一種調(diào)控植物耐鹽性的棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY22及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棉花耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，即棉屬野生種旱地棉WRKY基因GarWRKY22，具有序列表中SEQ ID N0.2的序列。本發(fā)明利用電子克隆及RT-PCR技術(shù)分離了一個棉花耐逆性相關(guān)蛋白GarWRKY22，通過轉(zhuǎn)化擬南芥進行功能驗證，證明所述該轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控耐鹽性，過表達該基因，植株抗鹽能力明顯降低。
【專利說明】-種調(diào)控植物耐鹽性的棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY22及應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種負調(diào)控植物耐鹽性的棉花轉(zhuǎn)錄因子 GarWRKY22。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個世界性問題，它是影響農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和導(dǎo)致農(nóng)業(yè) 欠收的一個重要因素。全世界鹽漬土面積約10億hm2,我國地域遼闊，海岸線長，既有大量 的濱海鹽堿地，又有內(nèi)陸鹽堿地，我國鹽漬土面積總計約1億hm2,有670萬公頃屬鹽堿土耕 地，有2千萬公頃鹽堿荒地尚待開發(fā)，而且這個數(shù)據(jù)仍在上升，另外北方灌溉地區(qū)的次生鹽 漬化土地生產(chǎn)潛力還有待進一步挖掘。江蘇濱海灘涂地約為60多萬hm2,其中只有少部分 改良利用，絕大部分仍未脫鹽及不斷遭受鹽漬危害。面對人口增長，工業(yè)發(fā)展，耕地面積逐 漸減少的趨勢，鹽堿地的改良和利用已經(jīng)得到各方面的極大重視；一直以來，有關(guān)鹽漬土的 開發(fā)利用主要采取兩種措施：一是通過工程措施來改良鹽漬土，如通過暗管排水處理等方 法；二是開展生物治理，即通過農(nóng)業(yè)生物技術(shù)培育耐鹽植物品種或開發(fā)利用有經(jīng)濟價值的 鹽生植物資源以改良鹽漬土。前者雖然取得了一定效果，但耗資巨大，且治理效果難以長久 保持；而后者已成為改良鹽漬土的研究熱點，耐鹽作物品種的選育和利用將是鹽堿地改良 的一個基本方向。棉花屬中等耐鹽作物，是鹽堿地先鋒作物。近年來，隨著人口增加、耕地 面積減少，糧棉油安全供給的矛盾日益突出。進一步發(fā)掘棉花抗脅迫能力，將棉花生產(chǎn)向沿 海灘涂及內(nèi)陸鹽堿地轉(zhuǎn)移，對緩解糧棉爭地矛盾，穩(wěn)定植棉面積，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā) 展具有十分重要的意義。
[0003] 植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來新發(fā)現(xiàn)的植物特有新型鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。WRKY 通過特異結(jié)合靶基因啟動子中的W盒（T) (T)TGAC(C/T)，來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，參與植 物對非生物脅迫的應(yīng)答，最終使植物體內(nèi)某種脅迫達到平衡。目前，在多種植物中都已發(fā)現(xiàn) WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并在一些模式植物的研究中解析了該轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答逆境脅 迫的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，棉花中也發(fā)現(xiàn)了不少WRKY轉(zhuǎn)錄因子，但棉花中的與耐鹽相關(guān)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮少報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種調(diào)控植物耐鹽性的棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因GarWRKY22,所述基因 cDNA核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0005] 所述的調(diào)控植物耐鹽性的棉花GarWRKY22基因編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中SEQ IDNO. 3所述的氨基酸序列。
[0006] 本發(fā)明提供了含有上述棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY的植物 表達載體PCAMBIA2301。 將GarWRKY22基因克隆到pCAMBIA2301， 獲得 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarffRKY22〇
[0007] 本發(fā)明所述基因GarWRKY22在培育耐鹽植物中的應(yīng)用。具體是將GarWRKY22基因 通過植物表達載體轉(zhuǎn)入目的植物內(nèi)。所述植物優(yōu)選是模式植物擬南芥。
[0008] 本發(fā)明的有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，利用電子克隆及RT-PCR技 術(shù)，分離與鑒定棉花耐鹽相關(guān)基因序列信息，并通過根癌農(nóng)桿菌浸花法將基因轉(zhuǎn)入擬南芥， 經(jīng)過耐鹽表型鑒定證明轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽力明顯降低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖lGarWRKY22基因全長cDNA序列的擴增結(jié)果。
[0010] 圖2實時熒光定量PCR法（qRT-PCR)分析鹽處理不同時期GarWRKY22基因
[0011] 在根中的表達情況。
[0012] 圖3實時熒光定量PCR法（qRT-PCR)分析鹽處理不同時期GarWRKY22基因
[0013] 在葉片中的表達情況。
[0014]圖 4 植物表達載體pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY22 的構(gòu)建
[0015] (a)大腸桿菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY 22PCR檢測電泳結(jié)果
[0016] (b)pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY22 的酶切鑒定。
[0017] 圖5轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
[0018] PCR擴增載體pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY22抗性擬南芥目的基因。
[0019] 圖6轉(zhuǎn)基因煙草及野生型對照在不同濃度NaCl處理下的生長
[0020] 生長在含不同濃度NaCl的MS培養(yǎng)基上。
[0021] 圖7根系長度的測量NaCl條件下，正常培養(yǎng)一周的根長表現(xiàn)。此圖表示0mM、100mM 150mMNaCl條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率的統(tǒng)計分析。

【具體實施方式】
[0022] 實施例I、GarWRKY22基因的獲得
[0023]I. IRNA的提取
[0024]提取RNA
[0025] (1)取0.5g新鮮棉花組織，加入0·Ig交聯(lián)聚乙烯砒咯烷酮（PVPP)，在液氮中充分 研磨至粉末，將凍粉末迅速轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加5mlCTAB提取液與500μL0.IMpH8. 0 的Tris-HCl，65°C水浴20min，中途翻轉(zhuǎn)混勻；
[0026] (2)加等體積氯仿充分混勻，冰浴靜置IOmin;
[0027] (3)4°C,IOOOOrpm離心 20min。分裝于 4 個I. 5ml離心管；
[0028] (4)吸上清，加入1/3體積的8MLiCl混勻，-70°C30min或-20°C過夜；
[0029] (5) 4°C，IOOOOrpm離心20min。棄上清，70 %乙醇洗滌兩次后，吹干沉淀溶解于 30μLDEPC水；
[0030] (6)加入IOU無RNase活性的DNase和25URNaseInhabitor，IOXbuffer消化 30min后加等體積氯仿，抽提一次；
[0031] (7)上清轉(zhuǎn)移到新管中，加1/10體積的3MpH5. 2NaAc和等體積的異丙醇或2. 5 倍體積的無水乙醇，_20°C放置過夜或_70°C冰浴3h;
[0032] (8) 4°C，IOOOOrpm離心20min，棄上清，70 %乙醇洗滌兩次后溶解于30μLDEPC 水。即得棉花RNA。
[0033]I. 2cDNA的合成
[0034]體系：
[0035]cDNA第一鏈的合成
[0036] 模板（上述無DNA污染的RNAIOOng) 6μL OIigdTM川引物（50μΜ) IpL dNTP(IOmM) 2μ? RNase抑制劑（4〇υ/μ? ) 0.5,uL DEPC水 6μ!_
[0037] 65°C(IOmin)-冰上放置（2min)
[0038]M-MLV(反轉(zhuǎn)錄酶，takara，200UμI71) 0· 5μL
[0039] 5Xbuffer 4μL
[0040] 42°C(2h) - 70°C(IOmin) - 4°C
[0041] 1.3cDNA克隆
[0042]根據(jù)本實驗室旱地棉轉(zhuǎn)錄組測序（Xuetal.，2013)(Denovotranscriptome sequencingandcomparativeanalysisofdifferentiallyexpressedgenesin Gossypiumaridumundersaltstress)獲得的6個EST序列，序列拼接得到一長為 1888pb 長的序列，其核酸序列如SEQIDNO. 1所示。用軟件ORFFinder(http://www.ncbi.nlm. niLgov/gorf/gorf.html)預(yù)測完整0RF。在ORF序列兩側(cè)設(shè)計上游引物5'-ATGGCTGCTTCAT CATCATCTGC-3'（SEQIDN0·4)和下游引物5'-TCAAGACAGTAATCCGTCCA-3'（SEQIDN0·5)， 用旱地棉cDNA(由步驟1. 2合成的）進行RT-PCR，得到包含整個編碼框的GarWRKYcDNA克 隆，全長1530bp(SEQIDN0.2(圖1)。回收該片段，克隆至PTG19-T-載體（北京全式金生物 技術(shù)有限公司）中鑒定、測序。參照文獻caietal.，2014(Genome_wideanalysisofthe WRKYtranscriptionfactorgenefamilyinGossypiumraimondiiandtheexpression oforthologsincultivatedtetraploidcotton)，我們將分離得到的旱地棉WRKY基因 命名為GarWRKY22,其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0043]L3.IPCR反應(yīng)體系（50μL)
[0044] cDNA IpL IOχEasyPIu buHer 5μL 2.5mM dNTP 4pL Primcrl (I ΟμΜ) 2μ? Primcrl (1 ΟμΜ) 2μ?, EasyPlu DNA Polymerase Ιμ? 50mM MgSO4 CldH2O 34pL
[0045]L3· 2PCR擴增程序：94°C3min;94°C30sec, 6(TC30sec, 72°C3min, 34 個循環(huán)； 72°CIOmin;4°C保溫。
[0046]C、擴增得到該基因的ORF序列，回收擴增產(chǎn)物，并克隆到PTG19-T載體，篩選陽性 克隆,測序由上海英俊公司完成。
[0047] 1. 4基因表達分析（qRT-PCR)
[0048] 1. 4. 1鹽脅迫下RNA的提取
[0049] 材料棉屬野生種旱地棉，將旱地棉種子播于盆缽中等待發(fā)芽，發(fā)芽后約3天待子 葉展開，將只有主根的小苗從土中取出，洗去根上的泥土，將苗浸在營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待長至 4-6片真葉時，用含200mMNaCl溶液（其中CNa+:Cea2+為15:1)的營養(yǎng)液按不同的處理時間 (0h、lh、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h)處理苗，分別取葉片、根，提取RNA，方法同上。
[0050]L4. 2 逆轉(zhuǎn)錄（RT)產(chǎn)生cDNA
[0051] 方法同上。
[0052]L4. 3PCR反應(yīng)
[0053] ①以cDNA為模板，引物為
[0054]GarWRKY22-RT-F:5 '-ACTTGTAATAACTGCGTGG-3，（SEQIDNO. 6)
[0055]GarWRKY22-RT-R:5 '-CCAATACCATCAAACATCACAG-3'（SEQIDNO. 7)
[0056] ②PCR反應(yīng)體系：
[0057] SYBR Premix Ex Taq (2χ) IOiLiL GarCIPK-RT-F (10μΜ) 0.4pL GarCIPK-RT-R ( ΙΟμΜ) 0.4μ? ROX Reference Dye Il (5〇x) 0.4μ? cDNA 2·0μ? ddH20 6·8μ?
[0058]③PCR程序：
[0059] 將PCR反應(yīng)的組分別加于qRT-PCR專用96-孔板（AppliedBiosystems)中， 加蓋專用的高透光率封口膜（AppliedBiosystems)，用AppliedBiosystems7500Fast Real-Time PCR System)進行qRT-PCR，采用兩步法PCR擴增標準程序：95 °C 30sec ; 95°C 5sec，6(TC 34sec共40個循環(huán)；95°C 15sec, 6(TC lmin, 95°C 15sec。
[0060] 每個樣品三次重復(fù)。
[0061] 反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和溶解曲線，可以通過溶解曲線分析確認PCR反應(yīng)大的 特異性。計算CT值，結(jié)果見圖2、3。
[0062] 實施例2、植物表達載體的構(gòu)建
[0063] 2. lpCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY22植物表達載體的構(gòu)建
[0064]植物表達載體pCAMBIA2301-CaMV35S質(zhì)粒（馮娟等·，2013;棉屬野生種 旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆與功能分析）。選用BamH I和Knp I分別對 pCAMBIA2301-CaMV35S和目的基因片段GarWRKY22進行酶切，回收載體大片段和目的基因 片段，用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài)細胞（購自北京全式金生物技術(shù) 有限公司），鑒定重組子后即得到帶有目的基因的植物表達載體。
[0065]pCAMBIA2301_CaMV35S質(zhì)粒和目的基因片段的酶切
[0066] 質(zhì)粒雙酶切體系如下：
[0067] IOxKbulTbr 5pL pCAMBIA 2301 -CaMV35S質(zhì)粒 25μΕ BamH I 2μL
[0068] Knp I 2'liL 無Ilf dd H2O 16μ?
[0069] 于30°C酶切，反應(yīng)時間> 5h。雙酶切后瓊脂糖凝膠對雙酶切產(chǎn)物進行電泳檢測， 結(jié)果見圖4。
[0070] GarWRKY22片段雙酶切體系：
[0071] l〇xKbu!Tcr 5nL GarWRKY22 PCR.產(chǎn)物 40μ? BamH I 2μL Knp I 2uL
[0072] 30°C酶切過夜
[0073] 回收pCAMBIA2301-CaMV35S載體大片段和目的基因片段。
[0074] 2. L 1基因與酶切得到的pCAMBIA2301大片段的連接
[0075] 連接反應(yīng)體系：
[0076] pCAMBIA2301-CaMV35S酶切回收的大片段產(chǎn)物 5pL WRKY片段雙酶切產(chǎn)物 3pL IOxligasebufl'cr 1μι Τ4DNAligasc
[0077] 16°C連接過夜。
[0078] 2.I. 2轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0079] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含Ampl00mg/L的LB液體培養(yǎng)基中37°C振 蕩培養(yǎng)。
[0080] 2. 1.4重組子的鑒定
[0081] ①PCR鑒定
[0082] ②挑取單菌落接種于1.5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，用 GarWRKY22 基因特異性引物GarWRKY22F-BamHI:5'-CGCGGATCCGATGGCTGCTTCATCATCATCTG C-3'（SEQIDN0.8)和GarWRKY22R-KpnI:5'-CGGGGTACCTCAAGACAGTAATCCGTCCA-3'-3(SE QIDNO. 9)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預(yù)期片段。PCR反應(yīng)程序如下：： 94°C5min;94°C30sec, 55°C45sec, 72°Clmin30sec, 36 個循環(huán)；72°CIOmin;4°C保溫。質(zhì) 粒的酶切鑒定
[0083] 用堿變性法提取質(zhì)粒，選取BamHI和KnpI酶進行酶切，酶切體系同上，瓊脂糖凝 膠電泳檢測是否有預(yù)期片段。
[0084]③pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY22提取和保存
[0085] 挑?、俸廷阼b定的陽性單菌落接種于5mL含卡娜青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C 過夜振蕩培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒（AxyPrepPlasmidMiniprepKit,康寧生命科學(xué)有限公 司）提取質(zhì)粒并將質(zhì)粒保存在_20°C備用。
[0086] 實施例3、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
[0087] 3. 1農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備
[0088] (1)挑取EHA105單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過 夜至0D600值為0. 4;
[0089] (2)以I:100接種于400-500mlLB培養(yǎng)基中（1L三角瓶中），搖菌至0D600為 0· 6-0. 8,冰浴IOmin;
[0090](3)預(yù)冷的50ml離心管中收集菌液，4°C，5000rpm，離心5min;
[0091] (4)棄上清，沉淀用無菌水充分懸浮，4°C，5000rpm，離心5min;重復(fù)此過程3次，。
[0092] (5)向洗好的菌體中加Iml(根據(jù)菌體多少而定）含10%無菌甘油重懸浮細胞。
[0093] (6)分裝成50μL每管，液氮速凍，置于_80°C備用。
[0094] 3. 2電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105
[0095] 1.取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞于冰上凍融。
[0096]2·力卩 2μIPCAMBIA23Ol-CaMV35S-GarWRKYM質(zhì)粒DNA于 5〇μ1 感受態(tài)細胞中，用 槍頭輕輕攪拌混勻。
[0097] 3.取出細胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中（電擊杯_20°C預(yù)冷），吸干電擊杯表面 的水，將電擊杯放入電轉(zhuǎn)化儀的電極之間，在2400V高壓下電擊4-5s。
[0098] 4.取出電擊杯，迅速加入ImlLB液體培養(yǎng)基不含抗生素），混勻并轉(zhuǎn)移混合液到 I. 5ml離心管中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)3h。
[0099] 5.取IOOul菌液涂布于含Rif(50mg/L)和Kan(100mg/L)LB平板上，28°C倒置培養(yǎng) 2-3 天。
[0100] 注：
[0101] 1.細胞與質(zhì)粒的混合物應(yīng)沿槽壁慢慢加入電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡。
[0102] 2.電擊前擦干電擊杯外側(cè)。
[0103] 3.涂板菌液量可根據(jù)菌液濃度作調(diào)整。
[0104] 3. 3菌體PCR鑒定
[0105] 菌體PCR方法及程序同上（同步驟2. 1. 4)。
[0106] 3. 4含GarWRKY22基因的農(nóng)桿菌的保存
[0107] 挑取3. 3鑒定的陽性克隆接種到5mlLB(50mg/L的Rif和100mg/L的Kan)中 28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)1-2天直到0D600 = 0. 6-1. 0。然后向滅菌的I. 5ml離心管加入滅 菌的50%的甘油300μ1和菌液700μ1，混勻，保存于-80°C的冰箱中備用。
[0108] 實施例4、轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)基因功能驗證
[0109] 4.1浸花法侵染擬南芥
[0110] 4.I. 1轉(zhuǎn)化液的配置（現(xiàn)配現(xiàn)用）
[0111] 1/2MS
[0112] Sucrose: 5%
[0113]silwette-775μl/100ml
[0114] PH: 5. 8
[0115] 4.I. 2 轉(zhuǎn)化
[0116] I.選擇盆中長出約20-30個花絮的擬南芥，剪掉已成熟的果莢，轉(zhuǎn)化前2-3天澆足 水。
[0117] 2.用接種環(huán)將3. 4保存的含GarWRKY22基因的農(nóng)桿菌接種到1.5ml離心管中 28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)1-2天。
[0118] 3.取 5ul到 50mlLB(50mg/L的Rif和 100mg/L的Kan)培養(yǎng)基中，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)直到OD6tltl = 0· 6-1. 0
[0119] 4.700g離心5分鐘
[0120] 5.棄上清，收集菌體，用IOOrnl的MS轉(zhuǎn)化液重懸浮菌體備用
[0121] 6.將待轉(zhuǎn)化的植株倒置于MS轉(zhuǎn)化液中45s(花蕾要全部浸入轉(zhuǎn)化液中）。
[0122] 7.套袋，暗光培樣24h后至于正常培養(yǎng)條件下。
[0123] 8. -周后再轉(zhuǎn)化一次，步驟同上。
[0124] 4. 2轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定
[0125] 4. 2.1 播種
[0126] 1.將待播種子裝于2ml的EB管中
[0127] 2.70%的乙醇&八）消毒1-31^11，無菌水洗一次
[0128] 3. 15% 的NaClO(v/v)消毒 5min，9000rpm離心 2 分鐘
[0129] 4.無菌水清洗3-5次
[0130] 5.加適量的無菌水
[0131] 6. 4°C暗培養(yǎng) 2-3 天
[0132] 4. 2. 2陽性植株的鑒定
[0133] 1.將收獲的TO代種子播于含IOOmgL- 1卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，2周后觀 察，轉(zhuǎn)基因植株長出真葉并呈綠色，表型正常，而非轉(zhuǎn)基因植株生長停留在子葉期，并且 呈黃。
[0134] 2.將長出真葉并呈綠色的擬南芥植株移栽到土質(zhì)基質(zhì)上，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng) 數(shù)周
[0135] 3.采集葉片進行基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平的PCR驗證，PCR擴增轉(zhuǎn)基因植 株的基因組DNA為模板，引物用基因特異性引物GarWRKY22F-BamHI(SEQIDNO. 8)， GarWRKY22R-KpnI(SEQIDNO. 9)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上，結(jié)果見圖5。
[0136] 4. 3擬南芥轉(zhuǎn)化系的抗性鑒定
[0137] 4. 3.1 播種
[0138] 選取Tl代擬南芥轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子，將消毒的野生型（作為對照）及Tl 代純合體種子分別平鋪到1/2MS播種培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2-3d;然后放置18/22°C，16hr光照 /8hr黑暗的條件下培養(yǎng)。
[0139] 4. 3. 2幼苗耐逆性試驗的鑒定
[0140] 當植株根長為Icm時，選取根長長勢基本一致的野生型植株和轉(zhuǎn)基因陽性植株 植，分成兩組，分別轉(zhuǎn)移至含OmML-1、IOOmML-1濃度NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，8/22°C，16hr 光照/8hr黑暗的條件下培養(yǎng)，選取轉(zhuǎn)基因植株3個家系做處理，每個處理至少10株苗。繼 續(xù)培養(yǎng)10天后，觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥幼苗的生長情況。整個生長過程中，MS 平板垂直放置。
[0141] 如圖6、7所示，在OmmolL-INaClMS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系與野生型的根長和生 長情況無顯著差異，在含IOOmmolL-INaCl的MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株均表 現(xiàn)出鹽脅迫傷害，轉(zhuǎn)基因植株主根長顯著短于野生型。在200mmolL-INaCl的MS培養(yǎng)基 上，轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株表現(xiàn)出鹽脅迫傷害且植株明顯黃化，且主根長顯著短于野生 型。
【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控植物耐鹽性的棉花轉(zhuǎn)錄因子GaWRKY22,其特征在于它的序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物耐鹽性的棉花轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY22編碼的蛋白質(zhì)，其特 征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 含有權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物耐鹽性的棉花轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY22的表達載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于，是 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarffRKY22〇
5. 權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物耐鹽性的棉花轉(zhuǎn)錄因子GarWRKY22在培育耐鹽植物中的 應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，是將GarWRKY22基因通過植物表達載體轉(zhuǎn) 入目的植物內(nèi)。
【文檔編號】C07K14/415GK104327173SQ201410568327
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】沈新蓮, 范昕琦, 徐鵬, 郭琪, 張香桂 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院