C烘干即 為甲氧芐啶半抗原T2。
2. 用權利要求1所述方法制得的甲氧芐啶半抗原T2制備甲氧芐啶完全抗原的方法，其 特征在于：將甲氧芐啶半抗原T2與載體蛋白偶聯(lián)后制備得到甲氧芐啶完全抗原。
3. 根據(jù)權利要求2所述用甲氧芐啶半抗原T2制備甲氧芐啶完全抗原的方法，其特征在 于：所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白0VA、匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH 或人血清白蛋白HAS中的一種。
4. 根據(jù)權利要求3所述用甲氧芐啶半抗原T2制備甲氧芐啶完全抗原的方法，其特征在 于：制備50 : 1及100 : 1兩種甲氧芐啶完全抗原T2-ZD-BSA，步驟為： (1) 甲氧芐啶半抗原T2的活化：將甲氧芐啶半抗原T2用DMF溶解，按甲氧芐啶半抗原 T2 :鹽酸摩爾比1 : 2.5混合，鹽酸溶液的濃度為謂，在41：下預冷3〇1^11后，逐滴添加新 配制的質量體積比為10%的亞硝酸鈉溶液，以淀粉-碘化鉀試紙檢測呈藍黑色，繼續(xù)攪拌 反應2h，得到活化的甲氧芐啶半抗原T2溶液； (2) 載體蛋白BSA溶液的配制：取BSA，按甲氧芐啶半抗原T2 : BSA摩爾比分別為50 : 1及100 : 1，用〇. IM pH9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解，其中溶解后的BSA濃度大于3mg/mL，且 碳酸鹽緩沖液與DMF的體積比例為5 : 1，得到BSA溶液； (3) 完全抗原的制備：將步驟（1)所得14. 5mg/mL活化的甲氧芐啶半抗原T2溶液ImL慢 速滴加到步驟（2)所得22mg/mL BSA溶液I. 5mL及3mL中，室溫下反應12h ;用PBS緩沖液 透析3天，期間換水8次，即得到50 : 1及100 : 1的兩種甲氧芐啶完全抗原T2-ZD-BSA。
5. 根據(jù)權利要求3所述用甲氧芐啶半抗原T2制備甲氧芐啶完全抗原的方法，其特征在 于：制備免疫原T2-GA-BSA及包被原T2-GA-0VA的步驟為： (1) 甲氧芐啶半抗原T2的活化：將甲氧芐啶半抗原T2用DMF溶解，按甲氧芐啶半抗原 T2 :戊二醛反應摩爾比為1 : 1.5,在4°C下，攪拌反應2h，再在室溫25°C下反應12h，得到 活化的甲氧芐啶半抗原T2溶液； (2) 載體蛋白溶液的配置：取BSA及0VA，甲氧芐啶半抗原T2 : BSA/0VA的摩爾比均為 100 : 1，用0. IM pH9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解，其中溶解后的蛋白濃度大于3mg/mL，且碳酸 鹽緩沖液與DMF的體積比例為5 : 1，得到載體蛋白BSA/OVA溶液； (3)甲氧節(jié)陡完全抗原的制備：將步驟（1)制備的14. 5mg/mL活化的甲氧節(jié)陡半抗原 T2溶液lmL，慢速滴加到步驟（2)制備的22mg/mL蛋白BSA溶液3mL及OVA溶液3mL中，室 溫下反應24h，用PBS緩沖液透析3天，期間換水8次，即得到甲氧芐啶免疫原T2-GA-BSA及 包被原 T2-GA-0VA。
6.用權利要求2、3、4或5所述方法制備的甲氧芐啶完全抗原的應用，其特征在于：通 過甲氧芐啶完全抗原免疫得到多克隆抗體和/或單克隆抗體，用于檢測甲氧芐啶。
【文檔編號】C07K1/107GK104341357SQ201410510573
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】匡華, 徐乃豐, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學