一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，它包括：S1.樣品處理：百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后去除菌體、收集上清液，上清液用超濾膜包濃縮；S2.一次層析：包括洗脫雜蛋白、分離百日咳毒素和分離純化絲狀血凝素；S3.二次層析：將分離的百日咳毒素粗制品上樣于CaptoMMC層析柱，緩沖液洗脫，收集OD280洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素。本發(fā)明采用CaptoSPImpRes層析柱、CaptoMMC層析柱對(duì)百日咳桿菌培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行分離純化，可精確得到PT和FHA，質(zhì)量可控，分離純化百日咳抗原蛋白的純度達(dá)95%以上，該方法具有操作簡(jiǎn)單、純化速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種分離純化百日咳抗原蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]百日咳(pertussis, whooping cough)是由革蘭氏陰性百日咳桿菌引起的一種具有強(qiáng)傳染性的呼吸系統(tǒng)疾病，典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，新生兒及嬰幼兒患者會(huì)引起呼吸暫停和發(fā)紺。百日咳在發(fā)病初期傳染力極強(qiáng)，不易診斷，因此進(jìn)行疫苗接種是預(yù)防和控制百日咳最經(jīng)濟(jì)最有效的手段。
[0003]百日咳桿菌其致病物質(zhì)主要包括百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、絲狀血凝素(Filamentous Hemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌粘附素(Pertactin, PRN)、凝集原(Agglutinogens, AGGs)、腺苷酸環(huán)化酶毒素(Adenylate Cyclase Toxin, ACT)、氣管細(xì)胞毒素(Tracheal Cytotoxin, TCT)和不耐熱毒素(Heat-labile toxin, HLT)等多種生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)在百日咳桿菌的致病作用和引起宿主對(duì)疾病的免疫反應(yīng)方面起著重要作用。目前市場(chǎng)上的百日咳疫苗主要有全菌體百日咳疫苗和無細(xì)胞百日咳疫苗兩種，后者屬于百日咳疫苗的升級(jí)產(chǎn)品，其僅含提純的有效抗原而咩有百日咳菌體，因此大大降低了注射后的不良反應(yīng)而保留了良好的免疫效果，因此被廣泛使用。
[0004]無細(xì)胞百日咳疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，是通過純化手段去除無用且引起副反應(yīng)的組分(如HLT、TCT和ACT)，保留并提純具有保護(hù)性免疫作用的抗原成分(如PT、FHA和PRN等)，傳統(tǒng)的無細(xì)胞百日咳疫苗抗原制備工藝可以分為以下兩種:
1.離心共純化工藝:我國和日本大部分廠商采用的離心共純化工藝，即細(xì)菌培養(yǎng)液收獲后，通過硫酸銨鹽析、高鹽溶液浸提和蔗糖密度梯度離心獲得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液將抗原脫毒為類毒素；但此種方法所需設(shè)備投資巨大，且此工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品純度不夠高、產(chǎn)率也較低，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)；
2.柱層析:包括以下幾種:(I)羥基磷灰石，結(jié)合珠蛋白柱層析和凝膠過濾法；(2)藍(lán)膠親和層析和胎球蛋白親和層析法；(3)藍(lán)膠親和層析和羥基磷灰石層析法；(4)珍珠巖層析和羥基磷灰石柱層析；雖然使用這些工藝都可得到較純的百日咳抗原PT和FHA，但(I)、
(2)、(3)工藝都有其不可避免的問題，例如:藍(lán)膠親和層析、胎球蛋白親和層析、結(jié)合珠蛋白親和層析法，層析填料的結(jié)合基團(tuán)容易降解下來而影響疫苗質(zhì)量。另外，洗脫液中含有毒物質(zhì)或者洗脫條件過于苛刻，這些都會(huì)直接影響抗原產(chǎn)率和質(zhì)量；工藝(4)雖可獲得較高純度和產(chǎn)率的PT和FHA，但菌苗培養(yǎng)物經(jīng)珍珠巖柱層析分離純化后，PT和FHA的純度只能達(dá)到62%-68%，還要經(jīng)過羥基磷灰石柱層析分離純化，PT和FHA的純度才能達(dá)到90%左右，羥基磷灰石價(jià)格昂貴，并且此步大約10%的PT和FHA損失掉。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，本發(fā)明采用Capto SP ImpRes層析柱、Capto MMC層析柱對(duì)百日咳桿菌培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行分離純化，所得抗原蛋白成分明確、質(zhì)量可控，純化方法具有操作簡(jiǎn)單、純化速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液立即降溫至2?8°C，去除菌體、收集上清液，上清液用截留分子量為1KD的超濾膜包濃縮至原體積的1/12?1/8，調(diào)節(jié)濃縮液的pH至6.0 ;
52.—次層析
521.洗脫雜蛋白:將上述濃縮液上樣于平衡好的CaptoSP ImpRes層析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.1lM NaCl緩沖液洗脫雜蛋白；
522.分離百日咳毒素:再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為百日咳毒素粗制品；
S23:分離純化絲狀血凝素:然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl下洗脫峰處的洗脫液，即為純化的絲狀血凝素；
53.二次層析:將步驟S22所得的百日咳毒素粗制品上樣于平衡好的Capto MMC層析柱，用pH8.0、20mM PBUM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素。
[0007]進(jìn)一步地，步驟SI中所述去除菌體的方法為培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)流離心或進(jìn)行切向流微濾、壓濾，且濾膜的孔徑為0.2Mm，所述去除菌體的操作均在2?8°C的溫度下進(jìn)行。
[0008]進(jìn)一步地，所述分離純化的百日咳毒素和絲狀血凝素置于2?8°C保存。
[0009]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明采用Capto SP ImpRes層析柱、Capto MMC層析柱對(duì)百日咳桿菌培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行分離純化，可精確得到PT和FHA，質(zhì)量可控，分離純化百日咳抗原蛋白的純度達(dá)95%以上，純化方法具有操作簡(jiǎn)單、純化速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為一次層析中百日咳毒素和絲狀血凝素的層析圖；
圖2為二次層析百日咳毒素的層析圖；
圖3為本發(fā)明分離純化的百日咳毒素和絲狀血凝素純度分析電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
[0012]實(shí)施例1:一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液立即降溫至2°c，培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)流離心去除菌體、收集上清液，該操作在2°C的溫度下進(jìn)行。上清液用截留分子量為1KD的超濾膜包濃縮至原體積的1/12，調(diào)節(jié)濃縮液的pH至6.0 ;
52.—次層析
S21.洗脫雜蛋白:將上述濃縮液上樣于平衡好的Capto SP ImpRes層析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.1lM NaCl緩沖液洗脫雜蛋白，雜蛋白洗脫峰如圖1所示； S22.分離百日咳毒素:再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為百日咳毒素(PT)粗制品，PT洗脫峰如圖1所示；
S23:分離純化絲狀血凝素:然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl下洗脫峰處的洗脫液，即為純化的絲狀血凝素(FHA)，置于2°C保存，F(xiàn)HA洗脫峰如圖1所示；
S3.二次層析:將步驟S22所得的百日咳毒素粗制品上樣于平衡好的Capto MMC層析柱，用pH8.0、20mM PBUM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素，置于2°C保存，PT洗脫峰如圖2所示。
[0013]實(shí)施例2: —種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液立即降溫至8°C，培養(yǎng)液進(jìn)行切向流微濾、壓濾，濾膜的孔徑為0.去除菌體、收集上清液，該操作在8°C的溫度下進(jìn)行。上清液用截留分子量為1KD的超濾膜包濃縮至原體積的1/8，調(diào)節(jié)濃縮液的pH至6.0 ;
52.—次層析
521.洗脫雜蛋白:將上述濃縮液上樣于平衡好的CaptoSP ImpRes層析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.1lM NaCl緩沖液洗脫雜蛋白，雜蛋白洗脫峰如圖1所示；
522.分離百日咳毒素:再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為百日咳毒素(PT)粗制品，PT洗脫峰如圖1所示；
S23:分離純化絲狀血凝素:然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl下洗脫峰處的洗脫液，即為純化的絲狀血凝素(FHA)，置于8°C保存，F(xiàn)HA洗脫峰如圖1所示；
53.二次層析:將步驟S22所得的百日咳毒素粗制品上樣于平衡好的Capto MMC層析柱，用pH8.0、20mM PBUM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素，置于8°C保存，PT洗脫峰如圖2所示。
[0014]實(shí)施例3: —種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液立即降溫至5°c，培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)流離心去除菌體、收集上清液，該操作在5°C的溫度下進(jìn)行。上清液用截留分子量為1KD的超濾膜包濃縮至原體積的1/10，調(diào)節(jié)濃縮液的pH至6.0 ;
52.—次層析
521.洗脫雜蛋白:將上述濃縮液上樣于平衡好的CaptoSP ImpRes層析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.1lM NaCl緩沖液洗脫雜蛋白，雜蛋白洗脫峰如圖1所示；
522.分離百日咳毒素:再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為百日咳毒素(PT)粗制品，PT洗脫峰如圖1所示；
S23:分離純化絲狀血凝素:然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl下洗脫峰處的洗脫液，即為純化的絲狀血凝素(FHA)，置于6°C保存，F(xiàn)HA洗脫峰如圖1所示；
53.二次層析:將步驟S22所得的百日咳毒素粗制品上樣于平衡好的Capto MMC層析柱，用pH8.0、20mM PBUM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素，置于6°C保存，PT洗脫峰如圖2所示。
[0015]實(shí)施例4:純度分析(SDS-PAGE ) 1.實(shí)驗(yàn)方法:SDS-PAGE銀染法。
[0016]1.1樣品處理:待檢樣品為實(shí)施例3分離純化的百日咳毒素(PT)、純化的絲狀血凝素(FHA)，先將樣品稀釋，一般可以將待檢樣品稀釋成每毫升0.3-0.5毫克，上樣樣品含四分之三的待檢品，四分之一的樣品處理液，不需水浴。上樣量一般為每道含待檢樣品百日咳蛋白2微克，百日咳標(biāo)準(zhǔn)品(PT和FHA)蛋白2-3微克，分子量標(biāo)準(zhǔn)品蛋白(Maker) 2微克。
[0017]1.2電泳并染色:本實(shí)驗(yàn)采用垂直電泳，開始濃縮膠電壓低些(70-80V，大約20分鐘)，分離膠時(shí)電壓高些(150-200V)，全過程電泳時(shí)間大約60-80分鐘。待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)電泳槽底部(陽極)時(shí)，切斷電源，打開電泳槽上蓋，取出電泳槽支架并倒掉內(nèi)槽內(nèi)的液體，小心取下玻板并把兩片玻板分開，輕輕地將玻板上的濃縮膠與分離膠分開并舍去濃縮膠部分，將分離膠小心地取下放入已準(zhǔn)備好的存有固定液的容器里(或大平皿內(nèi))開始染色，染色為銀染法。
[0018]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:還原電泳凝膠蛋白質(zhì)經(jīng)掃描,計(jì)算待檢樣品相對(duì)于PT和FHA的條帶占總蛋白的百分比。
[0019]電泳圖如圖3所示:
圖中:M:maker ；
濃縮液:實(shí)施例3中步驟SI百日咳菌液離心超濾濃縮后濃縮液樣品；
PT:實(shí)施例3中步驟S3純化后百日咳毒素；
FHA:實(shí)施例3中步驟S23分離純化后收獲的絲狀血凝素。
[0020]結(jié)果分析:？1'是611111球星蛋白，由5個(gè)亞基51、52、53、53、54、55。分子質(zhì)量分別為 28KD、23KD、22KD、11.7KD、9.3KD。在 SDS-PAGE 電泳 S2 和 S3，S4 和 S5 不易分開；FHA 為絲狀蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)在220-90kD之間有五條亞單位帶，在圖3電泳圖譜中得到證明；進(jìn)行蛋白掃描分析，選中相應(yīng)蛋白條帶計(jì)算純度均超過95%。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，其特征在于，它包括以下步驟: 51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液立即降溫至2?8°C，去除菌體、收集上清液，上清液用截留分子量為1KD的超濾膜包濃縮至原體積的1/12?1/8，調(diào)節(jié)濃縮液的pH至6.0 ; 52.—次層析 521.洗脫雜蛋白:將上述濃縮液上樣于平衡好的CaptoSP ImpRes層析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.1lM NaCl緩沖液洗脫雜蛋白； 522.分離百日咳毒素:再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為百日咳毒素粗制品； S23:分離純化絲狀血凝素:然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl下洗脫峰處的洗脫液，即為純化的絲狀血凝素； 53.二次層析:將步驟S22所得的百日咳毒素粗制品上樣于平衡好的Capto MMC層析柱，用pH8.0、20mM PBUM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集OD28tl洗脫峰處的洗脫液，即為純化的百日咳毒素。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，其特征在于，步驟SI中所述去除菌體的方法為培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)流離心或進(jìn)行切向流微濾、壓濾，且濾膜的孔徑為0.2Mm，所述去除菌體的操作均在2?8°C的溫度下進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的一種分離純化百日咳毒素和絲狀血凝素的方法，其特征在于，所述分離純化的百日咳毒素和絲狀血凝素置于2?8°C保存。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104311647SQ201410516960
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】陳道遠(yuǎn), 吳強(qiáng), 馬禮耕, 伍長華, 李建霖 申請(qǐng)人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司