一種豬Sox6蛋白的體外表達及其多克隆抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬Sox6蛋白的體外表達、多克隆抗體的制備的方法。該體外表達方法包括：設計引物PCR擴增豬Sox6基因；構建大腸桿菌重組表達載體pET-30a(+)-pSox6；將構建的且經(jīng)DNA測序鑒定正確的重組表達載體pET-30a(+)-pSox6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中；構建豬Sox6重組表達菌株；通過重組菌株誘導表達條件的優(yōu)化最大限度的獲得重組豬Sox6蛋白；鎳柱親和層析法純化得到高純度的重組豬Sox6蛋白。多克隆抗體的制備包括：以純化的重組豬Sox6蛋白為抗原多次注射免疫大鼠獲得豬Sox6多克隆抗體，采用ELISA法測定抗體效價和Western blot法鑒定抗體特異性。通過本發(fā)明方法，實現(xiàn)了豬Sox6蛋白的體外表達和制備出了抗體效價高、抗體特異性良好的豬Sox6多克隆抗體，完全可以滿足相關實驗的需要。
【專利說明】一種豬Sox6蛋白的體外表達及其多克隆抗體的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，特別涉及一種豬S〇x6蛋白的體外表達及其多克 隆抗體的制備方法。

【背景技術】
[0002] 豬肉是當今世界消費量最大的肉類產(chǎn)品。傳統(tǒng)的飲食習慣使豬肉及豬肉制品長期 以來占據(jù)著我國肉類消費的榜首。但隨著人們生活水平的提高，消費者對豬肉品質(zhì)的要求 也越來越高。豬肉品質(zhì)與肌纖維類型密切相關。提高I型肌纖維在肌肉中的比例可有效地 改善豬肉品質(zhì)。Sox6是轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的重要成員，參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，影 響肌肉中I型肌纖維的比例。因此，Sox6在豬肉品質(zhì)調(diào)控方面有潛在的應用。天然豬Sox6 存在于多種組織中，且以骨骼肌中的含量最豐富，但分離純化難度大，而化學合成豬Sox6 成本高，所以利用基因工程技術制備重組豬Sox6是解決上述問題的一個有效途徑。
[0003] 利用基因工程技術制備重組蛋白具有廣闊的應用前景。到目前為止，已發(fā)展了多 種蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，如原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、1?等真核細胞表達系統(tǒng)等。大腸桿菌 表達系統(tǒng)是最常用的一套原核表達系統(tǒng)，具有遺傳背景和生化特性清楚、生長快，成本低、 表達量高、表達產(chǎn)物分離純化相對簡單和便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。長期以來，人們用大腸桿 菌表達系統(tǒng)制備了無數(shù)種重組蛋白。
[0004] 申請?zhí)枺?01410006972.1，發(fā)明名稱：一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序列的方法 的專利申請公開了豬Sox6基因編碼區(qū)全序列，其完整編碼區(qū)的核苷酸序列如該申請中SEQ IDNo. 1所示，其編碼氨基酸序列如該申請中SEQIDNo. 2所示。但豬Sox6功能研究和應 用中迫切需要開發(fā)低成本、高產(chǎn)率、易純化的制備重組豬Sox6的方法。豬Sox6蛋白質(zhì)表達 水平檢測也迫切需要開發(fā)效價高、特異性好的豬Sox6多克隆抗體的制備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種低成本、高產(chǎn)率、易純化的豬Sox6蛋白體外 表達的制備方法，另外還提供一種效價高、特異性好的豬Sox6蛋白多克隆抗體的制備方 法。
[0006] 本發(fā)明公開了一種豬Sox6蛋白的體外表達方法，具體為：
[0007] (1)構建用于表達C端融合6XHis-Tag的重組豬Sox6的重組表達載體；
[0008] (I. 1)引物設計及PCR反應：
[0009]設計的上游引物（pET-30a(+)-pSox6F)為5, -CCCAATTCCATATG. TCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3'（下劃線為NdeI酶切位點，加粗部分為起始密碼子），下游引 物（pET-30a(+)-pSox6R)為 5, -AAACTCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3,(下劃線為XhoI 酶切位點）；
[0010] 以本實驗保存的含豬Sox6基因完整編碼區(qū)的pMD19T-pS0X6質(zhì)粒為模板進行豬 Sox6的PCR擴增（見申請?zhí)枺?01410006972. 1，發(fā)明名稱：一種克隆豬Sox6基因編碼區(qū)全序 列的方法hPCR反應體系為：ddH20 20μ1，上下游引物（ΙΟμπι)各1μl，cDNA3μl，2XTaq PCRmastermix25μ1(總反應體系為50μI)。PCR反應條件為：95°C預變性3min，然后進 行 95°C30s，55°C30s，72°C3min，共 35 個循環(huán)，最后再 72°C延伸IOmin;
[0011] (1. 2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收，回收產(chǎn)物用NdeI 和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接到經(jīng)同樣雙酶切的原核表達載體pET-30a(+)的NdeI和XhoI位點上（參見Novagen公司載體圖譜）；
[0012] (1. 3)獲得的重組表達載體pET-30a(+)-pSox6,經(jīng)酶切鑒定正確后，再經(jīng)DNA測序 驗證其序列正確性；
[0013] (2)重組表達菌株的構建
[0014] 將驗證正確的重組表達載體pET_30a(+) _pSox6經(jīng)化學法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株 Rosetta(DE3)中，在LB固體平板（含SOyg/ml卡那霉素）上37°C培養(yǎng)，挑取單菌落到4ml LB(含50μg/ml卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，按850μ1菌液加 入150μ1滅菌甘油，混勻后-80°C冰箱保存，保存的菌株即為重組表達菌株；
[0015] (3)豬Sox6的誘導表達及純化
[0016] (3. 1)豬Sox6的誘導表達
[0017] 將步驟⑵中保存的重組表達菌株按照1:500接種到4ml LB (含50 μ g/ml卡那 霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，按I :100轉(zhuǎn)接到15ml LB (含SOyg/ml 卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、280rpm至菌液OD6c?達到0. 4-0. 6，在30°C下于不同的IPTG 濃度（〇?3mmol/L)和不同的誘導時間（0?8h)進行誘導表達。分別收取不同條件誘導 表達后的Iml菌液，離心后棄上清，再各加入50 μ I 1XSDS-PAGE上樣緩沖液，KKTC加熱5 分鐘使蛋白質(zhì)變性，置于冰中冷卻，各取5μ 1進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析后 確定豬Sox6最優(yōu)表達條件；
[0018] (3. 2)豬Sox6蛋白的純化
[0019] 將步驟⑵中保存的重組表達菌株按照1:500接種到4mlLB(含50μg/ml卡那霉 素）液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，按1:100比例轉(zhuǎn)接到50mlLB(含50μg/ ml卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、280rpm至菌液OD6c?達到0. 4-0. 6,加入lmmol/LIPTG 誘導表達5h，IOOOOrpm離心10分鐘后棄上清，收集沉淀，向沉淀中加入3ml的鹽酸胍裂解 液（IOOmM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，6M鹽酸胍，pH8. 0)裂解1小時至溶液澄清，IOOOOrpm 離心15分鐘，收集上清，上清經(jīng)0. 45μm濾膜過濾后，使用鎳柱親和層析法對豬Sox6蛋白 進行純化，收集純化蛋白，-80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0020] 本發(fā)明豬Sox6多克隆抗體由以下方法制備：
[0021] 按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對純化后重組豬Sox6蛋白的蛋白濃度進行 測定。將純化后的重組豬Sox6蛋白作為抗原免疫大鼠。大鼠免疫前斷尾采血3ml，收集血 清作為陰性血清。第一次免疫用300μg純化的重組豬Sox6蛋白與等體積的弗氏完全佐劑 乳化后免疫大鼠，2周后用200μg純化的重組豬Sox6蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化 后第二次免疫大鼠，每隔10天再各用200μg純化的重組豬Sox6蛋白2次加強免疫，總共 4次免疫，最后一次加強免疫一周后采血，收集抗血清；陰性血清作為陰性對照，ELISA法測 定抗體效價，Western blot測定抗體特異性。
[0022] 在本發(fā)明的技術方案中，通過構建設計引物亞克隆豬Sox6基因，大腸桿菌重組表 達載體pET-30a(+)-pS〇x6的構建；將構建的重組表達載體pET-30a(+)-pS〇x6轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌菌株Rosetta (DE3)中，構建表達豬Sox6蛋白的重組菌株；對重組菌株進行誘導表達， 純化重組豬Sox6蛋白，以純化的重組豬Sox6蛋白為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制 備豬Sox6多克隆抗體。通過本發(fā)明的方法，實現(xiàn)了豬Sox6蛋白的體外表達和制備出了效 價高、特異性好的豬Sox6多克隆抗體，完全可以滿足相關實驗的需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：
[0024] 圖1是PCR擴增豬Sox6基因的瓊脂糖凝膠電泳示圖，其中M為DNA標準分子量； 1為PCR擴增產(chǎn)物；2為ddH20為模板的陰性對照；
[0025] 圖2是不同的IPTG誘導濃度對Sox6蛋白表達影響的SDS-PAGE示圖，其中M為蛋 白質(zhì)標準分子量；1為不含IPTG誘導菌體總蛋白；2為0. 25mmol/L IPTG誘導后的菌體總 蛋白；3為0. 5mmol/L IPTG誘導后的菌體總蛋白；4為0. 75mmol/L IPTG誘導后的菌體總 蛋白；5為lmmol/L IPTG誘導后的菌體總蛋白；6為2mmol/L IPTG誘導后的菌體總蛋白；7 為3mmol/L IPTG誘導后的菌體總蛋白；其中箭頭所標注為目的蛋白位置；
[0026] 圖3是不同的誘導時間對豬Sox6蛋白表達影響的SDS-PAGE示圖，其中M為蛋白 質(zhì)標準分子量；1為誘導〇小時的菌體總蛋白；2為誘導1小時的菌體總蛋白；3為誘導3小 時的菌體總蛋白；4為誘導4小時的菌體總蛋白；5為誘導5小時的菌體總蛋白；6為誘導6 小時的菌體總蛋白；7為誘導8小時的菌體總蛋白；其中箭頭所標注為目的蛋白位置；
[0027] 圖4是純化后重組豬Sox6蛋白的SDS-PAGE示圖，其中M為蛋白質(zhì)標準分子量，1 為純化后的重組豬Sox6蛋白，2為IPTG誘導5小時后的菌體總蛋白；3為IPTG誘導前的菌 體總蛋白；
[0028] 圖5是anti-His (C-term)單克隆抗體為一抗鑒定純化后重組豬Sox6的Western blot示圖；
[0029] 圖6是ELISA法評定抗體效價示圖；
[0030] 圖7是制備的多克隆抗體與重組豬Sox6蛋白的Western blot示圖。

【具體實施方式】
[0031] 下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例和附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、 完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基 于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0032] 實施例I :PET30a(+)-pSox6重組質(zhì)粒的構建與鑒定
[0033] 以本實驗保存的含豬Sox6基因完整編碼區(qū)的pMD19T-pS〇x6質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，PCR反應體系（總反應體系50μ1)為：CldH2O20μ1，上下游引物（10μm)各1μ1， cDNA3yl，2XTaqPCRmastermix25μ1。PCR反應條件為：95°C預變性 3min，然后進行 95°C30s，55°C30s，72°C3min，共 35 個循環(huán)，最后再 72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1% 的瓊 脂糖凝膠電泳進行鑒定。由圖1可見，在2250?3000bp間有一清晰的亮帶，與預期大小吻 合。
[0034]PCR產(chǎn)物參考OMEGA公司PlasmidMiniKitI核酸膠回收試劑盒說明書進行回 收。回收后的PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切后通過T4DNA連接酶插入到經(jīng)同樣雙酶 切的pET30a(+)表達載體中，16°C水浴連接6小時，構建pET30a(+)-pSox6重組質(zhì)粒，將重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a，在LB固體平板（含SOyg/ml卡那霉素）上于37°C 培養(yǎng)，挑選單菌落經(jīng)酶切鑒定正確后，再通過DNA測序驗證其序列正確性。測序結(jié)果表 明，所獲得的豬Sox6基因編碼區(qū)序列與預計相符。說明重組質(zhì)粒構建成功并將其命名為 pET30a(+)-pSox6。
[0035] 豬Sox6基因編碼區(qū)（不含終止密碼子）序列與pET30a(+)連接克隆測序結(jié)果為 SEQID. 1，其氨基酸序列為SEQID. 2。
[0036] 實施例2:豬Sox6在大腸桿菌中的表達
[0037] 1.獲得表達豬Sox6的重組表達菌株
[0038] 將實施例1中經(jīng)酶切鑒定和測序驗證正確的pET30a(+) -pS〇X6重組質(zhì)粒按照 OMEGA公司的E.Z.N.A質(zhì)粒小量提取試劑盒從克隆菌DH5α中提取出來，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表 達菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)中，在LB固體平板（含50μg/ml卡那霉素）上37°C培養(yǎng)篩 選重組子，此時獲得重組子為表達豬Sox6的基因工程菌。隨機選取1個單菌落進行劃線培 養(yǎng)，取少量長出的劃線培養(yǎng)菌接種于4mlLB(含50μg/ml卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，然后按850μ1菌液加入150μ1滅菌甘油，混勻后貯存于-80°C冰 箱，得到表達豬Sox6重組表達菌株。
[0039] 2.豬Sox6重組蛋白的表達
[0040] 將步驟1得到的豬Sox6重組表達菌株按1:500接種到4ml LB(含50 μ g/ml卡那 霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，活化重組表達菌株。
[0041] 2.IIPTG(異丙基硫代半乳糖苷）濃度對豬Sox6蛋白質(zhì)表達的影響
[0042] 將活化的重組表達菌株按1:100分別接種于15mlLB(含50μg/ml卡那霉素） 液體培養(yǎng)基中，37°C、280rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 6時加入IPTG，使其終濃度分別為 0mmol/L>0. 25mmol/L>0. 5mmol/L>0. 75mmol/L>l. 0mmol/L>2. 0mmol/L>3.Ommol/L,30 °C> 280rpm誘導培養(yǎng)5小時后各取Iml菌液離心取沉淀，用50μIIX蛋白上樣緩沖液重懸菌 體，100°C煮沸5分鐘，置于冰中冷卻，各取5μ1進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色、脫色 后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，確定目的蛋白占總蛋白的比例。
[0043]實驗結(jié)果表明（圖 2),IPTG在 0· 25mmol/L、0. 5mmol/L、0. 75mmol/L、I. 0mmol/L、 2. 0mmol/L、3. 0mm〇l/L終濃度條件下，目的蛋白占總蛋白的比例差別不大。后續(xù)實驗所采用 的IPTG終濃度為I. 0mmol/L。
[0044] 2. 2誘導時間對豬Sox6蛋白質(zhì)表達的影響
[0045] 將活化的重組表達菌株按1:100分別接種于15mlLB(含50μg/ml卡那霉素） 液體培養(yǎng)基中，37°C、280rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 6時加入IPTG，使其終濃度分別為 I.Ommol/L，30°C、280rpm分別在誘導培養(yǎng)0小時、1小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小 時各取Iml菌液離心取沉淀，用50μIIX蛋白上樣緩沖液重懸菌體，KKTC沸水水浴5分 鐘，置于冰中冷卻，各取5μ1進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色、脫色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng) 分析，確定目的蛋白占總蛋白的比例。
[0046]實驗結(jié)果表明（圖3)，誘導時間為1小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時 的條件下，目的蛋白占總蛋白的比例分別為22. 41%、26. 1%、33. 77%、34. 57%、32. 91%、 30. 69%。說明誘導時間為5小時，目的蛋白占總蛋白比例最1?。因此，后續(xù)實驗選擇30°C、 lmmol/LIPTG誘導5小時表達豬Sox6。
[0047] 實施例3:重組豬Sox6的分離純化及鑒定
[0048] 將活化的重組表達菌株按1:100接種于50mlLB(含50μg/ml卡那霉素）液體培 養(yǎng)基中，37°C，280rpm振蕩培養(yǎng)至0D_為0. 4-0. 6時加入IPTG，使其終濃度為分I.Ommol/ L，30°C、280rpm誘導5小時后IOOOOrpm離心10分鐘棄掉上清，向沉淀中加入3ml的鹽酸胍 裂解液（IOOmM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，6M鹽酸胍，pH8.0)在冰上裂解1小時至溶液澄 清；4°C，IOOOOrpm離心15分鐘，收集上清，上清經(jīng)0. 45μm濾膜過濾去除雜質(zhì)。豬Sox6蛋 白的純化方法參照上海生物工程技術有限公司的Ni-IDA瓊脂糖親和層析柱中的變性條件 下（Ni-Denature-GuHCl法）的方法純化。具體操作為：10倍柱體積的Ni-Denature-urea 緩沖液（IOOmM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，8M尿素，pH8.0)平衡柱子，控制流速為lml/ min;經(jīng)濾膜過濾后的Iml蛋白上清樣經(jīng)過純化柱，控制流速為lml/min; 10倍柱體積的 Ni-Denature-urea緩沖液沖洗柱子，控制流速為lml/min;5倍柱體積的Ni-Denature-250 緩沖液（IOOmM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，250mM咪唑，PH8. 0)洗脫純化柱，控制流速為 lml/min，收集洗脫液得純化蛋白，-80°C保存。取少量蛋白進行SDS-PAGE電泳純度分析和 WesternBlot鑒定。
[0049] 實驗結(jié)果表明，純化后的重組豬Sox6蛋白為單一的一條帶，其純度大于90% (圖4);經(jīng)anti-His(C-term)單克隆抗體（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）對純化蛋白進行 Westernblot鑒定后確定其為豬Sox6蛋白（圖5)。
[0050] 實施例4 :豬Sox6蛋白的多克隆抗體的制備及抗體效價和特異性評定
[0051] 經(jīng)實施例3WesternBlot步驟鑒定后，證實了純化的蛋白質(zhì)為重組豬Sox6蛋白。 將純化后的重組豬Sox6蛋白作為抗原免疫大鼠，純化后重組豬Sox6蛋白的蛋白濃度按照 BCA蛋白濃度測定試劑盒說明進行測定。大鼠免疫前斷尾采血3ml，收集血清作為陰性血 清。第一次免疫用300μg純化的重組豬Sox6蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化后免疫大 鼠，2周后用200yg純化的重組豬Sox6蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后第二次免疫 大鼠，每隔10天再各用200μg純化的重組豬Sox6蛋白2次加強免疫，總共4次免疫，最后 一次加強免疫注射Sox6蛋白一周后采血，收集抗血清；用ELISA法（陰性血清作為陰性對 照）測定抗體效價，用Westernblot方法測定抗體特異性。
[0052] 稀釋后的抗血清在490nm吸光度大于免疫前（陰性對照）血清2. 1倍時的最高稀 釋倍數(shù)定義為抗體的效價。實驗結(jié)果表明，經(jīng)ELISA法測定制備的Sox6多克隆抗體抗血清 效價約為1:40960(圖6);制備的Sox6多克隆抗體的抗體特異性經(jīng)Westernblot分析得 出其特異性良好（圖7)。
[0053] 上述實施方式旨在舉例說明本發(fā)明可為本領域?qū)I(yè)技術人員實現(xiàn)或使用，對上述 實施方式進行修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，故本發(fā)明包括但不限于 上述實施方式，任何符合本權利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、 創(chuàng)造性特點的方法、工藝、產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于，包括以下步驟： a. 以含豬Sox6基因完整編碼區(qū)的pMD19T-pS〇x6質(zhì)粒為模板PCR擴增豬Sox6基因； b. 構建用于表達豬Sox6蛋白的大腸桿菌重組表達載體； c. 利用步驟b所得的重組表達載體經(jīng)化學法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株Rosetta (DE3)中，構建 重組表達菌株； d. 培養(yǎng)步驟c所得重組表達菌株至0D_達到0. 4-0. 6,加入誘導劑IPTG，誘導表達豬 Sox6蛋白； e. 純化誘導表達的豬Sox6蛋白。
2. 如權利要求1所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于步驟a中，用于PCR 擴增的上游引物為 5' -CCCAATTCCATATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3'，下游引物為 5' -AAAC TCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3,。
3. 如權利要求1或2所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于步驟a中PCR 反應體系為：ddH20 20 ii 1，上下游引物各 lii l，cDNA l，2XTaqPCR master mix 25ii 1 ; PCR反應條件為：95°C預變性3min，然后進行95°C 30s，55°C 30s，72°C 3min，共35個循環(huán)， 最后72°C延伸lOmin。
4. 如權利要求1所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于步驟b中所使用的大 腸桿菌表達載體為pET-30a(+)，克隆豬Sox6基因的插入位點為Nde I和Xho I酶切位點。
5. 如權利要求4所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊 脂糖凝膠電泳分析并切膠回收，回收產(chǎn)物用Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接到 經(jīng)同樣雙酶切的大腸桿菌表達載體pET_30a(+)的Nde I和Xho I位點上。
6. 如權利要求1所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于所述步驟d中，誘導 表達條件為IPTG終濃度1. Ommol/L，誘導表達5小時。
7. 如權利要求1或6所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于步驟d、e中誘 導純化方法為：將步驟c中的Sox6重組表達菌株按照1:500接種到4ml LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，按1:100比例轉(zhuǎn)接到50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C、280rpm至 菌液〇D_達到0. 4-0. 6,采用誘導表達條件為IPTG終濃度1. 0mm〇l/L，誘導表達5小時，表 達完成后，l〇〇〇〇rpm離心10分鐘后棄上清，收集沉淀，向沉淀中加入3ml的鹽酸胍裂解液裂 解1小時至溶液澄清，lOOOOrpm離心15分鐘，收集上清，上清經(jīng)0. 45 y m濾膜過濾后，使用 鎳柱親和層析法對豬Sox6蛋白進行純化，收集純化蛋白，-80°C保存?zhèn)溆茫?其中，所述LB液體培養(yǎng)基中含有50 y g/ml卡那霉素；所述鹽酸胍裂解液含100mM磷酸 二氫鈉、300mM氯化鈉、6M鹽酸胍，pH為8. 0。
8. 如權利要求1所述的豬Sox6蛋白體外表達的方法，其特征在于，所述豬Sox6蛋白C 端帶有6個組氨酸標簽。
9. 一種豬Sox6多克隆抗體的制備方法，其特征在于：將權利要求1-8制得的重組豬 Sox6蛋白作為抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，第一次免疫采用300 ii g重組豬Sox6蛋白與 等體積的弗氏完全佐劑乳化后注射大鼠，2周后用200 y g重組豬Sox6蛋白與等體積的弗氏 不完全佐劑乳化后第二次免疫大鼠，在以后20天內(nèi)再次進行2次加強免疫，每10天1次， 總共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。
10. 如權利要求9所述的豬Sox6多克隆抗體的制備方法，其特征在于在免疫前對大鼠 端尾采血3ml，收集血清作為陰性血清，以陰性血清作為陰性對照，用ELISA法對豬Sox6多 克隆抗體進行抗體效價評定、用Western blot法評定抗體特異性。
11. 一種根據(jù)權利要求9所述的豬Sox6多克隆抗體的制備方法制備的豬Sox6多克隆 抗體。
【文檔編號】C07K16/18GK104357474SQ201410553886
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權日:2014年10月17日
【發(fā)明者】黃志清, 陳小玲, 徐孟, 溫萬雪, 王曉燕, 常帥, 陳代文, 余冰 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學