一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白特異性IgY的制備方法，包括以下步驟：(1)根據(jù)BVDV-E2基因序列，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因，連接至pMD18T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序，對測序結(jié)果分析；(2)E2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化；(3)抗E2-IgY抗體的制備：純化的E2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000沉淀法提取特異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，ELISA效價監(jiān)測，Western blotting特異性分析。本發(fā)明提取的抗E2-IgY抗體可較好地結(jié)合E2蛋白，而與降解片段無交叉反應(yīng)。
【專利說明】一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種特異性IgY的制備和應(yīng)用，具體涉及一種抗 牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛病毒性腹瀉?。˙ovine viral diarrhea, BVD)，又稱牛病毒性腹瀉.粘膜病 (Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的多種臨床癥狀如高熱、白細(xì)胞減少、沉郁、下痢、大 量流涎、減奶以至停奶、反芻停止、結(jié)膜炎、口腔粘膜出血并出現(xiàn)潰瘍癥狀等的一種疾病。孕 ?？赡芰鳟a(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等。還可引起牛的免疫耐受與持續(xù)性感染，免疫抑制。
[0003] 該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給世界各國畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，每年死 于此感染的牛不少于500萬頭，同時由于其持續(xù)感染等造成的間接損失也嚴(yán)重阻礙了畜牧 業(yè)的發(fā)展。
[0004] 目前國內(nèi)外主要的檢測方法有：
[0005] PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速高效等特點，已廣泛用于多個領(lǐng)域。近幾年 來，又有新的發(fā)展。RT-PCR可以敏感快速地從組織、排泄物、血清、細(xì)胞培養(yǎng)物等檢出BVDV 而且可以區(qū)分豬瘟和羊邊界病毒，利用該方法還可以進(jìn)行BVDV核酸序列的研究。
[0006] 病毒分離技術(shù)是一種最基本、最準(zhǔn)確的檢測方法。常用來分離BVDV用的細(xì)胞是牛 鼻氣管細(xì)胞（BT)和牛腎細(xì)胞傳代細(xì)胞株（MDBK)。
[0007] 電鏡技術(shù)成為病毒學(xué)研究、快速診斷不可或缺的手段。這種方法快捷、方便、直觀。 然而電鏡觀察需要高含量的病毒粒子，需要對病毒進(jìn)行濃縮。
[0008] 抗體的檢測可以為免疫接種程序的制定和臨床診斷提供依據(jù)。相比其它抗體檢測 方法，膠體金試紙條和ELISA試劑盒操作簡便，價格低廉，在臨床上被廣泛應(yīng)用，膠體金試 紙條和傳統(tǒng)的HI相比，其敏感性和特異性達(dá)到97. 1 %，76. 6%，而ELISA試劑盒陽性檢出率 達(dá)到85 %，和HI符合率達(dá)到80 %。
[0009] IgY技術(shù)，即通過對禽類（雞）免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗 體。相對于哺乳動物抗體，IgY技術(shù)避免了常規(guī)的動物采血，滿足動物福利要求，且抗體產(chǎn)量 大，制備相對簡單，經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢明顯，更為重要的是，IgY還具有一系列生物學(xué)與抗體特性與優(yōu) 勢。近年來，IgY抗體在醫(yī)藥、生物【技術(shù)領(lǐng)域】都呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭。IgY已廣泛應(yīng)用于 細(xì)菌、病毒等病原體檢測，特異性、敏感性較好，同時能夠降低BVDV治療成本和基于IgY檢 測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2 特異性IgY的制備方法，以便用于BVDV病毒的檢測與治療。
[0011] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] -種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法，其特征在于，所述方法 包括以下步驟：
[0013] (1)牛病毒性腹瀉病毒E2基因的克隆與序列分析：根據(jù)BVDV-E2基因序列，利用 primer prime 5.0 軟件，設(shè)計一對引物，PCR 擴(kuò)增 BVDV-E2 基因（1040bp)，連接至 pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序。
[0014] (2)E2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-E2和pET-32a載體使用BamH I 和Xho I雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-E2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21(DE3)pLysS感受 態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu) 建成功pET-32a-E2表達(dá)載體，重組E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形 式存在，43ku附近出現(xiàn)片段，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后。Western blot表明重組蛋白具有 良好的反應(yīng)原性。
[0015] (3)抗E2-IgY抗體的制備。純化的E2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異 性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫后抗E2-IgY抗體效價，Western blot鑒定所獲抗E2-IgY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈 (65ku)和輕鏈（19ku);四免后，抗E2-IgY效價達(dá)到I : 128000，Western blot表明，所制 備IgY抗體可特異性結(jié)合E2蛋白。
[0016] 所述制備免疫蛋方法如下：向20周齡禽類進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為 300 ii g/只,初次免疫21天之后,進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫,間隔時間為21天,免疫劑量為250 ii g/ 只，所屬禽類為雞。
[0017] 所述提取IgY的方法如下；
[0018] (1)將所述收集的蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS (pH 7. 4)按 照體積比1:2進(jìn)行稀釋；
[0019] (2)向稀釋液加入質(zhì)量體積比為3. 5%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30 分鐘；
[0020] (3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質(zhì)量體積比為8. 5%的PEG-6000,充 分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘；
[0021] (4)將經(jīng)過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入 質(zhì)量體積比為12%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘，再進(jìn)行離心，獲得沉淀 物；
[0022] (5)將所述沉淀物使用1. 2毫升PBS溶解后，使用透析帶進(jìn)行透析，使用PBS透析 過夜，獲得IgY，并保存在_20°C備用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] (1)本發(fā)明的方法提取的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性；
[0025] (2)本發(fā)明提取的抗E2_IgY抗體可較好地結(jié)合E2蛋白，而與降解片段無交叉反 應(yīng)；
[0026] (3)提取方法相對簡單，抗體產(chǎn)量大，制備成本低。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)說明。
[0028] -種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0029] (1)牛病毒性腹瀉病毒E2基因的克隆與序列分析。根據(jù)GenBank報道的有關(guān) BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5. 0軟件，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因 (KMObp)，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切 分析，陽性質(zhì)粒測序。
[0030] (2)E2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-E2和pET-32a載體使用BamHI 和XhoI雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-E2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受 態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu) 建成功pET-32a-E2表達(dá)載體，重組E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形 式存在，在43ku附近出現(xiàn)片段。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后，Western blot表明重組蛋白具 有良好的反應(yīng)原性。
[0031] (3)抗E2-IgY抗體的制備。純化的E2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異 性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫后抗E2-IgY抗體效價，Western blot鑒定所獲抗E2-IgY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈 (65ku)和輕鏈（19ku);四免后，抗E2-IgY效價達(dá)到I : 128000，Western blot表明，所制 備IgY抗體可特異性結(jié)合E2蛋白。
[0032] 實施例
[0033] 本實施例擬對BVDV-E2結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a_E2,表達(dá) 和純化E2蛋白，并將其作為免疫原，免疫產(chǎn)蛋雞，生產(chǎn)抗E2重組蛋白特異性IgY抗體。 [0034] 1、引物設(shè)計與合成
[0035] 根據(jù)GenBank登記的牛病毒性腹瀉病毒參考株（FJ011098)序列，使用軟件 Primer Prime 5.0設(shè)計一對引物，用于擴(kuò)增E2基因全長DNA序列（11040bp)。上游引 物P : 5，-ATGGATCCAATATAGACTCGGCG-3，（下劃線處為BamH I酶切位點），下游引物R : 5, -CCGCTCGAGACCATGGTATGTCTA-3,(下劃線處為Xho I酶切位點）。引物由上海生工公司 合成，雙蒸水稀釋為lOpmol/y L，-20°C保存。
[0036] 2、E2基因的PCR擴(kuò)增
[0037] 模板制備：取病毒上清50ii L，沸水煮IOmin后，12000rpm離心lOmin，取上清。
[0038] PCR反應(yīng)體系如下：
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白特異性IgY的制備方法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 牛病毒性腹瀉病毒E2基因的克隆與序列分析：根據(jù)BVDV-E2基因序列，利用軟件 設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因，連接至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán) 白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比較分析； (2) E2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化：pMD18T和pET-32a載體使用BamH I和Xho I 雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-E2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌，酶 切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni+親和層析柱對重 組蛋白進(jìn)行純化； (3) 抗E2-IgY抗體的制備：純化的E2蛋白免疫白色來杭產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特 異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法，其 特征在于：步驟（1)中根據(jù)GenBank報道的有關(guān)BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5. 0 軟件，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因，為1040bp，連接至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化DH5 a感 受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法，其 特征在于：步驟（2)中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析后使用Ni+親和層析柱 對重組蛋白進(jìn)行純化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白特異性IgY的制備方法，其 特征在于：步驟（3)中，對提取特異性IgY抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，間接ELISA測定免疫后 抗E2-IgY抗體效價，Western blotting鑒定所獲抗E2-IgY的特異性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法， 其特征在于：所述制備免疫蛋方法如下：向20周齡禽類進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為 200?800 ii g/只，初次免疫21天之后，進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為 200 ?800 ii g/ 只。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白特異性IgY的制備方法，其 特征在于：所述禽類為雞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白特異性IgY的制備方法，其 特征在于：所述步驟（3)中提取IgY的方法如下； (1) 將所述收集的蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS按照體積比 1 : 1. 5?2. 5進(jìn)行稀釋； (2) 向稀釋液加入質(zhì)量體積比為2. 5?5%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢瑁瑩u床上室溫作用 20?30分鐘； (3) 將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質(zhì)量體積比為6?9%的PEG-6000,充分 攪拌，搖床上室溫作用20?30分鐘； (4) 將經(jīng)過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質(zhì)量 體積比為10?13%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用20?30分鐘，再進(jìn)行離心，獲 得沉淀物； (5) 將所述沉淀物使用1. 2?1. 5毫升PBS溶解后，使用透析帶進(jìn)行透析，使用PBS透 析過夜，獲得IgY，并保存在-20°C備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法，其 特征在于：所述PBS的pH值為7. 2?7. 5。
【文檔編號】C07K16/02GK104356232SQ201410603881
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】張小鶯, 王媛, 任昊, 江雪梅 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)