固相片段法制備豬o型口蹄疫合成肽抗原2800的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，以樹脂為起始原料，依次連接具有9-芴甲氧羰基保護的氨基酸，制備保護的肽段片段，期間依次脫去9-芴甲氧羰基基團，用縮合劑進行接肽反應，以稀酸或弱酸切斷得到保護的肽段片段；將片段逐步連接上4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基類樹脂，再與T輔助細胞表位連接；以酸切除保護基團及樹脂，得到合成肽抗原2800粗肽；經(jīng)過離子交換樹脂以及切向流膜包系統(tǒng)純化、濃縮系統(tǒng)去除小分子及鹽后得到合成肽抗原2800。本發(fā)明的方法具有工藝穩(wěn)定、生產周期短、原輔料來源方便、三廢少、生產成本低、收率高等特點。
【專利說明】固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2800的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種固相片段法制備豬〇型口蹄疫合成肽抗原2800的方法。

【背景技術】
[0002] 豬0型口蹄疫合成肽抗原2800結構式如下：
[0003]

【權利要求】
1. 一種固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特征在于，所述方法 包括如下步驟： 步驟1、將2-氯-3-苯甲基氯樹脂、三苯甲基醇樹脂或4-羥甲基-3-甲氧基丁酸樹脂 置于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中10?120min，充分溶脹，所得 溶脹樹脂溶液中樹脂的濃度為〇. 05?0. 2g/ml ; 步驟2、向步驟1所得溶脹樹脂溶液中加入9-芴甲氧羰基保護的氨基酸和二異丙基乙 基胺或9-芴甲氧羰基保護的氨基酸和縮合劑，于10?45°C反應15?60min ;抽干，加入封 閉試劑反應15?30min以封閉未反應的基團，以N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷 酮洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試劑脫除氨基酸的9-芴甲氧羰基保護基，洗滌后加入接肽試劑 進行接肽反應得到肽樹脂鏈，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾、羧基端連接樹脂如下序列： SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ; 步驟3、將步驟2所得肽樹脂鏈加入到稀酸或弱酸溶液中，于10?45°C反應60? 90min，加入2, 4, 6-三甲基吡啶或二異丙基乙基胺中后，過濾；濾液濃縮，加入醇類、醚類或 烷類溶劑析出保護肽固體，過濾收集濾餅真空干燥得到肽段，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修 飾的如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5; 步驟4、將4-(4' -二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基）-苯氧甲基類樹脂置于二氯甲烷、 N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中30?60min，充分溶脹，溶脹樹脂溶液中樹脂 的濃度為〇? 05?0? 2g/ml ; 步驟5、向步驟4所得溶脹樹脂溶液中加入脫除試劑，于10?45°C反應15?30min， 用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù)次，加入接肽試劑，連接第 一個氨基酸到樹脂上，于10?45°C反應0. 5?3. 0h，抽干，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰 胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂數(shù)次，再加入脫除試劑進行脫除反應脫除9-芴甲氧羰 基，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌后，加入9-芴甲氧羰基保 護的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基胺的接肽試劑全溶物進行接肽反應，得到肽樹脂即氨基 端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾、羧基端連接樹脂的SEQ ID No:2; 步驟6、將步驟5所得肽樹脂用溶脹劑充分溶脹，加入脫除試劑脫除9-芴甲氧羰基，于 10?45°C反應15?30min，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù) 次，依次加入氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID N〇:3、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲 基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No:4、縮合劑、二異丙基乙 基胺的N-甲基-2-批咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID N〇:5、縮合劑、 二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；于10?45°C反應0. 5?3. 0h，抽干；每加 入一個肽段都要用N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試 劑脫除9-芴甲氧羰基，得到全保護肽樹脂，即羧基末端連接樹脂的依次包括SEQID No: 5、 SEQ ID No:4、SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:2 的序列； 步驟7、向步驟6所得全保護肽樹脂中加入T輔助細胞表位、縮合劑的全溶物，于10? 45°C反應0. 5?6. 0h，抽干，依次用二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇洗滌樹脂數(shù)次得 到全保護的抗原肽2800樹脂，即氨基端經(jīng)T輔助細胞表位修飾、羧基末端連接樹脂的依次 包括 SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:2 的序列； 步驟8、將預冷至-10?KTC的切斷液加入到步驟7所得抗原肽2800樹脂中切除所有 保護基團及樹脂載體，于10?45°c反應2?4h，過濾；濃縮濾液后加入甲基叔丁基醚析出 沉淀，用甲基叔丁基醚洗滌沉淀數(shù)次后干燥得未環(huán)化的抗原肽2800粗品，即氨基端經(jīng)T輔 助細胞表位修飾的SEQ ID No: 1 ; 步驟9、步驟8所得抗原肽2800粗品溶于二甲亞砜水溶液，調節(jié)pH值至6. 0?8. 0的 條件下進行完全環(huán)化，即得環(huán)化的抗原肽2600。
2. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其 特征在于，步驟2中，所述9-芴甲氧羰基保護的氨基酸的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的 1?3倍； 所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的1?7. 5倍； 所述縮合劑包括2-(1H-苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、0-(7-氮雜 苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、2-(1H-苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基 脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中的一種；所述縮合劑的摩爾 數(shù)是溶脹樹脂溶液中樹脂的1?5倍； 所述封閉試劑為體積比為5:4:1的二氯甲烷、甲醇、二異丙基乙基胺混合溶液或體積 比為9:1的甲醇、二異丙基乙基胺混合溶液； 所述脫除試劑包括六氫吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合液，二者體積比為1:2? 10 ;所述脫除試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用量比為5?15ml/g ;所述脫除試劑的反應溫 度為0?45°C，時間為10?60min ; 所述接肽試劑為9-芴甲氧羰基保護的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲 基-2-批咯烷酮或N，N-二甲基甲酰胺的全溶物；所述接肽試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用 量比為5?15ml/g ;所述接肽試劑接肽反應溫度為10?45°C，時間為0. 5?3h。
3. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，步驟3中，所述稀酸或弱酸溶液包括三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液、三氟乙醇和二 氯甲烷混合溶液、乙酸和甲醇和二氯甲烷混合溶液中的一種；所述稀酸或弱酸溶液與肽樹 脂的用量比為6?20ml/g; 所述中和稀酸或弱酸溶液用的2, 4, 6-三甲基吡啶或二異丙基乙基胺與稀酸或弱酸的 摩爾比為1?2. 5 ; 所述醇類包括甲醇、乙醇或異丙醇；所述醚類包括乙醚、甲基叔丁基醚或石油醚；所述 烷類包括正己烷或正庚烷。
4. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其 特征在于，步驟5中，所述接肽試劑為9-芴甲氧羰基保護的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基 胺的N-甲基-2-吡咯烷酮或N，N-二甲基甲酰胺的全溶物；所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù) 為溶脹樹脂溶液中樹脂的2. 25?7. 5倍；所述接肽試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用量比為 5?15ml/g ;接肽反應溫度為10?45°C，時間為0. 5?3h ; 所述9-芴甲氧羰基保護的氨基酸的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的1?3倍； 所述縮合劑包括2-(1H-苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、0-(7-氮雜 苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、2-(1H-苯并三唑-H-1，1，3, 3-四甲基 脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中的一種；所述縮合試劑的摩 爾量是溶脹樹脂溶液中樹脂的1?5倍； 所述脫除試劑包括六氫吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合液，二者體積比為1:2? 10 ;所述脫除試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用量比為5?15ml/g ;所述脫除試劑的反應溫 度為0?45°C，時間為10?60min。
5. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，步驟6中，所述溶脹劑包括二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮中 的一種或幾種混合物； 所述氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No: 3、氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No:4、氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No: 5的摩爾數(shù)均為肽樹脂的1?1. 5倍； 所述縮合劑包括二異丙基碳二亞胺和1-羥基-IH苯并三唑、二異丙基碳二亞胺和 1-羥基-7-氮雜-IH-苯并三唑中的一個組合，或2- (1H-苯并三唑-H -1，1，3, 3-四甲基 脲鐵六氟磷酸鹽、〇-(7-氮雜苯并二唑_1-)_1，1，3, 3-四甲基脲鐵六氟磷酸鹽、2-(1H-苯并 三唑-H-1，1，3, 3-四甲基脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中 的一種；所述縮合劑的摩爾量是肽樹脂的1?5倍； 所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù)為肽樹脂的1. 5?7. 5倍。
6. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，步驟7中，所述T輔助細胞表位的摩爾數(shù)為全保護肽樹脂的I. 0?2. 0倍； 所述縮合劑包括二異丙基碳二亞胺和1-羥基-IH苯并三唑、二異丙基碳二亞胺和 1-羥基-7-氮雜-IH-苯并三唑中的一個組合；所述縮合劑的摩爾量是全保護肽樹脂的1? 5倍。
7. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，步驟8中，所述切斷液為三氟乙酸、三異丙基硅烷、苯酚和水質量比為90:5:4:1的 混合物；所述切斷液與抗原肽2800樹脂的用量比為5?50ml/g。
8. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，步驟9中，二甲亞砜水溶液中二甲亞砜的體積分數(shù)為5?15% ; 所述調節(jié)PH用氨水、乙酸；所述氨水溶液的濃度為0. 5?5% ;所述乙酸溶液濃度為0? 5 ?5%。
9. 根據(jù)權利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2800的方法，其特 征在于，所述方法還包括使用強堿性陰離子交換樹脂對環(huán)化抗原肽2800進行脫鹽處理；使 用正切向流超濾系統(tǒng)在適宜溫度下對環(huán)化多肽進行超濾；高效液相測得合成肽抗原2800 的純度。
【文檔編號】C07K19/00GK104311673SQ201410568332
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權日:2014年10月22日
【發(fā)明者】姬明放, 張震 申請人:申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）有限公司