的抗原模擬表位及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位，其氨基酸序列為TRDKSSMLERWP。本發(fā)明FB1抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于FB1的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了FB1對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及伏馬菌素B1抗原模擬表位及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]伏馬菌素B1 (Fumonisins B1, FB1)是一種常見的真菌毒素，主要由串珠鐮刀菌(Fusarium moniIiforme)產(chǎn)生研究表明，F(xiàn)B1對(duì)人類及動(dòng)物具有較強(qiáng)的毒性作用，包括神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性及致畸致癌等，國(guó)際癌癥研究中心已把FB1化分為2B組，即對(duì)人類可能的致癌物。目前，多數(shù)國(guó)家已經(jīng)對(duì)谷物、糧食及食品中FB1的殘留含量設(shè)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，如聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)規(guī)定每日最大允許攝入FB1, FB2, FB3總量為2 Pg/kg體重；瑞士規(guī)定糧食中FB1和FB2總殘留限量為1000 Pg/L。
[0003]目前，檢測(cè)食品中FB1的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學(xué)檢測(cè)等方法，免疫學(xué)檢測(cè)方法以其靈敏度高、檢測(cè)方便、成本低廉等優(yōu)勢(shì)在FB1的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在建立免疫學(xué)檢測(cè)方法的過程中，必須使用FB1標(biāo)準(zhǔn)品為原料來制備競(jìng)爭(zhēng)抗原或者固相包被抗原，F(xiàn)B1不僅價(jià)格昂貴而且具有極強(qiáng)的致癌性，對(duì)檢測(cè)人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨(dú)特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來實(shí)現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進(jìn)展。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)的主要特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。
[0004]本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，從肽庫(kù)中篩選出能與靶分子(抗FB1單克隆抗體)特異性結(jié)合的多肽(抗原模擬表位)，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過獲得的FB1抗原模擬表位，以代替價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于FB1的免疫學(xué)檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明以抗FB1單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標(biāo)板上，投入噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫(kù)，進(jìn)行親和淘選，獲得了七種FB1的抗原模擬表位。它們的氨基酸序列如下:
NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、GDGVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERffP0
[0006]本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對(duì)應(yīng)為: AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG
、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG 上述抗原模擬表位(多肽)結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，Η代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Υ代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，Ε代表谷氨酸殘基，Μ代表甲硫氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，W代表色氨酸殘基，Ν代表天冬酰胺殘基，Α代表丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基。
[0007]本發(fā)明提及的FBI抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有FBI抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有FBI抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子。化學(xué)合成是指依據(jù)公布的FBI抗原模擬表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成?；蚬こ讨亟M表達(dá)的方式是指將編碼FBI抗原模擬表位的基因，通過克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行FBI抗原模擬表位的大量制備。
[0008]本發(fā)明還涉及所述伏馬菌素抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類型。
[0009]本發(fā)明伏馬菌素抗原模擬表位(NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、⑶GVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERWP)在應(yīng)用時(shí)，可以把合成的模擬表位用于免疫學(xué)檢測(cè)分析，將通過噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有FBi抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測(cè)，當(dāng)然，也可以將FBi抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替FBi標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。
[0010]還涉及伏馬菌素抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0011]還涉及伏馬菌素抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0012]前述伏馬菌素抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的FBi標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于FBi的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然FBi分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明伏馬菌素&抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的FBi標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于FBi的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然FBi分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了 FBi對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為以FBI抗原模擬表位建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為 y = -144.51n (x) + 196.18, R2 = 0.9609，IC5(I 值為 0.562ng/mL，線性檢測(cè)范圍為 0.171 ?2.420 ng/mL，最低檢測(cè)限為 0.121 ng/mL。

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1.FBi抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定 I) FB1抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，并以終濃度100 yg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用TBST (50mM NaCl, pH 7.5 包含 0.1% Tween-20 (v/v))洗滌 10 次后，加入 300 μ I 封閉液(3%BSA-PBS) 4°C孵育2小時(shí)。2小時(shí)后棄封閉液，用TBST洗滌5次，每孔加入100 μ I噬菌體肽庫(kù)(噬菌體展示十二肽庫(kù)，購(gòu)自NEB公司，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0X 111Pfu)，22-26°C振蕩反應(yīng)I小時(shí)。棄去未結(jié)合的噬菌體，用TBST洗滌10次，結(jié)合上的噬菌體用 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用 15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取10 μ I洗脫噬菌體測(cè)滴度，其余的用于感染20 mL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期的疋coli ER2738菌株進(jìn)行擴(kuò)增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測(cè)定擴(kuò)增后噬菌體的滴度。
[0016]在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗FB1單克隆抗體濃度分別為75 yg/mL和
50μ g/mL,所用的TBST濃度為0.25%和0.5%，其余步驟同上。
[0017]2)陽性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測(cè)定噬菌體滴度的平板中隨機(jī)挑取20個(gè)曬菌體斑,進(jìn)行曬菌體的擴(kuò)增,采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay, 1-ELISA)進(jìn)行陽性曬菌體克隆的鑒定,具體方法為:首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入100 μ?噬菌體斑擴(kuò)增液(1.0 X 111 pfu)，以原始噬菌體肽庫(kù)作為陰性對(duì)照，37 °C孵育I小時(shí)；加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 °C孵育I小時(shí)；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，酶標(biāo)儀(ThermoScientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取OD450大于陰性對(duì)照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。
[0018]3) FB1抗原模擬表位的鑒定:采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法進(jìn)行FB1抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標(biāo)板，4°C孵育過夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入50 μ?經(jīng)間接ELISA鑒定為陽性的噬菌體克隆(1.0XlO11 pfu)和50 μ? FB1標(biāo)準(zhǔn)品(濃度范圍為0_20 ng/ml)，37°C孵育I小時(shí)；加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗100 μ1，37?孵育I小時(shí)；加入ΙΟΟμΙTMB底物液，避光顯色5min，讀取OD45tl,能結(jié)合抗FB1單克隆抗體，且能被FB1標(biāo)準(zhǔn)品所阻斷的噬菌體，鑒定為FB1的抗原模擬表位。
[0019]實(shí)施例2.FB1抗原模擬表位編碼基因的測(cè)序及其氨基酸序列的確定
將經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定展示有FBl抗原模擬表位的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體的DNA測(cè)序模板。簡(jiǎn)要過程如下:進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，在第一步離心后，將800 μ?含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新離心管。加入200 μ? PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ?碘化物緩沖液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入 250 μ? 無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測(cè)序模板)。沉淀最終重懸于20 μ?滅菌水，取2 μ?進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 PL噬菌體模板進(jìn)行DNA測(cè)序，其-96 gill測(cè)序引物為:5’-h°CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得FB1抗原模擬表位的氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下:
NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、GDGVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERWP。
[0020]實(shí)施例3.FBi抗原模擬表位作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在ELISA中的應(yīng)用 (1)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman 1號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取1毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0021](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FBi單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育1小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。
[0022]( 3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有FBi抗原模擬表位的噬菌體(1.0X1011 pfu)和一系列不同濃度的50 μ? FBi標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育1小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗Ml3噬菌體二抗，37°C孵育1小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以FBi濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入FBi的孔的0D45(i/未加入FBi的孔的OD450X 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性相關(guān)性較好(圖1)。如圖1，以FBI抗原模擬表位(氨基酸序列為NNAAMYSEMATD)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為 y = -144.51n(x) + 196.18，R2 = 0.9609，IC50 值為 0.562ng/mL，線性檢測(cè)范圍為0.17Γ2.420 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.121 ng/mL。
[0023](4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有FBi抗原模擬表位的噬菌體(1.0X1011 pfu)和待測(cè)樣品提取液，37°C孵育1小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育1小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D.，計(jì)算結(jié)合率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中含量。
[0024]實(shí)施例4.FBi抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應(yīng)用 (1)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman 1號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取1毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0025](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有FBi抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 1011 pfu), 100微升包被于酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育1小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。
[0026](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗FBi單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? FBi標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育1小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育1小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以FBi濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入FBi的孔的0D45(i/未加入FB:的孔的OD45(iX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0027](4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗FB1單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? FB1標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以FB1濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入FB1的孔的OD45tl/未加入FB1的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]實(shí)施例5.FBi抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應(yīng)用
(I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0029](2)噬菌體及控制線的點(diǎn)陣
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有本發(fā)明FB1抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 111pfu)，用點(diǎn)陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米)，作為檢測(cè)線；將0.5 mg/ml的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，用點(diǎn)陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測(cè)線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。
[0030](3 )膠體金標(biāo)記FB1抗體
將FB1抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% PEG加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標(biāo)記的FB1抗體溶液。
[0031](4)膠體金檢測(cè)卡的組裝
將膠體金標(biāo)記的FB1抗體點(diǎn)噴于膠金墊上(1.0微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點(diǎn)陣了檢測(cè)線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進(jìn)行組裝，切成試紙條，裝入檢測(cè)卡中待用。
[0032](5)樣品的檢測(cè)
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有FB1且超過膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有FB1且低于膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。
[0033]實(shí)施例5 FB1抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴(kuò)增的方式
將展示有FBl抗原模擬表位的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養(yǎng)物中，37度220 rpm振蕩培養(yǎng)4.5 h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4 V 10000 rpm離心10 min，將上清的上部80 %轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 °C下靜置120 min。4°C 10000rpm離心PEG/NaCL靜置溶液15 min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImL TBS進(jìn)行重懸，即為噬菌體擴(kuò)增液。
[0034](2)以FB1抗原模擬表位-融合蛋白的方式進(jìn)行制備 A.PCR擴(kuò)增FBl抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應(yīng)體系:(50 μ? 10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2.5 mM)4 M-L
M13KE insert extens1n primer (10 mM)1 M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)1 M-L
噬菌體DNA模板1 μ?
Pyrobest DNA Polymerase0.5 M-L
滅菌 ddH2037.5 μ?
PCR 反應(yīng)條件:95°C 5 min，接著 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec，72°C10 min 共 30 cycles。
[0035]采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，微量核酸定量?jī)x定量。FBI抗原模擬表位的編碼基因序列分別對(duì)應(yīng)為:
AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG
B.外源編碼基因及表達(dá)載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對(duì)外源編碼基因和表達(dá)載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達(dá)MBP融合蛋白)進(jìn)行雙酶切。
[0036]C.酶切后產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒pMal-PIII和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取10 μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L感受態(tài)細(xì)胞ΤΒ1中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 s，立即冰浴5 min后補(bǔ)加600 μ L LB液體培養(yǎng)液，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)1 h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。
[0037]D.FBi抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達(dá)
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按1 %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，37°C，220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)菌濃度0D600達(dá)到
0.6時(shí)，向三瓶培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,220 r/min振蕩培養(yǎng)，將誘導(dǎo)物(PEG溶液)于4 °C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細(xì)胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細(xì)胞濕重)，加入EDTA至1 mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清，沉淀重懸于400 ml預(yù)冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4,獲得FBI抗原模擬表位-MBP融合蛋白。
【權(quán)利要求】
1.能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為:TRDKSSMLERWP。
2.編碼權(quán)利要求1所述能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，序列對(duì)應(yīng)為:
AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG。
4.權(quán)利要求1所述能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
6.如如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于能模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK104311638SQ201410529992
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】何慶華, 許楊 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)